SP94-melittin與RGD-melittin雜合肽抗腫瘤性及溶血性研究

曹 靜

(商丘師范學(xué)院 生物與食品學(xué)院,河南 商丘 476000)

臨床上腫瘤的傳統(tǒng)治療方式對正常細胞具有很大損傷性,在用藥過程中會產(chǎn)生較大的副作用；另外傳統(tǒng)抗腫瘤藥物由于長時間使用而形成的耐藥性問題也亟待解決.針對腫瘤治療中藥物產(chǎn)生的毒副作用和耐藥性問題,開發(fā)減毒增效的新型抗腫瘤藥物已經(jīng)成為發(fā)展趨勢[1-3].

抗菌肽是一類具有廣譜抗細菌、真菌和部分病毒能力的小分子多肽[4],其中陽離子型抗菌肽還具有抗腫瘤效果,如蜂毒素(melittin),Tachyplesin I(鱟素I),天蠶素A 和 B等[5,6],進一步研究發(fā)現(xiàn)某些抗菌肽不僅可以特異性抑制某些腫瘤細胞的生長,而且對正常細胞損傷小,該特性為尋找新型抗癌藥物帶來新的方向[7,8].Melittin來源于蜂毒,具有很高的生物學(xué)活性和藥理作用,具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤[9,10]等作用,但Melittin具有的溶血性限制了它在腫瘤治療上的應(yīng)用.

近年來腫瘤的靶向治療成為研究熱點,靶向治療可以克服傳統(tǒng)治療存在的弊端.靶向藥物通過特異性結(jié)合到腫瘤細胞上,針對性的殺死腫瘤細胞同時降低對正常組織和細胞的損傷.研究表明運用靶向抗腫瘤藥物[11,12],可以改善抗腫瘤藥物的選擇毒性,提高抗腫瘤藥物的治療效果.本研究根據(jù)抗菌肽Melittin序列特點選擇連接的靶向肽具有分子量小、特異性強、免疫反應(yīng)性低的特點,從而達到減毒增效的目的[13-15].

ELISA和流式細胞檢測技術(shù)顯示PC型小肽中的PC94、肝癌細胞具有最高的結(jié)合活性,并且PC94在正常細胞中不存在,多肽SP94與肝癌細胞具有較強的結(jié)合活性,可競爭性抑制PC94與肝癌細胞的結(jié)合,因此SP94可作為肝癌細胞的靶向多肽[16].

整合素avP3受體是一種在腫瘤組織新生血管內(nèi)皮細胞膜和多種惡性腫瘤細胞表面均有高表達,而在絕大多數(shù)正常器官系統(tǒng)和成熟血管內(nèi)皮細胞不表達的腫瘤標(biāo)志物[17].RGD多肽(精氛酸-甘氨酸-天冬氣酸Arg-Gly-Asp)能夠結(jié)合腫瘤細胞或者新生血管特異表達的整合素avβ3受體,從而能夠?qū)⑺幬锇邢蛐詫?dǎo)入腫瘤部位,達到降低對正常組織細胞的損害,提高治療效果的目標(biāo)[14].

本研究選擇了兩種靶向肽SP94、RGD分別與melittin連接,對比了melittin連接兩者后抗腫瘤性和溶血性變化,對不同靶向肽連接多肽后生物活性的變化情況進行探討和分析.

1 材料與方法

1.1 材料

(1)細胞與培養(yǎng)基：人宮頸癌細胞(Hela)、人肝癌細胞(HepG2)購自中國科學(xué)院細胞庫；MEM、NEAA(Hyclone)、DMEM購自南京生興生物技術(shù)公司,胎牛血清(Millipore)購自南京福麥斯公司；細胞培養(yǎng)液為10% FBS,90% DMEM(MEM).

(2)多肽：melittin、SP94-melittin、RGD-melittin多肽由上海安馳生物技術(shù)公司合成.

melittin、SP94-melittin、RGD-melittin多肽序列見表1：

表1 melittin、SP94-melittin、RGD-melittin多肽序列

(3)主要實驗試劑：Triton-100、二甲基亞砜(DMSO)購自南京鼎國生物技術(shù)公司；JC-1凋亡細胞線粒體膜電位試劑盒、流式細胞凋亡試劑盒購自南京優(yōu)寧維生物技術(shù)公司.

1.2 實驗方法

(1)細胞培養(yǎng)：Hela、HepG2于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng),細胞培養(yǎng)箱條件為 37 ℃,5% CO2.

(2)細胞鋪板加藥試驗：調(diào)整細胞密度達到2×105/mL,鋪12孔板,置培養(yǎng)箱中過夜.次日孔內(nèi)加入0、1、2、4、7、10 μM的藥物濃度刺激細胞24 h,反應(yīng)結(jié)束后開始進行下一步實驗.

(3)檢測細胞凋亡情況：首先使用胰酶消化細胞,800 rpm,離心5 min,棄上清收集細胞于離心管,接著加入Binding buffer 195 μL和AV染料5 μL,振蕩混勻后室溫放置10 min,注意避光；反應(yīng)結(jié)束后每管內(nèi)再加入Binding buffer 190 μL和PI染料 10 μL,振蕩混勻后冰上放置于流式細胞儀上進行檢測.

(4)檢測細胞線粒體膜電位變化情況：取1 mL細胞懸液,800 rpm,5 min,離心后棄上清.管內(nèi)加入0.5 mL JC-1工作液,充分混勻,放置于培養(yǎng)箱(37 ℃,5% CO2)10 min.洗滌細胞：每管加2 mL 1× Assay Buffer,懸浮細胞,800 rpm,5 min,離心后棄上清,重復(fù)一次；洗滌后各管加入1× Assay Buffer 0.5 mL于流式細胞儀上進行檢測.

(5)溶血試驗：準(zhǔn)備1 mL采集的血液,加入10 mM PBS,1000 rpm,15 min,去上清,多次洗滌至上清澄清.離心去上清后,取500 μL,加24.5 mL 10 mM PBS,混勻,制成血液制品.取500 μL制備好的血液樣品置于水浴鍋中37 ℃孵育15 min,然后加入500 μL待測品,同時制備陽性對照組(Triton-100)和陰性對照組(PBS組),37 ℃水浴鍋孵育1 h.溶血率計算：

注：于OD 540處檢測吸光度值

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS方差分析程序?qū)嶒灁?shù)據(jù)進行單因素方差分析,結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示.

2 結(jié)果

2.1 melittin,SP94-melittin 和RGD-melittin促HepG2細胞凋亡情況

靶向肽SP94和RGD對肝癌細胞都具有較高的結(jié)合活性,將抗菌肽melittin分別與其連接,比較Melittin、SP94-melittin和RGD-melittin促肝癌細胞HepG2凋亡情況的差異性,以此分析靶向肽的不同對抗菌肽抗腫瘤性的影響.

圖1 (A)顯示不同濃度melittin作用HepG2細胞24 h后細胞調(diào)亡情況：10 μM melittin 誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡率接近83%,誘導(dǎo)的凋亡率隨濃度增加而升高；圖1(B)顯示隨SP94-melittin劑量的增加,HepG2細胞凋亡率有所增加,但上升較為緩慢；圖1(C)顯示2 μM RGD-melittin作用24 h后,HepG2即有25%凋亡率；當(dāng)濃度達到4 μM時,凋亡率達到51%；濃度為7、10 μM時,凋亡率分別為62%、90%,凋亡百分率隨著劑量的增加而提高.

比較melittin,SP94-melittin 和RGD-melittin促HepG2細胞凋亡情況(見圖1(D))：三者在低濃度1、2 μM時,HepG2細胞凋亡率區(qū)別不大；當(dāng)濃度增加到4 μM時,差異性開始明顯,RGD-melittin、melittin、SP94-melittin細胞凋亡率分別為51%、31%和24%；而當(dāng)濃度增加到7 μM,RGD-melittin與melittin細胞凋亡率分別為62%、53%,兩者差距縮小,而SP94-melittin細胞凋亡率僅為26%,與4 μM相比較區(qū)別不大；當(dāng)濃度增大到10 μM,melittin與RGD-melittin細胞凋亡率分別為90%、83%,而SP94-melittin較低為60%；從以上結(jié)果可以看出SP94-melittin促HepG2細胞凋亡效果明顯低于melittin和RGD-melittin；而RGD-melittin效果強于melittin(P<0.01).

(A)melittin促HepG2細胞凋亡情況 (B)SP94-melittin促HepG2細胞凋亡情況 (C)RGD-melittin促HepG2細胞凋亡情況 (D)melittin,SP94-melittin和RGD-melittin促HepG2細胞凋亡情況；數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,n=3,p < 0.01圖1 melittin,SP94-melittin 和RGD-melittin促HepG2細胞凋亡情況

2.2 melittin,SP94-melittin 和RGD-melittin促Hela細胞凋亡情況

為進一步證明melittin的抗腫瘤效果及驗證RGD的靶向性,本研究選用Hela細胞作為模式細胞.由圖2 (A)可見,4 μM melittin可以誘導(dǎo)Hela細胞產(chǎn)生明顯凋亡(P<0.01),而且凋亡比例隨濃度的增加而逐漸增大.圖2 (B)顯示SP94-melittin在1 μM、2 μM、4 μM低濃度時,Hela細胞凋亡率較低；在高濃度10 μM時,作用24 h后誘導(dǎo)Hela細胞大部分凋亡；SP94-melittin組凋亡率在高濃度處較為明顯.由圖2(C)可見1 μM、2 μM的 RGD-melittin凋亡率相差不大；4 μM RGD-melittin 24h誘導(dǎo)Hela細胞產(chǎn)生明顯的凋亡(P<0.01),隨著劑量的增加,凋亡百分率升高.

(A)melittin促Hela細胞凋亡情況 (B)SP94-melittin促Hela細胞凋亡情況 (C)RGD-melittin促Hela細胞凋亡情況 (D)melittin,SP94-melittin和RGD-melittin促Hela細胞凋亡情況；數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,n=3,p < 0.01圖2 melittin,SP94-melittin 和RGD-melittin促Hela細胞凋亡情況

從圖2(D)比較melittin、SP94-melittin和RGD-melittin促Hela細胞凋亡情況：在低濃度1 μM、2 μM時,三者凋亡情況相似；而當(dāng)濃度升至4 μM,melittin和RGD-melittin約為45%左右,SP94-melittin約為26%與低濃度相比變化不大；當(dāng)濃度增加到7 μM,從高到低依次為RGD-melittin(92%)、melittin(54%)、SP94-melittin(35%),三者差別較大；在10 μM處差距縮小,從高到低依次為RGD-melittin(92%),melittin(84%),SP94-melittin(74%).4 μM 的melittin與RGD-melittin即有明顯的抗腫瘤性,而 SP94-melittin作用較弱；隨濃度提高,RGD-melittin表現(xiàn)最為顯著,在7 μM濃度時凋亡率即達到92%,超出melittin 38%,SP94-melittin 57%,差異極顯著(P<0.01)；

根據(jù)以上結(jié)果本研究可以得出,連接有靶向肽SP94的melittin促凋亡效果在HepG2、Hela細胞上明顯低于單獨的melittin和RGD-melittin,尤其在4 μM、7 μM時；而RGD-melittin效果強于melittin(P<0.01).

2.3 SP94-melittin、RGD-melittin對HepG2細胞線粒體膜電位的影響

研究證明線粒體膜電位的降低是細胞凋亡的重要特征之一,因此本實驗采用JC-1線粒體膜電位試劑盒標(biāo)記細胞,最終通過流式細胞儀檢測線粒體膜電位變化來觀察抗菌肽RGD-melittin和SP94-melittin對肝癌細胞HepG2線粒體膜電位的影響.

如圖3所示：4 μM和7 μM濃度的 SP94-melittin作用HepG2細胞24h后,線粒體膜電位與陰性組相比分別降低10%、15%；4 μM和7 μM濃度的RGD-melittin作用HepG2細胞24h后,線粒體膜電位與陰性組相比分別降低55%、45%；該結(jié)果再次證明SP94-melittin和RGD-melittin對HepG2抗腫瘤性；另外比較RGD-melittin和SP94-melittin線粒體膜電位變化情況得出,在7 μM與4 μM濃度作用下RGD-melittin抗腫瘤性顯著強于SP94-melittin.

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,n=3,***p < 0.001圖3 流式細胞儀檢測HepG2細胞線粒體膜電位變化情況

2.4 melittin,SP94-melittin 和 RGD-melittin溶血性比較

本實驗將抗菌肽melittin分別與靶向肽SP94和RGD連接以達到增強抗菌肽靶向性同時減低其溶血性的目的.如圖4可見，各個濃度的melittin與SP94-melittin相比溶血率沒有顯著差異(P>0.05),RGD-melittin在0.04 μM及4 μM與melittin與SP94-melittin無顯著差異(P>0.05),但在0.2 μM、1 μM、2 μM濃度處與melittin與SP94-melittin相比差異極顯著(P<0.01).

圖4 melittin,SP94-melittin 和RGD-melittin溶血性比較

3 討 論

抗菌肽中的陽離子型抗菌肽不但具有廣譜抗細菌、真菌和部分病毒的能力,還具有抗腫瘤活性,同時還可以刺激機體增強免疫力.通過本研究再次證實抗菌肽melittin具有較強的抗腫瘤活性,與前人研究結(jié)果一致[9,10],另外本研究采用生物公司合成的多肽序列同樣具有正常的生物活性.

為使melittin在體內(nèi)對腫瘤細胞具有更強的靶向性,將melittin分別與對腫瘤細胞具有靶向性的多肽序列SP94、RGD連接,比較連接后的多肽序列的抗腫瘤性和溶血性的變化；抗腫瘤性由強到弱依次為RGD-melittin、melittin、SP94-melittin；SP94-melittin抗腫瘤性明顯低于melittin和RGD-melittin.線粒體膜電位變化也再次證明RGD-melittin抗腫瘤性強于SP94-melittin,并具有顯著(P<0.05)或極顯著差異(P<0.01).

據(jù)文獻報道Melittin的抗腫瘤機制是通過自身的二維結(jié)構(gòu)α-螺旋穿過腫瘤細胞膜引起細胞膜破裂,從而引起細胞內(nèi)容物外泄,導(dǎo)致細胞凋亡[18]；另有研究人員報道如果降低陽離子型抗菌肽的螺旋性會引起該抗菌肽抗菌活性降低[19]；對于本文中不同靶向肽連接melittin后抗腫瘤性產(chǎn)生明顯差異,本研究分析melittin通過10個連接子與12氨基酸長度的SP94連接,melittin通過3個連接子與3個氨基酸序列的RGD連接,連接較長序列的SP94-melittin促腫瘤細胞凋亡性遠遠低于melittin和連接較短序列的RGD-melittin,而RGD-melittin與melittin相比促腫瘤細胞凋亡性增強,說明連接較長序列的靶向肽可能會降低melittin的α-螺旋結(jié)構(gòu)的生物活性,連接的較短序列對多肽的二維結(jié)構(gòu)影響有限,并且因其特異性,反而增加抗菌肽自身生物活性；從實驗結(jié)果可以得出不同的靶向肽及靶向肽的長度、特異性可能會影響多肽自身的生物活性.

從溶血性結(jié)果可以得出RGD-melittin溶血性顯著低于melittin與SP94-melittin,而SP94-melittin與melittin溶血性無明顯差異,其溶血性改變的機制尚不清楚.

本研究通過腫瘤細胞凋亡實驗、線粒體膜電位測定和溶血實驗比較melittin、SP94-melittin、RGD-melittin抗腫瘤性和溶血性,得出melittin連接不同靶向肽及連接序列的長度對其生物活性具有一定的影響,設(shè)計人員在設(shè)計雜合肽序列時需要充分考慮各肽的生物活性及連接序列長度對彼此間的影響.本研究對設(shè)計靶向抗腫瘤雜合肽具有一定參考價值；另外本研究設(shè)計的腫瘤靶向雜合肽RGD-melittin可作為納米粒子的運載藥物靶向在腫瘤部位釋放以發(fā)揮其抗腫瘤效果.