初探DNMT2基因在乳腺癌中的表達(dá)

謝濟(jì)陽(yáng) 張生輝 段雯芝 張妍蓉 李云龍 何嫻婕

摘要：目的：探討DNMT2基因在乳腺癌中的表達(dá)及序列分析。方法 采用雌性 SD作為種鼠傳代腫瘤。通過(guò)Walker-256腫瘤細(xì)胞株在含10%小牛血清 1640培養(yǎng)液通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)傳代培養(yǎng)擴(kuò)增，細(xì)胞懸液約 1.5ml（細(xì)胞數(shù)約1.0x107 ）種鼠腹腔內(nèi)注射，約1周后可形成腹水瘤。測(cè)定乳腺癌組織及癌旁組織中DNMT2 mRNA 表達(dá)水平;通過(guò)免疫組化染色測(cè)定乳腺癌組織中DNMT2表達(dá)程度。結(jié)果 DNMT2 mRNA 在乳腺癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于乳腺癌旁組織（P< 0.05）。乳腺癌組織中DNMT2表達(dá)程度及陽(yáng)性表達(dá)率顯著增加。結(jié)論 DNMT2在乳腺癌組織中有表達(dá)，與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有一定的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：DNMT2;乳腺癌;中老年

女性全年齡段惡性腫瘤中乳腺癌發(fā)病率排在首位，且發(fā)病率呈逐漸升高和發(fā)病年齡逐漸年輕化的趨勢(shì)[1]。目前研究結(jié)果表明在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中抑癌基因的高甲基化和癌基因的低甲基化起到非常重要的作用，并且這種異常的甲基化和機(jī)體內(nèi)DNMTs表達(dá)水平的變化就是導(dǎo)致這種異常甲基化治病的機(jī)制之一[2]。甲基化在機(jī)體內(nèi)的修飾是在DNMTs作用下形成mC的過(guò)程，所以理論上來(lái)講甲基化應(yīng)該與DNMT的活性有關(guān)。本文就是采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)乳腺癌組織以及對(duì)應(yīng)的乳腺癌旁組織中DNMT2 基因相對(duì)表達(dá)水平及與臨床病理特征之間的關(guān)系。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性 SD（Sprague-Dawley）小鼠 45只，體重 200±l0g。另 SD 小鼠 12只，體重 50～60g，雌雄不限，作為種鼠傳代腫瘤。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳腺癌模型制作

Walker-256腫瘤細(xì)胞株在含 10%小牛血清 1640培養(yǎng)液通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)傳代培養(yǎng)擴(kuò)增，細(xì)胞懸液約 1.5ml（細(xì)胞數(shù)約1.0x107 ）種鼠腹腔內(nèi)注射，約 1周后可形成腹水瘤。無(wú)菌抽取腹水約 3ml，癌性腹水呈黃色渾濁樣或淡紅色洗肉水樣。取少量稀釋并計(jì)數(shù) ，之后腹水 800r/min離心約 5min，棄上清，沉淀細(xì)胞用 PBS緩沖液稀釋?zhuān){(diào)節(jié)懸液細(xì)胞濃度至 4X107/ml。實(shí)驗(yàn)組小鼠 10%水合氯醛腹腔麻醉，仰臥位，左側(cè)腋窩皮膚消毒，皮下緩慢注射細(xì)胞懸液 0.8ml（細(xì)胞數(shù)約 3X107）。注射針退出后穿刺點(diǎn)針口消毒。待動(dòng)物出瘤。

1.2.2 乳腺癌組織標(biāo)本

瘤體形成后，處死小鼠，取下瘤體組織和瘤體周?chē)M織，清洗掉表面血跡后立即放入室溫保存的RNAlater溶液中，4℃過(guò)夜保存，然后-80℃保存。所有標(biāo)本均經(jīng)過(guò)病理證實(shí)。切片制備：切片脫蠟至水，在PBS中平衡10分鐘，以蒸餾水新鮮配制的3%H202室溫20分鐘滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。微波修復(fù)抗原：將切片浸入PH6.0、0.01M枸椽酸鹽緩沖液，微波爐高火加熱5分鐘。緩慢冷卻后，放在PBS中再平衡10分鐘。備用。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采Trizol試劑盒分別提取其總RNA，使用DNaseI試劑提純;紫外分光光度儀測(cè)定A260/A280值;采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，-80℃保存?zhèn)溆?引物合成DNMT2：5-TTGGAATAGGGGACCTCGTGTG-3，5-AGAGACCTCGGAGAACTTGCCATC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物152bp;反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30s，68℃退火30s，72℃延伸3 min， ?30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，收集溶解曲線;以倍比稀釋的cDNA作為模板，檢測(cè)循環(huán)閾值（Ct）可采用2-Δt法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 免疫組化染色

石蠟切片脫臘，3%H2O2 室溫孵30 min，然后 PBS 沖洗，滴加 10%正常山羊血清封閉液 37 ℃孵育 30 min; 加入一抗兔抗大鼠抗體 （1：100稀釋?zhuān)┓跤?，PBS 沖洗，滴加二抗山羊抗兔 IgG 孵育，PBS 沖洗， 滴加試劑辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A / HRP）孵育，PBS 沖洗，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用 SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù) 3 次，結(jié)果數(shù)據(jù)用 表示。多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用 SNK-q 檢驗(yàn)。以 P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織及癌旁組織中DNMT2 mRNA 表達(dá)水平比較

DNMT2 mRNA 在乳腺癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于乳腺癌旁組織（P< 0.05）。具體見(jiàn)圖1。

2.2 ?乳腺癌組織DNMT2免疫組化染色

乳腺癌組織中DNMT2表達(dá)程度及陽(yáng)性表達(dá)率顯著增加。具體見(jiàn)圖2。

3 討論

乳腺癌的發(fā)生機(jī)制主要包含有遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)兩種，其中表觀遺傳學(xué)機(jī)制在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著越來(lái)越重要的作用[3]。DNA啟動(dòng)子區(qū)域的異常甲基化研究的最為深入，主要過(guò)程為S-腺昔甲硫氨酸上的甲基在DNMT酶催化的作用下連接到胞嚓陡或腺嘌呤上面形成mC的一種可逆過(guò)程，DNMT活性或者功能表達(dá)水平的改變可能會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生部分疾病甚至腫瘤的發(fā)生[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)甲基化轉(zhuǎn)移酶有DNMT 1，DNMT2，DNMT3a和DNMT3b等4種亞型，DNMTl、DNMT3a和DNMT3b等在胚胎形成及發(fā)育、誘導(dǎo)疾病中發(fā)揮重要的作用，但DNMT2的作用機(jī)制目前還不很清楚[5]。

乳腺癌占據(jù)乳腺癌的15%，是一種侵略性很強(qiáng)的癌癥，這種類(lèi)型的乳腺癌是由于缺乏特定的受體蛋白，結(jié)合存在的荷爾蒙雌激素和孕激素正常的乳腺細(xì)胞[6]。乳腺癌常出現(xiàn)TP53突變，而其他常見(jiàn)癌基因的點(diǎn)突變出現(xiàn)頻率較低，因而其對(duì)靶向治療效果不佳[7]。在“美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊”上，研究人員發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞極易受干擾素-β一種有效的抗微生物藥物的影響，這種抗微生物藥物也能激活免疫系統(tǒng)。這項(xiàng)新的研究顯示干擾素-β?lián)p害乳腺癌細(xì)胞遷移和形成腫瘤的能力。該研究還表明干擾素-β治療可以改善某些乳腺癌患者的治療效果。之后研究人員使用乳腺癌組織數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證了他們的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果[8]。

綜上所述，DNMT2在乳腺癌組織中存表達(dá)，DNMT2基因的檢測(cè)可能為了解乳腺的發(fā)病機(jī)制提供參考，且DNMT2的表達(dá)也可作為乳腺癌預(yù)后判斷的依據(jù)。

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項(xiàng)目基金編號(hào)：長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃訓(xùn)練項(xiàng)目：長(zhǎng)醫(yī)教[2021]47號(hào)-116

第一作者：謝濟(jì)陽(yáng)，（2000.6-），男，本科，臨床醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)

通訊作者：何嫻婕（1983.12-），本科，講師，研究方向：婦產(chǎn)科教學(xué)