高海拔地區(qū)不同抗原修復(fù)法對(duì)免疫組化染色的影響

徐開敏，陳 蕓，孟慶印

抗原修復(fù)是免疫組化技術(shù)中最關(guān)鍵的步驟[1]。近年隨著各醫(yī)院病例大幅增多，病理技術(shù)對(duì)免疫組化自動(dòng)化的需求也日益顯著。云南省為高海拔地區(qū)，我院地處海拔1 900 m，常壓下水的沸點(diǎn)為94.3 ℃。全自動(dòng)免疫組化染色儀均無(wú)高壓功能，抗原修復(fù)溫度最高只能達(dá)到水的沸點(diǎn)。受高海拔和抗原修復(fù)溫度影響，云南省免疫組化自動(dòng)化發(fā)展較慢，使用全自動(dòng)免疫組化染色儀的單位極少。隨著科技的發(fā)展，一些新技術(shù)和新產(chǎn)品的出現(xiàn)，逐漸解決了高海拔地區(qū)對(duì)免疫組化自動(dòng)化發(fā)展的限制。本文采用不同抗原修復(fù)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以尋找高海拔地區(qū)的最佳染色方法，提高免疫組化的準(zhǔn)確性和可靠性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2020年1月～2021年1月云南省腫瘤醫(yī)院病理科乳腺癌、肺癌、直腸癌、惡性黑色素瘤、前列腺癌石蠟樣本合計(jì)100例，切片厚4 μm。

1.2 試劑Lumatas全自動(dòng)免疫組化染色儀、抗原修復(fù)液、一抗、檢測(cè)系統(tǒng)，均購(gòu)自福州邁新公司。

1.3 方法選用科室常用的100種抗體作為測(cè)試對(duì)象，每種陽(yáng)性組織切片各切4份，隨機(jī)分為微波組、水煮組、高壓組、儀器組。其中，儀器組的免疫組化染色由儀器自動(dòng)完成；微波組、水煮組、高壓組均為手工操作，抗原修復(fù)液均為EDTA(pH 9.0)。采用溫度探測(cè)器測(cè)試微波組、水煮組、高壓組、儀器組最高抗原修復(fù)溫度分別為89.5、93.7、120.3、97.3 ℃，抗原修復(fù)時(shí)間分別為20、20、1.5、20 min。手工免疫組化染色步驟：組織經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)后滴加50 μL過(guò)氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min，PBS沖洗3 min×2次；滴加50 μL一抗，室溫孵育60 min，PBS沖洗3 min×2次；滴加50 μL二抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗3 min×2次；滴加50 μL DAB，室溫孵育5 min，自來(lái)水沖洗，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。

2 結(jié)果

2.1 抗體敏感度比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，100種抗體染色強(qiáng)度從高到低排序：高壓組>儀器組>水煮組>微波組(表1)。微波組假陰性率為10%，水煮組假陰性率為3%，且其它抗體的染色強(qiáng)度明顯弱于高壓組。儀器組的染色強(qiáng)度介于水煮組和高壓組之間(圖1)。

圖1 不同抗原修復(fù)對(duì)TdT染色強(qiáng)度的影響：A.高壓組；B.儀器組；C.水煮組；D.微波組 圖2 不同抗原修復(fù)對(duì)CK7背景著色的影響：A.高壓組；B.儀器組；C.水煮組；D.微波組 圖3 不同抗原修復(fù)對(duì)ER脫片的影響：A.高壓組；B.儀器組；C.水煮組；D.微波組 圖4 不同抗原修復(fù)對(duì)p63皺褶的影響：A.高壓組；B.儀器組；C.水煮組；D.微波組

表1 不同抗原修復(fù)對(duì)免疫組化染色的影響

2.2 抗體特異性比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EDTA高壓組中部分抗體出現(xiàn)背景染色，如PR、CD68、CD3、S-100、GST-π、p120、Calponin、CD99、EGFR、Lysozyme、Catenin-β、Glypican-3。其它組背景相對(duì)比較干凈(圖2)。

2.3 組織學(xué)形態(tài)比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高壓組中部分組織出現(xiàn)局部脫片(圖3)、皺褶(圖4)等現(xiàn)象，其它組暫未發(fā)現(xiàn)脫片、皺褶等現(xiàn)象。

3 討論

目前，常用的抗原修復(fù)方式：熱修復(fù)、酶修復(fù)。常用抗原修復(fù)液：EDTA、檸檬酸、EGTA、Tris、胰酶、胃酶等[2]。隨著一抗制備技術(shù)的發(fā)展，必須使用胰酶和胃酶修復(fù)的抗體逐漸被熱抗原修復(fù)的抗體取代[3]。為便于操作，越來(lái)越多的病理技術(shù)人員將一抗采用“一鍋煮”的方式進(jìn)行抗原修復(fù)，而不再采用多種抗原修復(fù)液分開進(jìn)行抗原修復(fù)[4]。

不同種類修復(fù)液的整體修復(fù)效果趨勢(shì)為pH 6.0～9.0范圍內(nèi)，抗原修復(fù)液pH值越高，免疫組化染色結(jié)果越強(qiáng)[5]；采用低pH值的抗原修復(fù)液，免疫組化染色背景較干凈，細(xì)胞形態(tài)較好[6]。采用相同的抗原修復(fù)液，其它條件相同的情況下，抗原修復(fù)溫度越高，免疫組化染色結(jié)果越強(qiáng)[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中微波組、水煮組、高壓組、儀器組最高抗原修復(fù)溫度分別為89.5、93.7、120.3、97.3 ℃，所獲得免疫組化染色強(qiáng)度與抗原修復(fù)溫度呈正相關(guān)。目前，國(guó)內(nèi)免疫組化試劑公司地址均為非高海拔地區(qū)，其質(zhì)控的抗原修復(fù)為正常方式。高海拔地區(qū)受海拔影響，采用非高壓方式進(jìn)行抗原修復(fù)時(shí)，抗原修復(fù)溫度會(huì)偏低，抗原決定簇暴露不充分[8]。若其它免疫組化染色條件，如試劑孵育采用試劑公司推薦的條件，免疫組化染色結(jié)果可能會(huì)整體偏弱[9]。當(dāng)某些組織中某種抗原含量較低，或某種抗體的親和力或敏感性較低時(shí)，可能造成假陰性結(jié)果[10]。本實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了該結(jié)果，核表達(dá)的抗體對(duì)抗原修復(fù)溫度要求較高，抗原修復(fù)溫度較低時(shí)，親和力和敏感性較低的核表達(dá)抗體出現(xiàn)假陰性的概率較大，如BCL-6、ERCC1、WT1、TDT、Rb Gene、PMS2、MLH1等。

綜上所述，抗原修復(fù)方法是否恰當(dāng)，直接影響免疫組化抗體的表達(dá)效果。對(duì)于高海拔地區(qū)，建議采用以下方法避免免疫組化假陰性：(1)選擇EDTA高壓1～2 min進(jìn)行抗原修復(fù)；(2)加強(qiáng)一抗孵育條件，如延長(zhǎng)一抗孵育時(shí)間或提高一抗孵育溫度至37 ℃；(3)采用濃縮型試劑的病理科，可根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果適當(dāng)提高一抗?jié)舛龋?4)采用具有低壓加熱功能的全自動(dòng)免疫組化染色儀。