食管鱗狀細胞癌中SNORA71B的表達及其與臨床病理特征的關系

沈素朋，梁 佳，劉 磊，郭 煒，郭艷麗，董稚明

食管癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，我國食管癌主要以食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)為主，由于缺少可靠的早期診斷標志物和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的治療靶標，中、晚期患者的5年生存率較低[1-2]。核仁小RNA(small nucleolar RNA, snoRNA)是指長度60～300個核苷酸長的RNA分子，具有復雜的一級和二級結(jié)構(gòu)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)snoRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及術后復發(fā)關系密切[4-6]。核仁小RNA 71B(SNORA71B)位于人類染色體20q11.23，其在ESCC中的表達及功能尚未見報道。本文檢測SNORA71B在人ESCC細胞系及組織中的表達，分析其與ESCC臨床病理特征及預后的關系，旨在為ESCC的靶向治療及預后評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2014年4月～2015年9月河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院診治的ESCC手術患者75例，術前均未接受放、化療。另收集癌旁正常組織(3～5 cm)作對照。收集1份新鮮組織置于-80 ℃低溫冰箱保存，提取總RNA；1份組織制成蠟塊用于HE染色觀察組織形態(tài)。隨訪75例ESCC患者，最長隨訪時間為65個月。本實驗經(jīng)我院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞株及主要試劑食管癌細胞系TE1、TE13、Eca109、Kyse150由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院腫瘤研究所病理研究室留存并傳代；Trizol購自SBS公司；胎牛血清購自PAN公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；Lipofectamine 2000購自Thermo公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、MTS試劑購自Promega公司；Transwell小室、Matrigel膠購自Corning公司。

1.3 總RNA提取以及qRT-PCR檢測SNORA71B基因的表達根據(jù)Trizol試劑盒說明書提取總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進行。應用qRT-PCR進行擴增，用于檢測SNORA71B基因的表達，上游引物：5’-GAGAGGAAT CAATGAAAGCGCT-3’，下游引物：5’-GCATGTAC GAAAGCTCCAGAGTT-3’，片段大小為81 bp，反應條件：95 ℃預變性10 min后；95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，合計40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，SNORA71B基因以GAPDH作為內(nèi)參，每個樣本設3個復孔。根據(jù)每孔熒光信號達到閾值時經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)作為Ct值，采用相對定量法，以N=2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量，其數(shù)值表示癌組織相對于配對癌旁正常組織的相對倍數(shù)。

1.4 特異性shRNA的構(gòu)建、細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染2條shRNA-SNORA71B由上海吉瑪基因公司設計合成，分別命名為sh1-SNORA71B和sh2-SNORA71B另附送sh-NC(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對照組)作為對照。細胞系常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃ 5%CO2的條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天選擇生長狀態(tài)良好的細胞均勻鋪于6孔板內(nèi)，細胞一般長至70%開始轉(zhuǎn)染，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒分別將4條shRNA-SNORA71B及sh-NC轉(zhuǎn)染至食管癌細胞Eca109中，6 h后更換含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h，并用熒光倒置顯微鏡觀察各組的轉(zhuǎn)染效率，提取各組細胞總RNA，用于觀察轉(zhuǎn)染4條shRNA-SNORA71B后mRNA的表達水平，選取干擾效率最高的shRNA-SNORA71B進行后續(xù)功能試驗。

1.5 MTS實驗檢測SNORA71B表達對細胞增殖的影響轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)24 h后用胰酶消化懸浮于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞濃度接種于96孔板，每孔100 μL培養(yǎng)基含有1 000個細胞。分別在細胞貼壁后0、24、48、72、96 h每孔中加入MTS試劑20 μL(500 μg/mL)，孵育4 h后酶標儀測定492 mm處的吸光度值。每組實驗設6個復孔，實驗重復3次。

1.6 Transwell小室侵襲實驗檢測SNORA71B表達對細胞侵襲的影響將Matrigel膠稀釋后，向小室上層加入50 μL稀釋的Matrigel膠，37 ℃過夜。細胞首先使用無血清培養(yǎng)基饑餓24 h，胰酶消化并收集細胞，無血清培養(yǎng)基重懸細胞并調(diào)整細胞濃度為每毫升1×105個細胞，每孔上室加入200 μL細胞懸液，下室加入600 μL含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室，PBS沖洗3次。染色固定，將小室上的聚碳酸酯膜輕輕剪下，放于載玻片上，樹脂封固。顯微鏡下計數(shù)5個隨機視野內(nèi)的細胞數(shù)，比較各組穿膜細胞數(shù)判斷細胞的侵襲性。實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 ESCC組織及食管癌細胞中SNORA71B基因的表達首先應用SNORic(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/SNORic)在線數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站分析SNORA71B在食管癌中的表達及其對患者生存期的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNORA71B在癌組織中的表達高于癌旁正常組織(圖1A)，SNORA71B高表達組患者的5年生存率低于低表達組(圖1B)。

本組檢測SNORA71B基因在75例ESCC組織及相應癌旁組織中的表達，結(jié)果顯示SNORA71B基因在ESCC組織中的相對表達量(3.242±1.074)明顯高于癌旁正常組織(1.212±0.470)(P<0.01，圖1C)。結(jié)合臨床病理資料發(fā)現(xiàn)SNORA71B基因表達與ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、浸潤深度和TNM分期相關(P<0.05，表1)。

圖1 不同食管組織中SNORA71B基因的表達：A.SNORic網(wǎng)站預測SNORA71B基因在食管癌及正常黏膜中的表達；B.SNORic網(wǎng)站預測SNORA71B表達對食管癌患者生存期的影響；C.75例食管鱗狀細胞癌組織及癌旁正常組織中SNORA71B基因的相對表達量， **P<0.01

表1 食管鱗狀細胞癌中SNORA71B的表達及與臨床病理特征的關系

2.2 SNORA71B基因與ESCC患者預后的關系根據(jù)SNORA71B在ESCC組織中表達的均值將患者分為SNORA71B高表達組和低表達組，其中高表達組36例，低表達組39例。SNORA71B高表達組患者的5年生存率為12.3%(中位生存時間23個月)，低表達組患者的5年生存率為25.7%(中位生存時間35個月)。經(jīng)Log-rank檢驗分析顯示，SNORA71B高表達可縮短ESCC患者的生存期(P<0.01，圖2)；為排除混雜因素對實驗結(jié)果的影響，多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，SNORA71B基因表達可能是ESCC患者的獨立預后危險因素(表2)。

圖2 SNORA71B表達與食管鱗狀細胞癌患者預后的關系

表2 多因素Cox回歸分析食管鱗狀細胞癌患者預后的危險因素

2.3 食管癌細胞株中SNORA71B的表達及對Eca109細胞增殖及侵襲的影響應用qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，SNORA71B基因在4株食管癌細胞中的相對表達量(Eca109：2.36±0.21、Kyse150：1.67±0.21、Kyse170：1.46±0.19、TE1：1.36±0.10)高于對照組(1.04±0.08)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3A)，在Eca109細胞中表達最高。

本組在SNORA71B表達最高的Eca109細胞中進行細胞功能實驗，轉(zhuǎn)染2個針對SNORA71B設計的shRNA；應用qRT-PCR法檢測SNORA71B的敲低效率(sh1：0.41±0.04，sh2：0.65±0.04)。其中，sh1-SNORA71B的敲低效率最高，選其進行后續(xù)實驗(P<0.01，圖3B)。

MTS實驗結(jié)果顯示，48 h后sh1-SNORA71B組與對照組相比，其能夠顯著抑制食管癌細胞的增殖能力，差異有統(tǒng)計學意義(48 h：0.414±0.043vs0.319±0.037、72 h：0.540±0.057vs0.377±0.043、96 h：0.759±0.057vs0.537±0.059，P<0.05，圖3C)。上述結(jié)果提示敲低SNORA71B基因，可以抑制食管癌細胞系Eca109的體外增殖能力。

Transwell小室侵襲實驗結(jié)果顯示，與對照組細胞穿膜數(shù)比較，sh1-SNORA71B組的穿膜細胞數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(268.33±20.82vs223.00±6.08，P<0.05，圖3D)，提示敲低SNORA71B基因后可以抑制食管癌細胞系Eca109的體外侵襲能力。

圖3 SNORA71B在食管癌細胞中的表達及其對Eca109細胞增殖及侵襲能力的影響：A.SNORA71B在4種食管癌細胞株中的表達水平；B.qRT-PCR法檢測Eca109細胞中sh-RNAs的沉默效果；C.MTS檢測SNORA71B對Eca109細胞增殖能力的影響；D.Transwell侵襲實驗檢測SNORA71B對Eca109細胞侵襲能力的影響；pools.按等比例隨機混合10例食管正常黏膜組織的cDNA；sh-NC.轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對照組；*P<0.05，**P<0.01

3 討論

snoRNA是一類廣泛分布于真核生物細胞核仁的小分子非編碼RNA，最初發(fā)現(xiàn)其在調(diào)節(jié)rRNA的假尿苷中起作用[7]。隨著高通量測序技術的發(fā)展，越來越多的snoRNA被發(fā)現(xiàn)、鑒定，越來越多的結(jié)果顯示snoRNA表達失調(diào)與各種惡性腫瘤的腫瘤發(fā)生相關[8-10]，其在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌或致癌的作用。如SNORD126基因在肝細胞癌中起致癌作用，SNORD126過表達增加AKT、GSK-3β和p70S6K的磷酸化水平，并提高成纖維細胞生長因子受體2(fibroblast growth factor receptor 2, FGFR2)的表達[11]。SNORD89通過調(diào)節(jié)Notch1-c-Myc途徑促進腫瘤細胞干性并在卵巢癌發(fā)生中充當癌基因，從而使卵巢癌患者預后不良[12]。

SNORA71B是由SNHG17的內(nèi)含子剪接而來，主要在細胞核中表達，位于染色體20q11.23，其在多種惡性腫瘤中有基因拷貝數(shù)的異常擴增[13-15]。2017年Schulten等[16]通過分子探針技術鑒定SNORA71B在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中過表達。2020年Duan等[17]研究發(fā)現(xiàn)SNORA71B在腦轉(zhuǎn)移的乳腺癌中高表達，且其高表達與患者預后不良密切相關，同時SNORA71B可通過誘導上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進乳腺癌細胞跨過血腦屏障進行轉(zhuǎn)移。Wu等[18]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG17通過正反饋回路調(diào)節(jié)其同源物SNORA71B表達上調(diào)，從而加重前列腺癌的進展。以上結(jié)果提示SNORA71B可能參與惡性腫瘤的進程。本組分析在線網(wǎng)站SNORic中SNORA71B在食管癌的表達及與其預后關系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNORA71B在ESCC組織中的表達高于癌旁正常組織，生存分析發(fā)現(xiàn)SNORA71B高表達組患者的5年生存率顯著低于其低表達組。本組檢測75例ESCC及癌旁正常組織中SNORA71B的表達，分析SNORA71B表達與臨床病理特征的關系，結(jié)果顯示SNORA71B基因在ESCC組織中表達高于癌旁正常組織，SNORA71B表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、浸潤深度及TNM分期相關。

本組結(jié)果顯示，SNORA71B高表達明顯縮短ESCC患者的生存期，與不良預后密切相關。采用多因素Cox回歸模型進行分析，發(fā)現(xiàn)SNORA71B高表達可作為ESCC患者的獨立預后因素。本組通過RNA干擾技術將sh-SNORA71B成功轉(zhuǎn)染至食管癌細胞Eca109中，結(jié)果顯示SNORA71B基因敲低后可抑制Eca109細胞增殖能力及侵襲能力。以上結(jié)果均提示SNORA71B基因在ESCC中可能發(fā)揮促癌作用。

總之，本實驗結(jié)果顯示SNORA71B基因在ESCC組織中表達升高，其高表達與不良預后密切相關。特異性的敲低SNORA71B基因表達，可抑制食管癌細胞的增殖及侵襲能力，提示SNORA71B基因可能在ESCC中發(fā)揮促癌作用，同時在ESCC惡性進程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，有望成為ESCC生物學標志物。