大林姬鼠和黑線姬鼠腸道菌群的比較與分析

張春鳳 蘇航 周思宇 楊文建 于成文 金志民

摘??? 要：為了探究大林姬鼠和黑線姬鼠腸道微生物的組成及是否有顯著差異，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)10只大林姬鼠和10只黑線姬鼠的腸道菌群的組成進(jìn)行了初步分析，并比較兩組之間腸道菌群的差異。結(jié)果表明，兩種鼠的腸道菌群在門水平上以厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門為主。在屬水平上，大林姬鼠的優(yōu)勢(shì)菌屬為unidentified-Muribaculace、unidentified- Lachnospiraceae、螺桿菌屬，黑線姬鼠的優(yōu)勢(shì)菌屬為unidentified-Lachnospiraceae、unidentified-Muribaculace、乳桿菌屬。Anosim分析結(jié)果表明，大林姬鼠與黑線姬鼠腸道菌群的組間差異大于組內(nèi)差異，且兩組間腸道菌群差異極顯著（P<0.01）。本研究結(jié)果為防治農(nóng)林有害微生物和有效評(píng)估鼠類疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)提供基礎(chǔ)微生物數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：大林姬鼠;黑線姬鼠;腸道菌群;16S rDNA;高通量測(cè)序

中圖分類號(hào)：Q95???????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A????????? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2022.03.003

Comparison and Analysis of the Intestinal Flora of Apodemus peninsulae and Apodemus agrarius

ZHANG Chunfeng1，SU Hang2，ZHOU Siyu2，YANG Wenjian2， YU Chengwen2，JIN Zhimin2

（1.Heilongjiang Agricultural Economy Professional College，Mudanjiang，Heilongjiang 157041，China;2. School of Life Science and Technology，Mudanjiang Normal University，Mudanjiang，Heilongjiang 157011，China）

Abstract： To investigate the composition of intestinal microorganisms of Apodemus peninsulae and Apodemus agrarius and whether there is significant difference，the composition of intestinal flora of 10 A. peninsulae and 10 A. agrarius was preliminarily analyzed by high-throughput sequencing technique， and the difference of intestinal flora between the two groups was compared. The results showed that， at the phylum level， the intestinal flora of the two species of rats was dominated by Firmicutes， Bacteroidetes and Proteobacteria. At genus level， the dominant genus of A. peninsulae was unidentified-Muribaculace、unidentified-Lachnospiraceae、Helicobacter， the dominant genus of A. agrarius is unidentified-Lachnospiraceae、unidentified-Muribaculace、Lactobacillus. The results of Anosim analysis showed that the inter-group differences in intestinal flora of A. peninsulae and A. agrarius were greater than the intra-group differences， and the differences in intestinal flora between the two groups were extremely significant （P<0.01）. The results of this study will provide basic microbial data for controlling harmful microorganisms in agriculture and forestry and effectively assessing the risk of rodent-borne disease transmission.

Key words： Apodemus peninsulae; Apodemus agrarius; intestinal flora; 16S rDNA; high-throughput sequencing

大林姬鼠（Apodemus peninsulae）和黑線姬鼠（Apodemus agrarius）同屬哺乳綱（Mammalia），嚙齒目（Rodentia），鼠科（Muridae），姬鼠屬（Apodemus），分類地位較為相近[1]。二者是我國農(nóng)林地區(qū)的優(yōu)勢(shì)鼠種，形態(tài)外觀相似，黑線姬鼠在體背面通常有一條顯著的黑色縱紋，在取食傾向與棲息地選擇上也有較大重疊[2-3]。目前，關(guān)于兩種鼠在生態(tài)以及生理生化方面研究較多[4-6]，但關(guān)于兩種鼠腸道菌群的組成及二者的差異報(bào)道還尚不充足。

微生物遍布在各種環(huán)境中，包括動(dòng)物體表和體內(nèi)，它們與其宿主互惠互利，密不可分，這種內(nèi)在關(guān)聯(lián)在動(dòng)物腸道中表現(xiàn)的最為明顯[7]。腸道微生物可以參與宿主的多種代謝途徑，也被認(rèn)為是另外的一種代謝器官，類似于肝臟[8]。腸道菌群是腸道微生物中的占比最大的組成部分，對(duì)宿主的生長(zhǎng)和發(fā)育等許多方面起著重要作用，是宿主動(dòng)物生存和適應(yīng)環(huán)境的關(guān)鍵[9-11]。本文通過高通量測(cè)序技術(shù)研究大林姬鼠和黑線姬鼠腸道菌群的物種組成并對(duì)菌群功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)兩種鼠的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，為探究影響腸道菌群組成的因素提供基礎(chǔ)的微生物學(xué)數(shù)據(jù)，對(duì)有效防治農(nóng)林有害微生物和評(píng)估鼠類疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)有重要參考價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集與保存

采用籠捕法，在黑龍江省牡丹江市橫道河子國家自然保護(hù)區(qū)（海拔460～600 m， 44°44′～44°55′ N，129°06′～129°15′ E）內(nèi)獲得樣本。選擇健康成年大林姬鼠和黑線姬鼠各10只，雌雄各半，進(jìn)行編號(hào)，如表1所示。在實(shí)驗(yàn)室無菌條件下，將鼠脫頸處死，并進(jìn)行解剖，取出鼠的盲腸立即放入裝有液氮的研缽中速凍，裝入無菌凍存管，標(biāo)記好放入-80 ℃冰箱。

1.2 樣本總DNA的提取

采用CTAB/SDS方法，對(duì)兩種鼠的腸道組織進(jìn)行總DNA的提取。經(jīng)過1.8%瓊脂糖凝膠電泳20 min檢測(cè)有明亮條帶為提取成功。在每個(gè)樣本的通用引物兩端加上不同的barcode。使用通用引物515 F～806 R（515 F：5′GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′，806 R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對(duì)16S rDNA 基因V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件如下：95 ℃（預(yù)變性）5 min;95 ℃（變性）30 s，50 ℃（退火）30 s，72 ℃（延伸）60 s，循環(huán)20次;72 ℃（延伸）5 min;將純化產(chǎn)物送至北京百邁克生物科技有限公司用HiSeq2500PE 250平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

獲得所有樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)后，首先去除引物接頭序列，再通過重疊部分對(duì)每個(gè)樣品的讀取片段進(jìn)行拼接，得到原始數(shù)據(jù)。使用Trimmomatic V 0.33對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行篩除，獲得高質(zhì)量的標(biāo)簽數(shù)據(jù)。使用 UCHIME v 4.2 軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)。與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比并將物種進(jìn)行分類分析，繪制出樣品在門水平與屬水平下的群落結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中有效序列和OTU數(shù)目

本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)大林姬鼠和黑線姬鼠的盲腸樣本進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。共獲得有效序列1 231 633條，其中大林姬鼠獲得有效序列633 165條，黑線姬鼠獲得598 468條有效序列?；谙嗨贫?97%的原則將獲得的有效tags序列進(jìn)行聚類，共獲得965個(gè)OTUs。韋恩圖中重疊部分為所有樣品共有的OTU數(shù)目，由圖1可知20個(gè)樣品中共有861個(gè)OTUs。

2.2 Alpha多樣性分析

本研究通過對(duì)20份樣品的Alpha多樣性分析指數(shù)進(jìn)行豐富度和多樣性比較。本次樣品文庫的覆蓋率 （coverage 指數(shù)）至少都在 99. 8% 以上，說明本次測(cè)序深度可以代表樣品的真實(shí)情況。從圖2可以看出，隨著測(cè)試深度的不斷加深，稀釋曲線從不斷上升，直至趨于平緩，說明樣品的測(cè)序深度比較合理。

使用SPSS19.0軟件對(duì)大林姬鼠組和黑線姬鼠組的Alpha 多樣性指數(shù)進(jìn)行差異性分析，結(jié)果如表2所示，兩組的Ace、Chao1、Shannon、Simpson 4個(gè)指數(shù)均差異不顯著（P>0.05），說明兩種鼠腸道菌群的物種豐富度無顯著差異。

2.3 物種分類分析

2.3.1 門水平菌群組成差異 由圖3可知，在門水平上，大林姬鼠含量最高的5個(gè)菌門分別為厚壁菌門 （ Firmicutes ）占48.82% 、擬桿菌門（ Bacteroidetes）占28.85%、變形菌門（ Proteobacteria）占12.30%、Epsilonbacteraeota占6.99%、脫鐵桿菌門（Deferri-

bacteres）占1.79%。黑線姬鼠含量最高的5個(gè)菌門分別為厚壁菌門（Firmicutes）占52.07% 、擬桿菌門（Bacteroidetes）占22.65%、變形菌門（Proteobacteria）占14.34%、Epsilonbacteraeota占4.79%、螺旋體門（Spirochaetes）占4.46%。由此可知，大林姬鼠與黑線姬鼠的優(yōu)勢(shì)菌門大致相同。

2.3.2 屬水平菌群組成差異 由圖4可知，在屬水平上，大林姬鼠與黑線姬鼠腸道內(nèi)各菌群存在比例有差異，大林姬鼠腸道內(nèi)占比例最高的5個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬依次為unidentified-Muribaculace占21.86%、unidentified-Lachnospiraceae占18.36%、螺桿菌屬Helicobacter占6.99%、毛螺菌科NK4A136組（Lachnospiraceae-NK4A136-group）占5.66%、假單胞菌屬Pseudomonas占5.52%。黑線姬鼠腸道內(nèi)前5個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬為unidentified-Lachnospiraceae占14.47%、unidentified-Muribaculace占12.87%、乳桿菌屬（Lactobacillus）占7.76%、大腸埃氏菌屬-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）占7.53%、毛螺菌科NK4A136組（Lachnospiraceae-NK4A136-group）占6.72%。

2.4 Anosim分析

Anosim 分析是一種非參數(shù)檢驗(yàn)，基于Bray-Curtis 距離值的秩次進(jìn)行每?jī)山M間差異顯著性檢驗(yàn)，用來判斷組間差異是否大于組內(nèi)差異。R-value 在（-1，1）之間， R-value > 0說明組間差異大于組內(nèi)差異，R-value < 0則相反;P>0.05說明組間差異不顯著，0.01

2.5 功能預(yù)測(cè)

使用PICRUSt軟件通過比對(duì)16S rDNA測(cè)序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息，推測(cè)樣本中的功能基因組成。由圖5可知，大林姬鼠和黑線姬鼠在一功能水平上共注釋到6個(gè)功能，分別為代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing）、細(xì)胞過程（Cellular Processes）、人類疾?。℉uman Diseases）、有機(jī)系統(tǒng)（Organismal Systems）。由圖6可知，在功能水平上共注釋到43個(gè)代謝功能，主要的代謝功能有全局和概述圖（Global and overview maps）、碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代謝（Amino acid metabolism）、膜轉(zhuǎn)運(yùn)能量代謝（Membrane transportEnergy metabolism）、能量代謝（Energy metabolism）等。大林姬鼠和黑線姬鼠在腸道菌群KEGG數(shù)據(jù)庫注釋到的一功能層和二功能層均未發(fā)現(xiàn)顯著差異。

3 結(jié)論與討論

腸道菌群對(duì)宿主的生長(zhǎng)和發(fā)育等許多方面起著重要作用，經(jīng)過長(zhǎng)期進(jìn)化后，與宿主形成相互依賴、相互影響的統(tǒng)一體[12]。本研究采用 16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)來研究大林姬鼠與黑線姬鼠腸道菌群的組成。結(jié)果表明，大林姬鼠與黑線姬鼠均檢測(cè)出11個(gè)菌門，前3個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門均為厚壁菌門，擬桿菌門，變形菌門。厚壁菌門中的主要菌群都是發(fā)酵型細(xì)菌，可以利用碳水化合物生成乳酸，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)直接被宿主腸壁吸收，對(duì)腸道中的多糖也有代謝作用，有利于消化食物中的纖維素和半纖維素[13]。擬桿菌門可以幫助宿主從食物中獲得能量，主要參與碳水化合物的發(fā)酵和分解多糖，細(xì)胞壁成分以及其他復(fù)雜的聚合物。變形菌門在對(duì)木質(zhì)素的消化中起著重要的作用[14]。這一結(jié)果表明，大林姬鼠和黑線姬鼠的腸道菌群可以幫助宿主分解利用植物源食物，二者對(duì)植物源食物有較強(qiáng)的適應(yīng)性。厚壁菌門、擬桿菌門以及變形菌門是嚙齒動(dòng)物腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌門，本試驗(yàn)的研究結(jié)果與其他嚙齒動(dòng)物腸道菌群組成研究結(jié)果大致相同，如甘肅鼢鼠，花鼠等[15-16]。

通過Anosim分析，得出大林姬鼠與黑線姬鼠的腸道菌群差異極顯著。腸道菌群的組成與宿主基因型有關(guān)，Ley等人[17]研究發(fā)現(xiàn)leptin基因突變后的小鼠腸道菌群總數(shù)降低，且厚壁菌門與擬桿菌門的比例明顯改變。Hildebrand等人[18]對(duì)5種大鼠腸道菌群進(jìn)行分析比較發(fā)現(xiàn)相同遺傳背景下的個(gè)體即使在不同環(huán)境中生長(zhǎng)，其腸道菌群也有一定的相似性。除基因型外，腸道菌群的組成還受多種因素的影響，例如食性[19]、飼養(yǎng)方式[20]、年齡[21]、季節(jié)[16]、海拔[22]等。本文采用了同一時(shí)間、同一地點(diǎn)的成年大林姬鼠與黑線姬鼠樣本，排除了季節(jié)、海拔、年齡因素。大林姬鼠與黑線姬鼠菌群差異極顯著除宿主本身基因型不同外，還可能是因?yàn)槎叩闹饕獥⒌匾约笆澄镞x擇不完全相同。大林姬鼠主要分布在闊葉林和針闊混交林中，對(duì)植物莖葉、果實(shí)均有利用;黑線姬鼠在灌叢、農(nóng)田草地、草甸分布較多，以農(nóng)作物種子為主要食物[23]，但具體哪種因素造成二者腸道菌群有顯著差異，還需進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)研究結(jié)果為更深層次探究嚙齒動(dòng)物體攜帶病原菌提供了重要依據(jù)，為農(nóng)林有害微生物的防治以及評(píng)估鼠類傳播疾病風(fēng)險(xiǎn)提供了基礎(chǔ)微生物學(xué)數(shù)據(jù)。

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