基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討復(fù)方刺梨合劑抗胃癌作用機(jī)制及實(shí)驗(yàn)研究

蔣正立 朱 萍 任 宇 戴淑萍 陳 靜

胃癌是一種常見消化系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率僅次于肺癌、乳腺癌、腸癌和前列腺癌，而死亡率在所有癌癥死因中排第3 位，嚴(yán)重危害人類健康[1]。大量研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)中醫(yī)藥在胃癌治療方面效果明顯，從中草藥中尋找抗癌藥物的各類研究一直受到人們的廣泛重視。復(fù)方刺梨合劑是浙江省臺州醫(yī)院院內(nèi)制劑，由刺梨與蒼術(shù)組成，具有健脾燥濕、消食和胃之功效，對食積不化、胃脘脹滿、泄瀉等具有明確療效。復(fù)方刺梨合劑抗胃癌作用尚未見報(bào)道，而前期文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，刺梨與蒼術(shù)均對胃部腫瘤細(xì)胞有抑制作用[2-6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究具有整體性和系統(tǒng)性，與中醫(yī)藥的辨證論治原則、整體觀念相合，可用于發(fā)現(xiàn)復(fù)雜中藥中的活性成分，進(jìn)而識別靶標(biāo)和預(yù)測適應(yīng)證[7-9]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，預(yù)測和分析復(fù)方刺梨合劑抗胃癌藥理作用機(jī)制，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證，為深入研究其胃癌治療作用提供參考。

1 材料與方法

1.1儀器 化學(xué)發(fā)光/熒光成像分析儀（Image-Quant，LAS500 北京盛科信德），電泳儀（1658033，美國賽默飛），半干轉(zhuǎn)印槽（1703940，北京龍躍），高速冷凍離心機(jī)（AllegraX-15，美國貝爾曼）。

1.2藥物及試劑 復(fù)方刺梨合劑（浙江省臺州醫(yī)院制劑室，201026），組織細(xì)胞總蛋白抽提試劑盒（杭州達(dá)文生物，P1250-50），預(yù)染蛋白（杭州達(dá)文生物，P1101），麗春紅（杭州達(dá)文生物，P1503），1M Tris-HCl，pH6.8（杭州達(dá)文生物，B1002），pH8.0（杭州達(dá)文生物，B1011），ECL Plus 超敏發(fā)光液（杭州達(dá)文生物，P1052），封閉專用脫脂牛奶（杭州達(dá)文生物，P1622），Tween-20（上海生工生物工程，C500623），SDS（上海生工生物工程，A100227），Glycine（上海生工生物工程，A110167），SAGE 配膠試劑盒（杭州達(dá)文生物，AP014），5X loading buffer（杭州達(dá)文生物，B1034-5），Bcl-2 抗體（杭州達(dá)文生物，C1342），p53抗體（杭州達(dá)文生物，C1831），HRP-抗兔二抗（杭州達(dá)文生物，C2252），磷酸鹽緩沖液（PBS），胃癌細(xì)胞株SGC-7901（中國科學(xué)院）。

1.3方 法1.3.1 活性成分篩選 以“刺梨”與“蒼術(shù)”為主題詞，從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）（http∶//tcmspw.com/index.php）中尋找與這2 味中藥相關(guān)的所有化學(xué)成分及對應(yīng)靶點(diǎn)，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為化合物分子篩選條件，通過條件篩選，即為候選活性成分。

1.3.2活性成分-靶點(diǎn)篩選 基于TCMSP 查找活性成分靶點(diǎn)，同時登陸SwissTarget Prediction http∶//www.swisstargetprediction.ch/）服務(wù)器，上傳復(fù)方刺梨合劑活性成分Sdf-mol 格式文件，采用反向藥效團(tuán)匹配方法，設(shè)置可能性Probability＞0，得到虛擬活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)。

1.3.3抗胃癌作用靶點(diǎn)篩選及PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 以“gastric cancer”等關(guān)鍵詞搜索比較毒物遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫（CTD）（http∶//ctdbase.org/）和在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）（http∶//www.omim.org/）中已報(bào)道的胃癌相關(guān)靶點(diǎn)，選擇既是活性成分靶標(biāo)又是胃癌靶標(biāo)的蛋白進(jìn)行分析，篩選靶標(biāo)。通過Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。將復(fù)方刺梨合劑抗胃癌治療的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫平臺（https∶//string-db.org/），選擇物種為人類，獲取蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，繪制蛋白關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.3.4GO 功能和KEGG 通路分析 采用WebGestalt（http∶//www.webgestalt.org/option.php）和DAVID 數(shù)據(jù)庫（https∶//david.ncifcrf.gov/）對預(yù)測治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析和KEGG 通路分析。

1.3.5實(shí)驗(yàn)研究 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，采用Western blot 法測定p53、Bcl-2 蛋白表達(dá)。取人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，接種于10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將細(xì)胞分為對照組及實(shí)驗(yàn)組（濃度分別為80、120、160、240、320μg/mL）。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL，接種于6 孔板中，每孔2mL。按分組濃度添加含藥培養(yǎng)基，每組設(shè)3 個復(fù)孔，于37℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)48 和72h。用0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，并用預(yù)冷PBS 洗滌2 次。用1mL RIPA 裂解液于冰上提取蛋白，以12000r/min 離心15min，取上清液。蛋白質(zhì)濃度測定后，以40μg/孔的上樣量進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂牛奶封閉2h。TBST 溶液洗滌PVDF 膜3 遍后，于4℃條件下孵育p53 及Bcl-2 抗體搖動過夜，洗脫一抗后孵育二抗，于避光條件下采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）分析系統(tǒng)顯影，并用ImageJ 軟件計(jì)算分析條帶灰度值。

1.3.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用One-way ANOVA 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1活性成分 以“蒼術(shù)”為關(guān)鍵詞，從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中得到蒼術(shù)活性成分49 個化學(xué)成分，根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18 進(jìn)行篩選，得到4 個活性成分，分別是NSC63551、谷甾醇-3-O-葡萄糖苷、漢黃芩素、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮。而TCMSP 數(shù)據(jù)庫中并未收錄刺梨，通過文獻(xiàn)檢索相關(guān)成分，包括黃酮、超氧化物歧化酶（SOD）、維生素C、三萜以及多糖等活性成分，進(jìn)一步將其成分通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18 進(jìn)行篩選得到3 個活性成分（槲皮素、山奈酚、木犀草素）。此外，維生素C、蘆丁和刺梨苷雖然不滿足OB≥30%或DL≥0.18，但含量較高，同時文獻(xiàn)研究表明，蘆丁具有抗胃癌SGC-7901 細(xì)胞作用[10-11]，維生素C 也具有抗胃癌作用[12]，因此納入活性成分，最后通過篩選共得到活性化合物10個，其中蒼術(shù)4 個，刺梨6 個，具體見表1。

表1 復(fù)方刺梨合劑篩選后得到10 個活性成分

2.2活性成分-靶點(diǎn) 篩選相關(guān)作用靶點(diǎn)，通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https∶//www.uniprot.org/）的Uniprot ID對應(yīng)至基因，共得到人源靶點(diǎn)基因236 個。

2.3復(fù)方刺梨合劑治療胃癌作用靶點(diǎn)篩選及PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 以“gastric cancer”等關(guān)鍵詞搜索CTD 和OMIM 數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的與胃癌相關(guān)的靶點(diǎn)，共得到440 個胃癌相關(guān)靶點(diǎn)，選擇既是成分靶標(biāo)又是胃癌靶標(biāo)的蛋白進(jìn)行分析，共篩選到38 個靶標(biāo)。通過Cytoscape3.7.1 軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（見圖1），該網(wǎng)絡(luò)包含2 種藥物、1 種疾病、8 個活性成分、38 個靶點(diǎn)，連接度為前3 的潛在活性分子為quercetin、luteolin、kaempferol，關(guān)鍵靶點(diǎn)包括p53、Bcl-2、PIK3CA、Caspase8、CDK4 等。以上成分及靶點(diǎn)是復(fù)方刺梨合劑抗胃癌治療的重要成分及重要靶點(diǎn)，對復(fù)方刺梨合劑治療胃癌有重要意義。將38 個潛在的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫平臺，繪制蛋白關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（見圖2），該網(wǎng)絡(luò)圖共包括38 個節(jié)點(diǎn)，397 條邊。其中綜合數(shù)值評分＞0.995 的相互作用蛋白有CDK4-CCND1、CDKN1A-CDK4、BCL2L1-TP53、CDKN2A-CDK4、CDKN1A-CCND1、CDKN1A-TP53、MAPK8 -JUN、CASP8 -BCL2L1、PLAU -SERPINE1、CHEK2-TP53 等，這些蛋白之間的相互作用在網(wǎng)絡(luò)中具有重要地位，靶點(diǎn)基因在復(fù)方刺梨合劑抗胃癌治療中具有重要意義，可作為復(fù)方刺梨合劑有效成分作用的靶點(diǎn)基因。

圖1 復(fù)方刺梨合劑藥物、活性成分與胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖2 蛋白質(zhì)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

2.4GO 功能和KEGG 通路分析 采用WebGestalt和DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路分析。如圖3 所示，GO 功能分析顯示顯著功能有：對刺激反應(yīng)（38/38）、生物調(diào)節(jié)（38/38）、細(xì)胞傳遞（36/38）、核（28/38）、胞質(zhì)溶膠（25/38）、膜封閉腔（25/38）等。KEGG 通路富集結(jié)果顯示，38 個靶點(diǎn)參與63 條顯著KEGG 通路（根據(jù)Benjamini 校正法、PValue＜0.01），包括關(guān)鍵基因靶點(diǎn)主要富集的通路為HIF-1 信號通路、p53 信號通路、TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路等。且與胰腺癌、膀胱癌、大腸癌、子宮內(nèi)膜癌、小細(xì)胞肺癌等腫瘤密切相關(guān)，表明復(fù)方刺梨合劑的活性成分靶點(diǎn)分布于不同的通路，可通過各通路協(xié)調(diào)發(fā)揮抗癌作用。同時復(fù)方刺梨合劑的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因富集于多種癌癥通路上，提示此類型的癌癥可作為未來研究復(fù)方刺梨合劑對抗癌療效的重要方向。

圖3 GO 功能分析結(jié)果

2.5實(shí)驗(yàn)研究 與對照組（0.28±0.02）比較，80μg/mL復(fù)方刺梨合劑處理48h 后，人胃癌細(xì)胞SGC-7901中p53 蛋白相對β-actin 表達(dá)量為（0.38±0.03，P=0.060），160μg/mL 和320μg/mL 復(fù)方刺梨合劑處理48h 后，p53 蛋白相對β-actin 表達(dá)量分別為（0.60±0.05，P=0.011）和（0.47±0.01，P=0.005）。與對照組（0.09±0.01）比較，80μg/mL 復(fù)方刺梨合劑處理48h后Bcl-2 相對β-actin 表達(dá)為（0.13±0.00，P=0.005），160μg/mL 和320μg/mL 復(fù)方刺梨合劑處理組的Bcl-2 相對β-actin 表達(dá)量分別為（0.10±0.01，P=0.771）和（0.11±0.01，P=0.127）。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（見圖4），復(fù)方刺梨合劑使用后，p53 和Bcl-2 蛋白表達(dá)增加，且p53 相對β-actin 表達(dá)隨著復(fù)方刺梨合劑濃度的增加而增加。

圖4 p53 和Bcl-2 蛋白表達(dá)

3 討論

復(fù)方刺梨合劑作為醫(yī)院制劑，由刺梨與蒼術(shù)組成，該配伍利用刺梨味甘性涼，結(jié)合蒼術(shù)味辛性溫之性味，發(fā)揮其燥濕健脾、祛風(fēng)散寒之功效。目前對其研究也局限于制劑質(zhì)量控制方面[13-14]，而關(guān)于其藥理作用研究報(bào)道較少。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)篩選了10 個復(fù)方刺梨合劑的活性化學(xué)成分，得到236 個化合物靶點(diǎn)，蒼術(shù)活性化學(xué)成分中漢黃芩素活性最高，作用于45 個靶點(diǎn)，刺梨活性化學(xué)成分中以槲皮素最高，作用于154 個靶點(diǎn)。通過CTD和OMIM 數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的與胃癌相關(guān)的靶點(diǎn)，共得到440 個胃癌相關(guān)靶點(diǎn)，對蛋白進(jìn)行分析，共得到38 個靶標(biāo)，關(guān)鍵靶點(diǎn)包括p53、Bcl-2、PIK3CA、Caspase8、CDK4 等。在本研究中，采用WebGestalt 和DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路分析，篩選出HIF-1、p53、TNF、PI3K-Akt 等信號通路，表明復(fù)方刺梨合劑可通過調(diào)控各通路發(fā)揮抗癌作用?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果，p53 和Bcl-2 為復(fù)方刺梨合劑抗胃癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。p53 基因是目前研究最深入、最廣泛的腫瘤抑制基因之一，由11 個外顯子和10個內(nèi)含子組成，是一種負(fù)調(diào)節(jié)因子，其失活對腫瘤形成起重要作用，在臨床中具有重要意義[15]。Bcl-2 基因?yàn)榈蛲鲆种苹?，可通過阻礙細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、延長細(xì)胞壽命來增加腫瘤的發(fā)生，并促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[16]。不少學(xué)者研究表明，p53 在胃癌組織中高表達(dá)，與胃癌腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、胃癌TNM 分期等密切相關(guān)，其異常表達(dá)表明p53 與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等有關(guān)[17-18]。多項(xiàng)研究顯示，胃癌中Bcl-2 蛋白高表達(dá)參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展[19-20]。因此，本研究采用Western blot 方法對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明，復(fù)方刺梨合劑可上調(diào)人胃癌細(xì)胞SGC-7901 中p53 和Bcl-2 蛋白表達(dá)。

綜上所述，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及實(shí)驗(yàn)研究，揭示了復(fù)方刺梨合劑抗胃癌作用是多成分、多靶點(diǎn)、多通路的結(jié)果，可能通過調(diào)控p53 和Bcl-2 蛋白的表達(dá)發(fā)揮作用，為下一步深入研究其作用機(jī)制提供了思路。