MMP-9及CD147在下咽癌中的表達(dá)及其臨床意義

鄒平 李華炎 周志華 何時(shí)知

下咽癌在臨床中較常見(jiàn)，是一種頭頸部惡性腫瘤，而且容易出現(xiàn)浸潤(rùn)生長(zhǎng)，極易發(fā)生轉(zhuǎn)移。一般情況下，當(dāng)下咽癌患者確診時(shí)，很多已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[1]。了解腫瘤對(duì)周?chē)＝M織的侵襲，確定淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移，對(duì)確定腫瘤病情程度具有重要意義。基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）是一種Ⅳ型膠原酶，與腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移具有明顯關(guān)系[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶刺激因子CD147蛋白是一種高度糖基化單鏈跨膜糖蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量在50×103～60×103，是免疫球蛋白超家族中的成員[3]。CD147在很多腫瘤患者中存在高表達(dá)，對(duì)腫瘤、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用[4]。本研究選取42例下咽癌患者，探討MMP-9及CD147表達(dá)及其臨床意義，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取佛山市高明區(qū)人民醫(yī)院、北京同仁醫(yī)院2018年8月-2020年4月42例下咽癌患者病理組織石蠟標(biāo)本，設(shè)定為觀察組，納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理組織檢查確診為下咽癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤。其中男36例，女6例；年齡45～70歲，平均（58.46±2.16）歲；TNM分期：T1期3例，T2期4例，T3期27例，T4期8例；病理分期：低分化鱗癌18例，中分化鱗癌13例，高分化鱗癌11例。選取同時(shí)期下咽癌切除時(shí)癌旁正常黏膜標(biāo)本38例，設(shè)定為對(duì)照組，其中男31例，女7例；年齡45～71歲，平均（58.51±2.20）歲。兩組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2 方法

兩組均進(jìn)行MMP-9、CD147表達(dá)情況檢測(cè)。將組織標(biāo)本通過(guò)超薄切片機(jī)進(jìn)行切片處理，層厚為5 μm，每個(gè)組織均切3片，其中1片進(jìn)行常規(guī)HE染色，其余2片分別作MMP-9、CD147抗體的免疫組織化學(xué)染色。

HE染色：將切片脫蠟，放置到蘇木精染色液內(nèi)進(jìn)行浸泡，持續(xù)10 min，將其取出以水沖洗，去除多余染液。通過(guò)1%鹽酸酒精進(jìn)行浸提，在3次后實(shí)施分化，并用水沖洗，將多余鹽酸酒精去除，通過(guò)流水對(duì)玻片進(jìn)行浸洗，使之從淡紫色變成藍(lán)色，之后將其放置到伊紅染液內(nèi)進(jìn)行浸染，持續(xù)0.5 min，在瀝干后，通過(guò)80%～95%無(wú)水酒精進(jìn)行浸洗脫水，將其峰值到二甲苯溶液內(nèi)予以透明處理，通過(guò)中性樹(shù)脂進(jìn)行封固后予以切片處理。

免疫組化染色：將切片進(jìn)行脫蠟、水化，通過(guò)磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH 7.4）進(jìn)行沖洗，重復(fù)3次，3 min/次。在實(shí)施微波修復(fù)抗原時(shí)，采用檸檬酸緩沖液，持續(xù)15 min。切片均加入3%過(guò)氧化氫溶液50 μl，通過(guò)室溫孵育，持續(xù)10 min，以PBS進(jìn)行沖洗，連續(xù)3次，5 min/次。將PBS液甩掉，切片分別放置 1∶100 MMP-9 一 抗 50 μl、1∶100 CD147 一 抗50 μl，在室溫環(huán)境下孵育，持續(xù)60 min，通過(guò)PBS進(jìn)行沖洗，反復(fù)3次，5 min/次。將PBS液甩除后，在切片上加入50 μl聚合物增強(qiáng)劑，在室溫環(huán)境下孵育，持續(xù)20 min，采用PBS沖洗，反復(fù)3次，5 min/次。將 PBS液甩除，切片加入 50 μl二抗，在室溫環(huán)境下孵育，持續(xù)20 min，經(jīng)PBS沖洗，反復(fù)3次，3 min/次。將PBS液甩除，切片加入新配二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液100 μl，經(jīng)顯微鏡觀察3～5 min，棕色、紅色時(shí)為陽(yáng)性。采用蒸餾水沖洗，經(jīng)蘇木素復(fù)染，以0.1%鹽酸分化，采用自來(lái)水沖洗，并以PBS沖洗，使之返藍(lán)。通過(guò)梯度酒精進(jìn)行脫水處理，干燥后，二甲苯透明，通過(guò)中性樹(shù)膠完成封片處理。通過(guò)醫(yī)用顯微鏡進(jìn)行切片觀察，且對(duì)下咽癌實(shí)施病理分級(jí)，并觀察MMP-9、CD147陽(yáng)性表達(dá)情況。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

比較兩組MMP-9、CD147的表達(dá)陽(yáng)性率；比較觀察組中 TNM 分期為 T1～T2與分期為 T3～T4MMP-9、CD147的表達(dá)陽(yáng)性率。MMP-9、CD147的表達(dá)情況包括陰性（-）、陽(yáng)性（+）、強(qiáng)陽(yáng)性（++），表達(dá)陽(yáng)性率=1-陰性率。采用HE染色切片進(jìn)行診斷，經(jīng)具有豐富經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師進(jìn)行讀片證實(shí)；免疫組化染色切片通過(guò)計(jì)算機(jī)圖文采集系統(tǒng)顯微鏡下進(jìn)行觀察，且對(duì)圖像進(jìn)行采集。MMP-9陽(yáng)性通常處于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)腫瘤細(xì)胞中有棕黃色顆粒時(shí)，顯示為陽(yáng)性，CD147陽(yáng)性通常處于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜，在腫瘤細(xì)胞膜有棕黃色顆粒時(shí)顯示為陽(yáng)性。按照顯色強(qiáng)度與范圍可將其分成：當(dāng)陽(yáng)性染色細(xì)胞率＜10%則為陰性（-）；當(dāng)陽(yáng)性染色細(xì)胞率為10%～50%或是染色淺時(shí)則為陽(yáng)性（+）；當(dāng)陽(yáng)性染色細(xì)胞率＞50%及染色深時(shí)則為強(qiáng)陽(yáng)性（++）。

比較觀察組中有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌變組織中MMP-9、CD147的表達(dá)陽(yáng)性率，包括+、++。

分析觀察組中MMP-9、CD147的表達(dá)一致性，采用Kappa檢驗(yàn)，MMP-9、CD147一致性為兩個(gè)指標(biāo)均顯示的陰性、陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性總和與總例數(shù)的比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

研究數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0錄入處理，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，一致性采用Kappa檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組MMP-9、CD147表達(dá)陽(yáng)性率比較

觀察組MMP-9、CD147表達(dá)陽(yáng)性率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組MMP-9、CD147表達(dá)陽(yáng)性率比較[例（%）]

2.2 觀察組不同TNM分期MMP-9、CD147的表達(dá)陽(yáng)性率比較

分期為 T3～T4的 MMP-9、CD147表達(dá)陽(yáng)性率高于T1～T2，但比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 觀察組中不同TNM分期MMP-9、CD147的表達(dá)陽(yáng)性率比較[例（%）]

2.3 觀察組有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌變組織中MMP-9、CD147的表達(dá)陽(yáng)性率比較

觀察組中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者35例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者7例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中MMP-9、CD147表達(dá)陽(yáng)性率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表 3。

表3 觀察組有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌變組織中MMP-9、CD147的表達(dá)陽(yáng)性率比較[例（%）]

2.4 觀察組MMP-9與CD147表達(dá)一致性

觀察組中MMP-9、CD147表達(dá)同時(shí)為陰性11例，陽(yáng)性13例，強(qiáng)陽(yáng)性14例，一致率為90.48%（38/42），Kappa值為0.663，見(jiàn)表4。

表4 觀察組MMP-9與CD147表達(dá)一致性（例）

3 討論

腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程涉及多個(gè)因素的參與，而且是通過(guò)多個(gè)步驟完成的，而腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，也是導(dǎo)致腫瘤存在較高治療難度的重要因素。機(jī)體中，細(xì)胞外基質(zhì)和腫瘤轉(zhuǎn)移存在較明顯關(guān)系，腫瘤細(xì)胞、周?chē)?xì)胞外基質(zhì)間往往出現(xiàn)一系列動(dòng)態(tài)改變，在此過(guò)程中，往往存在較多酶釋放，且導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)成分發(fā)生降解，致使腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移。其中CD147、MMP-9發(fā)揮了重要作用。CD147分布較廣泛，在機(jī)體正常組織的角質(zhì)細(xì)胞、胚胎上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等部位存在，可參與到機(jī)體血腦屏障的構(gòu)成中，且在創(chuàng)傷愈合、組織修復(fù)、妊娠與胚胎發(fā)育等生理過(guò)程中具有一定表達(dá)，而非造血組織、腫瘤組織內(nèi)也可能出現(xiàn)一定表達(dá)，且對(duì)誘導(dǎo)腫瘤組織惡性潛能等發(fā)揮了重要作用，與腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移具有明顯關(guān)系[5]。CD147在細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)進(jìn)行黏附中具有較高參與性，而且在腫瘤表達(dá)中可對(duì)相鄰癌細(xì)胞產(chǎn)生作用[6]。MMP-9對(duì)基底膜Ⅳ型膠原酶等基質(zhì)成分具有明顯降解作用，去表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移具有明顯關(guān)系。

經(jīng)研究可知，觀察組MMP-9、CD147表達(dá)陽(yáng)性率均高于對(duì)照組，觀察組TNM分期為T(mén)3～T4的MMP-9、CD147 表達(dá)陽(yáng)性率高于 T1～T2，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者M(jìn)MP-9、CD147表達(dá)陽(yáng)性率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05），MMP-9、CD147表達(dá)一致率為90.48%，Kappa值為0.663。由此可知，在健康組織細(xì)胞中，MMP-9、CD147無(wú)較高的表達(dá)，而腫瘤會(huì)導(dǎo)致MMP-9、CD147表達(dá)明顯上升，當(dāng)腫瘤出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，會(huì)導(dǎo)致MMP-9、CD147出現(xiàn)明顯表達(dá)?；颊吣[瘤分期高時(shí)，MMP-9、CD147表達(dá)陽(yáng)性更高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。MMP-9、CD147在對(duì)腫瘤進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，其結(jié)果具有較高的一致性。通常認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞表面CD-147分子對(duì)MMP-9具有一定的刺激與激活能力，從而對(duì)癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用。在正常情況下，下咽處組織中并未出現(xiàn)MMP-9表達(dá)情況，有的會(huì)表現(xiàn)為弱陽(yáng)性表達(dá)，但是下咽癌細(xì)胞往往出現(xiàn)MMP-9的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，通常聚集于細(xì)胞質(zhì)[7]。CD147在正常下咽處組織內(nèi)無(wú)表達(dá)，或可于黏膜基底層細(xì)胞呈現(xiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)，但腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜均表現(xiàn)出強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。當(dāng)患者腫瘤分期增加時(shí)，并不會(huì)導(dǎo)致MMP-9、CD147表達(dá)上升，因此其對(duì)病情嚴(yán)重程度無(wú)較明顯反映。但是，當(dāng)腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，MMP-9、CD147往往出現(xiàn)較明顯表達(dá)，因此，可有效評(píng)估腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移[8]。

MMP-9在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用，主要包括，（1）可消除屏障：MMP-9可消除細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）屏障，有利于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[9]。（2）影響細(xì)胞間黏附：腫瘤細(xì)胞為了侵襲轉(zhuǎn)移，需抵抗細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)的黏附。通過(guò)胰蛋白酶產(chǎn)生作用，可使細(xì)胞壁上生長(zhǎng)的細(xì)胞有效脫落，而MMP-9是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中較常見(jiàn)的一種蛋白質(zhì)水解酶。（3）新生血管形成：腫瘤在生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移中，需要大量新生血管，MMP-9在一定程度上對(duì)血管形成具有明顯作用。在ECM降解中，新生血管可獲得較多空間，基質(zhì)可釋放一些利于血管形成的因子。MMP-9可使腫瘤更快速生長(zhǎng)，可促進(jìn)毛細(xì)血管末梢形成，對(duì)血管內(nèi)皮基底膜具有重要作用。腫瘤內(nèi)炎性細(xì)胞大量分泌MMP-9，利于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）能夠有效結(jié)合VEGF受體，可使腫瘤新血管大量增加。CD147對(duì)癌細(xì)胞擴(kuò)散轉(zhuǎn)移具有重要作用，（1）細(xì)胞間黏附：對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）水平、活性進(jìn)行改變，導(dǎo)致組織屏障受損，腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移[10]。（2）細(xì)胞、基質(zhì)黏附：可結(jié)合α3β1，與基質(zhì)蛋白產(chǎn)生作用，對(duì)基質(zhì)成分進(jìn)行有效降解，致使腫瘤細(xì)胞更快速地進(jìn)行侵襲轉(zhuǎn)移[11]。（3）在細(xì)胞內(nèi)羧基端結(jié)構(gòu)變化、結(jié)合基質(zhì)蛋白作用下，促進(jìn)基質(zhì)成分有效降解，可使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)擴(kuò)散轉(zhuǎn)移[12]。腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的CD147分子能夠?qū)ο噜彴┘?xì)胞進(jìn)行作用，通過(guò)相互誘導(dǎo)可使MMPs大量釋放降解基質(zhì)，對(duì)于腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移具有明顯促進(jìn)作用。

綜上所述，MMP-9及CD147的表達(dá)可對(duì)下咽癌病情進(jìn)行有效反映，對(duì)治療下咽癌具有重要指導(dǎo)意義。