Frankia菌—細(xì)枝木麻黃共生體系對土壤Pb污染的響應(yīng)研究

趙佳怡, 熊茂岑, 王鑫, 鐘鏌宇, 王婷, 潘遠(yuǎn)智

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，四川 成都 611130

細(xì)枝木麻黃（Casuarina cunninghamiana）屬于木麻黃科（Casuarinaceae）木麻黃屬常綠喬木，具有耐干旱、耐瘠薄、抗鹽堿生物固氮等特性[1]。隨著不斷深入研究，木麻黃屬植物已經(jīng)運用在固氮改土、鹽堿地植被恢復(fù)和建立農(nóng)林復(fù)合系統(tǒng)等方面[2]。有研究表明木麻黃對鉛的耐受濃度可達(dá)1800 mg·kg-1[3]。經(jīng)本課題組預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)細(xì)枝木麻黃在600 mg·kg-1鉛處理下受到脅迫但不致死。

Frankia菌作為放線菌中的一個屬，可以與非豆科植物共生結(jié)瘤[4]。作為木麻黃屬植物重要的共生菌，F(xiàn)rankia菌在固定氮素、培肥地力、提高植物生長勢和土壤生態(tài)修復(fù)等方面有著獨特優(yōu)勢，目前已有研究表明木麻黃屬植物和Frankia菌之間的生物組合與木麻黃屬植物的固氮量密切相關(guān)[5]。另有研究表明Frankia菌株體內(nèi)具有結(jié)合重金屬的蛋白質(zhì)，因此具有積累Pb等重金屬的特性[6-9]。

鉛（Pb）毒性強、持久，殘留在土壤中可嚴(yán)重危害動植物生長。研究表明，隨著Pb進(jìn)入土壤，土壤中的酶活性、土壤微生物生物量碳和微生物活性等都能受到一定抑制，土壤的理化性狀受到一定程度的影響[10]。近些年，我國重金屬污染土壤修復(fù)技術(shù)發(fā)展迅速，不斷創(chuàng)新，常見的例如：隔離包埋技術(shù)，固化穩(wěn)定技術(shù)，氧化還原技術(shù)，微生物修復(fù)技術(shù)和植物修復(fù)技術(shù)等[11]。

隨著對Frankia菌的相關(guān)研究越來越深入，大量研究證明Frankia菌與木麻黃屬植物建立共生關(guān)系可以提高木麻黃對干旱、鹽堿、金屬毒害的抗性[12]。其中有研究證明木麻黃屬植物可以積累大量重金屬，且各林齡木麻黃對重金屬均有很好的富集作用，且根是木麻黃屬植物富集重金屬的主要部位[13，14]。然而，關(guān)于Frankia菌與木麻黃屬植物細(xì)枝木麻黃共生體系對土壤Pb污染的響應(yīng)的影響還鮮有報道。本研究通過盆栽試驗，分析接種Frankia菌對細(xì)枝木麻黃結(jié)瘤量、礦質(zhì)元素吸收，丙二醛、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及其根系活力的影響，以期為Frankia菌接種到植物中增加植物對重金屬的抗性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

栽培基質(zhì)：由珍珠巖、蛭石按體積比1∶1混合而成，試驗基質(zhì)預(yù)先經(jīng)過110 KPa、121℃高壓蒸汽滅菌2 h以確保殺死其他雜菌，備用。

細(xì)枝木麻黃（Casuarina cunninghamiana）苗木從廣州海田樹業(yè)有限公司購入，栽種于以草木灰為基質(zhì)的塑料盆內(nèi)，對其進(jìn)行常規(guī)管理，待其生長出足夠的枝條，采取長勢一致、半木質(zhì)化的枝條進(jìn)行水培生根[14]，至根長約5 cm作為供試苗。

Frankiacasuarinae菌株購自德國萊布尼茨研究所“德國微生物菌種保藏中心”。實驗所用菌根接種劑是將購入凍干粉菌種進(jìn)行擴大培養(yǎng)，經(jīng)離心收集后輕微勻漿，用蒸餾水稀釋成為的菌懸液。

1.2 方法

試驗于2018年五月底至2021年二月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院設(shè)施大棚內(nèi)進(jìn)行。在同一Pb濃度處理的條件下，試驗設(shè)3個Frankia菌梯度：0 mg·株-1（CK）、10 mg·株-1、20 mg·株-1處理，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)8株，共72株苗木。將細(xì)枝木麻黃水培苗部分根尖剪去0.5～1 cm，在菌懸液中浸泡過夜，栽種于塑料花盆（直徑16 cm），每盆基質(zhì)150 g，將浸泡根系后的菌懸液環(huán)繞澆在根部，置于28℃下培養(yǎng)3個月，每星期每株苗施無氮霍格蘭營養(yǎng)液100 mL。接種后每月觀察結(jié)瘤情況。對照不施肥，3個月后測苗高、地徑，用水洗凈根部，計數(shù)根瘤個數(shù)。

接種3個月后，每5 d對每株細(xì)枝木麻黃施加Pb濃度為600 mg·kg-1的醋酸鉛溶液，以分析純的(CH3COO)2Pb溶于蒸餾水中，環(huán)形澆施。28℃常規(guī)管理30 d后進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)的測定。

1.3 測試指標(biāo)及方法

1.3.1 植物Pb含量及其礦物質(zhì)含量的測定

Pb脅迫處理后，將細(xì)枝木麻黃苗木小心取出，將干燥的植物樣品與土壤樣品研磨至通過1.5 mm篩，植物樣品采用HNO3-HClO4法消化（V∶V=5∶1），待測液用AA-700原子吸收分光光度計（島津，日本）測得細(xì)枝木麻黃枝條的Pb、K、Ca、Mg、Cu、Mn含量。

1.3.2 植物生理指標(biāo)的測定

參考鄭炳松[15]硫代巴比妥酸法與考馬斯亮藍(lán)法分別測定細(xì)枝木麻黃地上部分丙二醛(MDA)含量與可溶性蛋白（Soluble Proteins，SP）含量，參考李合生[16]磺基水楊酸提取茚三酮顯色法測定葉片游離脯氨酸（Proline）含量；蒽酮比色法測定可溶性糖（Soluble Sugar，SS）含量；采用甲醇浸泡法測根系活力。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

Excel 2019統(tǒng)計軟件用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計與繪圖，SPSS24.0軟件用于分析數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析（OneWay ANOVA)，Duncan法進(jìn)行多重比較，Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析（雙尾檢驗）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Frankia菌對Pb脅迫下細(xì)枝木麻黃生長的影響

由表1可知，在600 mg·kg-1Pb脅迫下，施用Frankia菌20 mg·株-1時，細(xì)枝木麻黃結(jié)瘤量相比接種10 mg·株-1增加了33.32%，接種Frankia菌10、20 mg·株-1，結(jié)瘤率均為100%。

表 1 Frankia菌對Pb處理下細(xì)枝木麻黃結(jié)瘤量的影響Tab. 1 Effect of Frankia bacteria on nodulation amount of Casuarina cunninghamiana under Pb treatment

2.2 Frankia菌對Pb脅迫下細(xì)枝木麻黃對各礦物質(zhì)吸收能力的影響

由圖1分析可得，在相同Pb處理下，隨著接種量的增加，細(xì)枝木麻黃體內(nèi)礦質(zhì)元素出現(xiàn)了不同的趨勢：與CK相比，10～20 mg·株-1Frankia菌處理細(xì)枝木麻黃枝條中Pb含量顯著下降（P＜0.05），20 mg·株-1處理時，Pb含量相比對照下降了58.06%；圖2表明K含量在10 mg·株-1處理時達(dá)到最低值，僅為對照的66.95%，當(dāng)接種量上升到20 mg·株-1時，K含量升高到對照的84.83%，與對照差異不顯著；Cu含量隨Frankia菌濃度升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，10 mg·株-1處理時，Cu含量達(dá)到最大值，比對照上升了64.0%。

圖 1 Frankia菌對Pb、Cu、Mn脅迫下細(xì)枝木麻黃地上部Pb積累量的影響Fig. 1 Effects of Frankia bacteria on Pb accumulation inaboveground part of Casuarina cunninghamiana under Pb, Cu and Mn stress

圖 2 Frankia菌對Pb脅迫下細(xì)枝木麻黃地上部K、Ca、Mg含量的影響Fig. 2 Effects of Frankia bacteria on K, Ca and Mg contents in aboveground part of Casuarina cunninghamiana under Pb stress

由表2分析可得，在相同濃度的Pb脅迫下，F(xiàn)rankia菌接種量與細(xì)枝木麻黃枝條中Pb含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，細(xì)枝木麻黃枝條中Pb含量與Mn、K元素含量呈顯著正相關(guān)，說明Frankia菌接種量可以與細(xì)枝木麻黃地上部Pb含量變化有著密切的關(guān)系。

2.3 Frankia菌對Pb脅迫下細(xì)枝木麻黃生理的影響

由表3分析可得，當(dāng)Frankia菌濃度為10 mg·株-1時，MDA含量相比對照顯著上升了22.87%，20 mg·株-1處理時，MDA含量相比對照下降了37.51%（P＜ 0.05）。

表3分別顯示了Pb脅迫下，不同接種量細(xì)枝木麻黃枝條中游離脯氨酸與可溶性糖的含量。可溶性糖含量隨著接種量的上升，呈現(xiàn)先減少后升高的趨勢，接種量為10 mg·株-1時，可溶性糖比對照組下降了37.10%；接種量為20 mg·株-1時，可溶性糖含量相比對照下降了10.10%。接種量為10 mg·株-1時，游離脯氨酸小幅上升，但與對照差異不顯著，接種量上升到20 mg·株-1時，游離脯氨酸顯著變化（P＜0.05），相比對照降低了56.04%。

表 2 細(xì)枝木麻黃地上部分金屬含量與Frankia接種量間的相關(guān)性Tab. 2 Correlation between metal content in aboveground part of Casuarina cunninghamiana and inoculation amount of Frankia

表 3 Frankia對Pb處理下細(xì)枝木麻黃逆境生理指標(biāo)的影響Tab. 3 Effects of Frankia bacteria on stress physiological index of Casuarina cunninghamiana under Pb treatment

圖3顯示了，F(xiàn)rankia菌接種量為10 mg·株-1時，細(xì)枝木麻黃根系活力小幅增強；接種量為20 mg·株-1時細(xì)枝木麻黃的根系活力TTC還原強度最強，與對照相比上升了87.12%。

圖 3 Frankia對Pb處理下細(xì)枝木麻黃根系活力的影響Fig. 3 Effect of Frankia bacteria on root activity of Casuarina cunninghamiana under Pb treatment

3 討論

植物根系作為直接與Frankia菌接觸的器官，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著接種量的增大，植株接種效果越好[17]，本試驗結(jié)果表明，在600 mg·kg-1Pb脅迫下，接種Frankia菌可以使其全部結(jié)瘤，且高接種量Frankia菌（=20 mg·株-1）時，結(jié)瘤數(shù)量上升明顯，這一結(jié)果與李遙研究Frankia菌接種量對榿木生長的影響一致。

植物從土壤中吸收重金屬，并把它們固定在根部，限制重金屬向地上部分轉(zhuǎn)移[18]。本試驗中隨著接種量的增加，細(xì)枝木麻黃枝條Pb含量明顯減少。這與蘇芳芳[19]雙接種（AMF與Frankia菌）楊梅葉片中Pb含量的變化一致?？赡苁且驗槟韭辄S根限制重金屬進(jìn)入地上部分，而與Frankia菌的結(jié)合增加了對重金屬的富集作用[13，19]。Mn可以維持葉綠體膜正常結(jié)構(gòu)，并且直接參與光合作用[20]，Mg離子螯合酶將Mg離子插入到原卟啉中，進(jìn)一步反應(yīng)形成最終產(chǎn)物葉綠素[21]，這兩種必須元素對植物光合作用有重要影響。與CK相比，本試驗中施用不同量的Frankia菌細(xì)枝木麻黃地上部Mn含量變化與Mg含量變化均不顯著，這說明Frankia菌可能對細(xì)枝木麻黃光合作用無影響。

丙二醛（MDA）作為膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，是植物遭受逆境傷害程度的重要指標(biāo)，其積累能夠加劇膜脂過氧化作用，增加植物體內(nèi)的活性氧、打破活性氧的代謝平衡以應(yīng)對逆境脅迫[22，23]。劉慧芹[24]等的研究認(rèn)為隨著脅迫時間及Pb濃度的增加，黑麥草幼苗體內(nèi)MDA含量與Pb濃度呈線性正相關(guān)(r2＞0.96)。本試驗結(jié)果表明，在Pb脅迫下，F(xiàn)rankia接種量為20 mg·株-1時，MDA含量有明顯的降低，表明高接種量細(xì)枝木麻黃細(xì)胞膜脂過氧化作用有所減緩，F(xiàn)rankia菌可以通過降低細(xì)枝木麻黃體內(nèi)的MDA的含量來抵御Pb脅迫。但是接種量較低時，細(xì)枝木麻黃細(xì)胞受損程度反而比對照組升高，這與前人研究結(jié)果不一致，其原因有待進(jìn)一步研究。

游離脯氨酸作為蛋白質(zhì)的一種重要組分，會在植物受到脅迫時隨著蛋白質(zhì)的分解釋放出來，增加細(xì)胞質(zhì)的濃度以維持細(xì)胞代謝活動[25]?？扇苄蕴恰⒂坞x脯氨酸是植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物在遭受逆境的時候通常會通過積累可溶性糖、游離脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)抵御逆境脅迫[26]。毛雪飛[27]等的研究認(rèn)為，在一定范圍內(nèi)隨著Pb濃度的增加，游離脯氨酸、可溶性糖含量有所增加。不同植物體內(nèi)可溶糖含量的變化較為復(fù)雜[24]。本試驗結(jié)果表明接種了Frankia菌的細(xì)枝木麻黃積累的可溶性糖更少，游離脯氨酸的積累量也更低。

根系是植物吸收土壤水分和養(yǎng)分的重要器官，可以直接影響植物的正常生長[28]。土壤重金屬向植物根部遷移是植物吸收累積重金屬的重要途徑[29]，重金屬脅迫后植物的根系活力能表現(xiàn)出該植物對重金屬的逆境脅迫處理的機體反應(yīng)[30]。本試驗中，F(xiàn)rankia菌接種量達(dá)20 mg·株-1可以顯著提高細(xì)枝木麻黃的根系活力，根系活力高表明Frankia菌從一定程度上降低了重金屬Pb對根系生長發(fā)育的抑制作用。

4 結(jié)論

（1）接種Frankia濕菌體量由10 mg·株-1增加到20 mg·株-1時，細(xì)枝木麻黃結(jié)瘤量也增加，結(jié)瘤率都可達(dá)100%。

（2）從幼苗細(xì)枝木麻黃枝條的Pb含量來看，接種Frankia可以降低細(xì)致木麻黃枝條內(nèi)Pb與K的含量，顯著地增加了Cu的含量，但對其他礦質(zhì)元素的影響并不顯著。今后可以適當(dāng)?shù)脑黾覨rankia菌的接種量，進(jìn)一步探究Frankia菌接種量與細(xì)枝木麻黃礦質(zhì)元素吸收之間的關(guān)系。

（3）在同一Pb脅迫濃度下，接種量為20 mg·株-1時，細(xì)枝木麻黃生長良好，F(xiàn)rankia菌可以有效的緩解細(xì)枝木麻黃對土壤高濃度Pb毒害的響應(yīng)，在防治土壤Pb污染上具有很大的潛力和價值。