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    超聲針聯(lián)合微泡干預(yù)尿激酶溶解體外血凝塊

    2022-03-22 11:11:28唐君輝唐家偉廖依依徐亞麗
    關(guān)鍵詞:微泡血凝掃描電鏡

    唐君輝,唐家偉,朱 瓊,廖依依,徐亞麗,劉 政

    (陸軍軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院超聲科,重慶 400037)

    顱內(nèi)血腫常繼發(fā)于腦血管意外和顱腦外傷,如不能及時(shí)清除,其占位效應(yīng)引起的顱內(nèi)壓劇烈增高及周邊腦組織毒性水腫可致腦疝、神經(jīng)損傷等一系列不可逆損傷[1-3];及時(shí)清除腦血腫對(duì)改善預(yù)后極為重要[4],但傳統(tǒng)開(kāi)顱手術(shù)可引起腦組織損傷、腦室間隔壓差改變及術(shù)后感染等風(fēng)險(xiǎn)[5]。

    超聲空化效應(yīng)可破壞血栓內(nèi)部纖維蛋白,增加組織間隙,為纖維蛋白溶解藥提供更多結(jié)合位點(diǎn),進(jìn)而增強(qiáng)溶栓效果[6-8];超聲聯(lián)合微泡可降低空化閾值,增加空化強(qiáng)度,破壞血栓作用更為顯著[9-13];聲輻射力帶動(dòng)周邊流體形成的聲流可進(jìn)一步加速藥物向血栓內(nèi)部滲透[14]。

    超聲針為變幅桿式微創(chuàng)超聲治療設(shè)備,有別于一般超聲于病變外進(jìn)行輻照的治療方式[15],其壓電陶瓷換能器后置,利用一根前置變幅桿將能量及振幅傳遞至針尖處,并達(dá)到最大能量,可避免直接接觸病變組織對(duì)陶瓷晶片的損傷,同時(shí)纖細(xì)的變幅桿可作為穿刺針靶向病變組織,實(shí)現(xiàn)病變內(nèi)超聲治療。本研究觀察超聲針聯(lián)合微泡對(duì)尿激酶溶解體外血凝塊的干預(yù)效果。

    1 材料與方法

    1.1 制備體外血凝塊 以移液槍將5%氯化鈣溶液200 μl與10 ml無(wú)菌抗凝新生牛全血(北京索萊寶生物科技有限公司)在半切離心管(50 ml離心管沿25 ml刻度線(xiàn)切開(kāi))內(nèi)混合,于37℃恒溫水浴鍋中孵育3 h,形成血凝塊。

    1.2 設(shè)備與方法

    1.2.1 設(shè)備及主要參數(shù) 超聲針(定制于江蘇百航超聲科技有限公司),中心頻率29.62 kHz,針尖直徑1.8 mm,工作時(shí)針尖前后、上下、左右3個(gè)方向的振幅分別為69.17、1.03、0.61 μm,針桿外附直徑2.5 mm針鞘,用于注射藥物。見(jiàn)圖1。

    1.2.2 干預(yù)方法 將40個(gè)血凝塊隨機(jī)分為5組,每組8個(gè),分別予以不同干預(yù)。單純超聲組:將超聲針插入血凝塊中心,以鐵架臺(tái)固定,治療8 min;單純尿激酶組:將100 000 IU尿激酶凍干粉(武漢人福藥業(yè)有限公司)溶解于20 ml 0.9%生理鹽水,制成5 000 IU/ml尿激酶溶液,采用微量注射泵(LD-P2020II,上海蘭德醫(yī)療光學(xué)儀器有限公司)以15 ml/h流率經(jīng)針鞘注入血凝塊中,注射時(shí)間8 min,注射量2 ml;超聲針+尿激酶組:超聲針治療8 min,注射2 ml尿激酶溶液;超聲+生理鹽水組:超聲針治療8 min,注射2 ml生理鹽水;超聲針+尿激酶+微泡組:于超聲針+尿激酶組干預(yù)基礎(chǔ)上,在尿激酶溶液中加入0.01 ml自制微泡(脂氟顯,全氟丙烷脂質(zhì)微泡,0.45×107~0.85×107MB)。將血凝塊在37℃水浴鍋中孵育1 h,以細(xì)針沿離心管管壁小心分離后,以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)清洗3次并以濾紙吸干血凝塊表面液體,采用電子天平(UTP-313,中國(guó)上?;ǔ彪娖饔邢薰?稱(chēng)重(Wafter)。計(jì)算血凝塊溶解量(W0)及溶解率。W0=Wbefore-Wafter,溶解率=W0/Wbefore×100%。Wbefore為治療前血凝塊質(zhì)量。

    1.2.3 掃描電鏡及大體標(biāo)本觀察 血凝塊稱(chēng)重后,于超聲+生理鹽水組之外的4組分別隨機(jī)挑選3個(gè)血凝塊,沿針道采集樣本,置于2.5%戊二醛(北京索萊寶生物科技有限公司)中48 h,以PBS清洗,再經(jīng)25%~100%乙醇梯度脫水后用叔丁醇法干燥。將樣本置于掃描電鏡(ZEISS, Crossbeam340)下觀察。以4%多聚甲醛固定其余血凝塊24 h后,沿針道切開(kāi)觀察。

    1.2.4 藥物滲透試驗(yàn) 將細(xì)胞膜特異性橙紅色熒光染料1,1′-雙十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽(DiI)以1∶10(mg∶ml)溶解于二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)。取9個(gè)體外血凝塊,隨機(jī)分為3組,每組3個(gè)。對(duì)照組:將超聲針插入血凝塊中,不啟動(dòng),僅采用微量注射泵(LD-P2020II,上海蘭德醫(yī)療光學(xué)儀器有限公司)以15 ml/h流率將2 ml DiI溶液經(jīng)針鞘注入其內(nèi);超聲組:超聲針治療8 min,同時(shí)注射2 ml DiI溶液;超聲+微泡組:在超聲組基礎(chǔ)上向DiI溶液中加入0.01 ml自制微泡。完成干預(yù)后即刻以PBS清洗血凝塊3次,行冰凍切片;以熒光顯微鏡(Olympus, BX63)觀察DiI滲透情況。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料以±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,以L(fǎng)SD-t法兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 W0及溶解率 干預(yù)前各組血凝塊質(zhì)量Wbefore總體差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),干預(yù)后各組W0及溶解率總體差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01);組間兩兩比較,超聲+尿激酶組與超聲+尿激酶+微泡組間W0及溶解率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),其余3組間W0及溶解率兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

    表1 各組干預(yù)前血凝塊質(zhì)量及干預(yù)后W0、溶解率比較(±s)

    表1 各組干預(yù)前血凝塊質(zhì)量及干預(yù)后W0、溶解率比較(±s)

    組別Wbefore(g)W0(g)溶解率(%)單純超聲組(n=8)11.16±0.290.23±0.102.00±0.90超聲+生理鹽水組(n=8)11.26±0.130.40±0.13?3.58±1.13?單純尿激酶組(n=8)11.17±0.250.61±0.19?#5.44±1.62?#超聲+尿激酶組(n=8)11.20±0.222.44±0.14?#△21.75±1.45?#△超聲+尿激酶+微泡組(n=8)11.14±0.712.54±0.17?#△22.74±1.44?#△F值0.38476.95474.19P值0.82<0.01<0.01

    注:*:與單純超聲組比較,P<0.05;#:與超聲+生理鹽水組比較,P<0.05;△:與單純尿激酶組比較,P<0.05

    2.2 大體標(biāo)本及掃描電鏡所見(jiàn) 大體標(biāo)本中,相比單純超聲組和單純尿激酶組,超聲+尿激酶組和超聲+尿激酶+微泡組內(nèi)部溶解區(qū)域顯著增加,且后者更顯著,見(jiàn)圖2。掃描電鏡下,未經(jīng)干預(yù)的血凝塊內(nèi)見(jiàn)清晰的纖維蛋白網(wǎng)包裹紅細(xì)胞;單純超聲組見(jiàn)被破壞的纖維蛋白及紅細(xì)胞碎片覆蓋在血凝塊表面;單純尿激酶組纖維蛋白絲呈模糊溶解狀態(tài)貼附于紅細(xì)胞表面;超聲+尿激酶組及超聲+尿激酶+微泡組纖維蛋白數(shù)量較單純尿激酶組明顯減少;相比超聲+尿激酶組,超聲+尿激酶+微泡組表面出現(xiàn)凹陷,且紅細(xì)胞形變更嚴(yán)重。

    圖2 各組大體標(biāo)本圖及掃描電鏡觀察圖(×2 000) A1~D1.分別為單純超聲組、單純尿激酶組、超聲+尿激酶組和超聲+尿激酶+微泡組大體標(biāo)本圖; A2~D2.分別為單純超聲組、單純尿激酶組、超聲+尿激酶組和超聲+尿激酶+微泡組掃描電鏡圖; E.未經(jīng)干預(yù)血凝塊掃描電鏡圖

    2.3 DiI滲透試驗(yàn) 熒光顯微鏡下,對(duì)照組針道表面光滑平整,可見(jiàn)熒光,血凝塊內(nèi)未見(jiàn)破壞及熒光;超聲組及超聲+微泡組均見(jiàn)血凝塊組織疏松,DiI滲透深遠(yuǎn),滿(mǎn)視野熒光,針道擴(kuò)大,表面破壞,以超聲+微泡組缺損面積更大、DiI滲透更深。見(jiàn)圖3。

    3 討論

    腦血腫體積較大時(shí)占位效應(yīng)明顯,需要快速清除排出;不具備開(kāi)顱手術(shù)條件時(shí),可采用微創(chuàng)鉆孔引流,以迅速緩解病情,爭(zhēng)取救治時(shí)間[16]。超聲針可通過(guò)微創(chuàng)穿刺方式抵達(dá)腦血腫,聯(lián)合尿激酶快速溶解血栓,以清除血腫。

    為觀察超聲針聯(lián)合尿激酶的溶栓效果,本研究首先制備牛血凝塊,而后將超聲針置于其中,發(fā)現(xiàn)超聲+尿激酶+微泡組和超聲+尿激酶組對(duì)于血塊的溶解率均高于單純尿激酶組、超聲+生理鹽水組及單純尿激酶組,且大體標(biāo)本可見(jiàn)超聲+尿激酶+微泡組、超聲+尿激酶組內(nèi)部溶解區(qū)域均比單純超聲組、單純尿激酶組顯著增大,提示超聲針聯(lián)合尿激酶可協(xié)同促進(jìn)血凝塊溶解。

    本研究發(fā)現(xiàn)超聲+生理鹽水組的W0及溶解率均高于單純超聲組。超聲空化效應(yīng)可機(jī)械破壞血栓組織,但單純超聲針的機(jī)械破壞作用有限;液體經(jīng)針鞘輸入時(shí),被高速振動(dòng)的針尖擊破為小液滴,為聲空化提供了空化核,增強(qiáng)空化效應(yīng)對(duì)血凝塊的破壞作用[14,17-18];且給予額外空化核,即聯(lián)合用于微泡,可進(jìn)一步加強(qiáng)超聲的空化作用。

    DiI的分子量為尿激酶的2倍以上。本研究熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示,經(jīng)超聲針作用后,DiI可明顯滲入血凝塊內(nèi)部。經(jīng)超聲空化破壞后的血凝塊組織間隙增大,尿激酶可充分滲透,溶解更迅速。鏡下微觀結(jié)果提示,聯(lián)合應(yīng)用超聲針、尿激酶及微泡能增強(qiáng)對(duì)血凝塊的機(jī)械破壞作用,但超聲+尿激酶組與超聲+尿激酶+微泡組稱(chēng)重結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。既往研究[19]顯示,微泡可明顯增加微射流、自由基及剪切力,使尿激酶變性甚至失活,或可解釋上述結(jié)果;而干預(yù)后孵育溶解時(shí)間及加入微泡濃度亦可能為其影響因素。

    綜上,超聲針聯(lián)合尿激酶可協(xié)同促進(jìn)體外牛血凝塊溶解,但聯(lián)合微泡未見(jiàn)溶解率顯著提高,有待進(jìn)一步觀察。

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