隴藜1 號(hào)籽實(shí)多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

張志華，楊倩，楊富民

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省商業(yè)科技研究所，甘肅 蘭州 730010）

2021年中國(guó)藜麥種植面積約2萬(wàn)hm2，其中甘肅省的種植面積1 萬(wàn)hm2，隴藜1 號(hào)是甘肅的主栽品種［1］。多糖是構(gòu)成生物體生命活動(dòng)所需要的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，具有抗癌、預(yù)防心腦血管疾病、緩解疲勞和抗氧化等功效。有關(guān)對(duì)藜麥多糖提取、純化和含量測(cè)定等方面的研究主要集中在藜麥葉、秸稈及藜麥米方面［2］。如蔣玉蓉等［3］研究結(jié)果表明，藜麥葉片多糖的提取率可達(dá)到6.101 3 g/100 g，對(duì)DPPH和羥自由基的IC50（半抑制濃度）分別為31.96 μg/mL和157.62 μg/mL。郝曉華等［4］采用微波技術(shù)從藜麥秸稈中萃取多糖，提取率為1.93%，多糖對(duì) DPPH和羥自由基的清除率為71.09%和29.72%。李佳妮等［5］采用酶解-超聲聯(lián)合萃取藜麥多糖，并測(cè)定其對(duì)羥自由基、 DPPH 和 ABTS+自由基的清除作用，發(fā)現(xiàn)多糖溶液對(duì)羥自由基清除率較高，對(duì) DPPH 和ABTS+自由基無(wú)明顯清除效果。目前對(duì)未脫殼的隴藜1號(hào)藜麥籽實(shí)多糖的提取及抗氧化研究尚未見(jiàn)報(bào)道，未脫殼藜麥籽實(shí)直接提取多糖，可省去礱谷工序。

本研究以隴藜1號(hào)未脫殼的籽實(shí)為試驗(yàn)材料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用4因素3水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)纖維素酶提取藜麥籽實(shí)多糖的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其抗氧化性進(jìn)行研究，旨在為未脫殼的隴藜1號(hào)多糖提取和進(jìn)一步利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

隴藜1號(hào)購(gòu)自甘肅省藜美農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.2 試劑

纖維素酶（晟發(fā)食品科技有限公司，活力105U/g），葡萄糖、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、水楊酸均為分析純（天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；苯酚、濃硫酸、石油醚、考馬斯亮藍(lán)-G250 均為分析純（成都市科隆化學(xué)品有限公司）。

1.3 儀器

DGG9070A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；JA2003型電子天平（上海精密儀器儀表有限公司）；DKS26型恒溫水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；GT101 型高速臺(tái)式離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）；RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）； STSJB-1000 型電動(dòng)攪拌器（上海索廷智能設(shè)備股份有限公司）；Lyo Quest-85 型真空冷凍干燥機(jī)（河南兄弟儀器設(shè)備有限公司）；1510酶標(biāo)儀（賽默飛世爾儀器有限公司）；FTIR920 傅里葉變換紅外光譜儀（天津市拓普儀器有限公司）

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 藜麥多糖的提取 流程：藜麥?！鬯椤^(guò)篩→脫脂→風(fēng)干→加去離子水→調(diào)pH值至5→控制溫度、時(shí)間、料液比、酶濃度→水浴磁力攪拌→離心→收集上清液→醇沉收集沉淀→計(jì)算藜麥多糖提取率。

1.4.2 單因素試驗(yàn) 參考郭怡等［6］的方法，在溫度為60 ℃、時(shí)間為1.5 h，料液比為1∶35、纖維素酶用量為3%的基礎(chǔ)條件下，保持其他因素不變，只改變其中一個(gè)因素，設(shè)置料液比分別為1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55；溫度為40、50、60、70、80 ℃；時(shí)間為0.5、1、1.5、2、2.5 h；酶濃度為1%、3%、5%、7%、9%。通過(guò)苯酚-硫酸法測(cè)多糖濃度，計(jì)算提取率，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 以單因素試驗(yàn)最佳提取條件作為自變量，以多糖的提取率作為響應(yīng)值，對(duì)纖維素酶法提取藜麥多糖進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)內(nèi)容見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因子及編碼值Table 1 Box-Behnken test factors and coding values

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備

參考羅春萍等［7］的方法，將200 mg 干燥葡萄糖標(biāo)品溶解，100 mL容量瓶定容。吸取1、2、3、4、5 mL移入100 mL 容量瓶再次定容，取2 mL 離心管分別添加200 μL 不同濃度的標(biāo)液、200 μL 6%的苯酚溶液和700 μL 濃硫酸，60 ℃水浴15 min，冷卻至室溫。在485 nm 下測(cè)吸光值，測(cè)定3 次，取平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.6 多糖含量測(cè)定及提取率計(jì)算

采用苯酚-硫酸法，取200 μL 稀釋的多糖待測(cè)液，蒸餾水作空白對(duì)照，在485 nm處測(cè)定吸光值，取3次平均值。

式中：C為多糖濃度；V為樣品定容后的體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)；M為藜麥籽實(shí)質(zhì)量（mg）。

1.7 分離與純化

將粗多糖液pH值調(diào)至5.0，加入3%的木瓜蛋白酶，60 ℃水浴酶解1 h，然后煮沸滅酶，離心，取上清液在截留量為1 000 U的透析袋中透析24 h，減壓濃縮。配制Sevage 試劑（氯仿-正丁醇=4∶1），加入五倍體積多糖溶液，震蕩20 min，4 000 r/min 離心5 min，取上層水相4次，加乙醇至上層水相含醇量為80%，4 ℃過(guò)夜靜置，沉淀離心加蒸餾水復(fù)溶，真空凍干。

1.8 紅外與紫外光譜分析

參考張彩梅等［8］方法，取2 mg 多糖粉末，與150 mg 溴化鉀混合研磨均勻后壓片，在波長(zhǎng)500～4 000 cm-1的范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜儀掃描。

用2 mL的蒸餾水將20 mg多糖粉末溶解，用紫外線(xiàn)分光光度計(jì)在220～700 nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 抗氧化性測(cè)定

1.9.1 羥自由基清除力 參考Teng 等［9］方法，取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 多糖溶液2 mL，加入6 mmol/L 硫酸亞鐵溶液2 mL，靜置10 min，加入6 mmol/L 水楊酸溶液2mL，靜置30 min，在510 nm測(cè)定吸光度。

式中：Ai為樣液吸光值；Aj為蒸餾水替代水楊酸吸光值；A0為蒸餾水替代樣液吸光值。

1.9.2 DPPH 自由基清除率 參考Tan等［9］方法，取4 mL 0.2 mmol/LDPPH-無(wú)水乙醇溶液與2 mL濃度為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 的多糖溶液分別混合，25 ℃避光反應(yīng)30 min，517 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，計(jì)算清除率。

式中：Ax為以乙醇溶液代替DPPH 自由基測(cè)得背景對(duì)照；Ay為再以蒸餾水代替多糖溶液測(cè)得空白對(duì)照A0。

1.9.3 ABTS+自由基清除率測(cè)定 參考Teng等［9］方法，取25 mL 7 mmol/L ABTS溶液和440 μL 140 mmol/L過(guò)硫酸鉀混合，避光靜置12～16 h，用無(wú)水乙醇稀釋成工作液，在734 nm所測(cè)吸光度記為Ar（0.7±0.02）。取0.1 mL 梯度濃度多糖提取液（1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL），加 入ABTS+工 作 液5 mL，避光反應(yīng)10 min，734 nm 所測(cè)吸光度，記為At。以無(wú)水乙醇代替ABTS+工作液所測(cè)吸光度記為A0。

1.10 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS、Origin、Expert 8.0.6 對(duì)數(shù)據(jù)處理分析和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。線(xiàn)性回歸方程為：

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Figure 1 Glucose standard curve

由R2=0.999 4，擬合度高。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 時(shí)間對(duì)提取率的影響 圖2所示，提取時(shí)間在0.5～2 h間，多糖提取率隨提取時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)，在2 h時(shí)多糖提取率最大（4.18%）。之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率開(kāi)始下降。其原因可能是由于加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，少量多糖發(fā)生水解或氧化造成含量降低；同時(shí)，由于過(guò)度熱浸提，導(dǎo)致部分多糖包裹在固態(tài)不溶物或其他物質(zhì)中沉降造成損失的緣故。這與石子林等［11］熱水浸提法提取密花香薷多糖和符洪宇等［12］熱水浸提法提取香椿子多糖結(jié)果一致。因此，適宜的提取時(shí)間應(yīng)為2 h。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Figure 2 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides

2.2.2 料液比對(duì)提取率的影響 圖3 表明，在1∶15～1∶25的料液比范圍內(nèi)，隨著料液比的增加，提取效果呈上升趨勢(shì)，1∶25 時(shí)達(dá)到峰值（3.95%）。隨著料液比的增加，提取率逐步下降。這是因?yàn)榱弦罕仍龃?，底物濃度被稀釋?zhuān)瑥亩绊懥嗣附獾乃俾屎投嗵堑牡寐?。因此，宜選擇料液比為1∶25進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 料液比對(duì)多糖提取率的影響Figure 3 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of polysaccharide

2.2.3 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響 圖4 可以看出，當(dāng)溫度在40～60 ℃，隨著溫度的提高藜麥多糖的提取率也逐漸增加。60 ℃時(shí)達(dá)到最大值（4.14%）。隨后，溫度越高，提取率則不斷下降。其原因是高溫影響了纖維素酶的活性。因此，適宜的提取溫度應(yīng)為60 ℃。

圖4 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Figure 4 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides

2.2.4 酶濃度對(duì)多糖提取率的影響 由圖5可見(jiàn)，在1%～5%的酶濃度范圍內(nèi)，多糖提取率與加酶量成正比，隨纖維素酶的添加量增大而逐漸升高。酶濃度在5%時(shí)達(dá)到最大，多糖提取率為4.38%。在纖維素酶添加量大于5%之后，酶促反應(yīng)并沒(méi)有繼續(xù)加快，反而出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能是由于纖維素酶添加過(guò)多，在底物有限的條件下，影響了其作用的發(fā)揮。因此，宜選擇酶濃度為5%作為后續(xù)試驗(yàn)。

圖5 酶濃度對(duì)多糖提取率的影響Figure 5 Effect of enzyme concentration on extraction rate of polysaccharide

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 方差分析 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，回歸模型方差分析見(jiàn)表3。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Test design and test results

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance for regression models

方差分析結(jié)果表明，此模型顯著（P<0.05），復(fù)相關(guān)指數(shù)為R2Adj=96.89%；失擬項(xiàng)P值為0.606 5，不顯著（P>0.05）。說(shuō)明響應(yīng)值預(yù)測(cè)性好，數(shù)值誤差小。

提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）和酶濃度（D）一次項(xiàng)對(duì)提取率的影響為極顯著（P<0.01），交互二次項(xiàng)AB、AC、AD對(duì)提取率的影響為顯著（P<0.05）。

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析 由圖6～11可見(jiàn)，響應(yīng)面圖形均為山丘型，且等高線(xiàn)呈橢圓形，說(shuō)明提取溫度、提取時(shí)間、酶濃度和料液比的交互作用對(duì)提取效果有明顯的影響。提取時(shí)間軸的等高線(xiàn)曲線(xiàn)光滑，提取溫度軸的等高線(xiàn)密度較大，表明溫度對(duì)藜麥籽實(shí)多糖的提取有明顯的促進(jìn)作用。對(duì)藜麥籽實(shí)多糖的提取效果的主要影響因子依次為：提取溫度>提取時(shí)間>酶濃度>料液比。

圖6 提取時(shí)間、溫度對(duì)多糖提取率的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Figure 6 Response surface and contour plot of extraction time and temperature to extraction rate of polysaccharides

2.3.3 工藝條件驗(yàn)證 在提取溫度60.54 ℃、時(shí)間2.17 h、料液比1∶20.9、酶濃度5.10%時(shí)，藜麥多糖提取率達(dá)到最高，為5.20%。為方便操作及提高重復(fù)性，調(diào)整提取時(shí)間為2.0 h、溫度60 ℃、料液比1∶20、酶濃度5%，進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明，藜麥多糖提取率平均為5.16%，與理論值數(shù)據(jù)接近，說(shuō)明確定的工藝條件合理。

圖7 提取溫度、料液比對(duì)多糖提取率的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Figure 7 Response surface and contour map of extraction temperature and material-liquid ratio to extraction rate of polysaccharide

圖8 提取時(shí)間、料液比對(duì)多糖提取率的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Figure 8 Response surface map and contour map of extraction time and material-liquid ratio to extraction rate of polysaccharide

圖10 提取溫度、酶濃度對(duì)多糖提取率的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Figure 10 Response surface and contour map of extraction temperature and enzyme concentration to polysaccharide extraction rate

圖11 料液比、酶濃度對(duì)多糖提取率的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Figure 11 Response surface map and contour map of material-liquid ratio and enzyme concentration to polysaccharide extraction rate

2.4 紅外與紫外光譜分析

與多糖的特征峰相比，3 420.62 cm-1處為一寬的多糖分子間或分子內(nèi)O-H伸縮振動(dòng)引起的吸收峰，2 930.79 cm-1處為非對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)的C-H伸縮振動(dòng)引起的吸收峰［13］，表明該提取物為多糖類(lèi)物質(zhì)。1 654.14 cm-1處存在一個(gè)C=O 伸縮振動(dòng)吸收峰，1 402.47～1 085.24 cm-1處有C-H 變角振動(dòng)吸收峰，1 026.40 cm-1處的吸收峰是由吡喃糖環(huán)的醚鍵C-OC 所產(chǎn)生，618 cm-1處有吸收峰說(shuō)明具有β-型糖苷鍵，證明提取物符合多糖結(jié)構(gòu)特征和官能團(tuán)特性［14］。

220～700 nm 藜麥去蛋白粗多糖紫外光譜如圖13 所示。由圖13 可知，提取的粗多糖不含蛋白質(zhì)、核酸，這與江琦［15］等研究表明的200～220 nm為多糖特征峰，260、280 nm 處為核酸蛋白特征峰的結(jié)果一致。

圖12 藜麥多糖紅外圖譜Figure 12 Infrared spectra of quinoa polysaccharide

圖13 藜麥多糖紫外圖譜Figure 13 UV spectrum of quinoa polysaccharide

2.5 抗氧化性測(cè)定

2.5.1 羥自由基和DPPH 自由基清除率 圖14可見(jiàn)，在濃度為1～5 mg/mL 的范圍內(nèi)，隨著多糖濃度的增大，羥自由基清除率逐漸提高。在濃度為5 mg/mL時(shí)清除率可達(dá)60.55%。

圖14 羥自由基清除效果隨藜麥多糖濃度的變化情況Figure 14 Changes of scavenging effect of hydroxyl radical with concentration of Quinoa polysaccharide

圖15 表明，隨著溶液濃度的增大，藜麥粗多糖對(duì) DPPH 自由基的清除速度逐漸提高，3.0 mg/mL時(shí)DPPH 自由基的清除效率達(dá)到44.04%，但低于VC。

圖15 DPPH自由基清除效果隨藜麥多糖濃度的變化情況Figure 15 DPPH free radical scavenging activity in relation to the concentration of Quinoa polysaccharide

2.5.2 ABTS+自由基清除率 圖16 所示結(jié)果表明，隨著濃度的增大，藜麥粗多糖對(duì) ABTS+自由基的清除作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度為3 mg/mL時(shí)，其清除率為9.09%。與 DPPH 自由基清除率比較，去除效率相對(duì)較低。

圖16 ABTS+自由基清除效果隨藜麥多糖濃度的變化情況Figure 16 ABTS+ radical scavenging effect changes with the concentration of quinoa polysaccharide

3 討論

只有在最佳pH值、提取溫度、提取時(shí)間、料液比和酶濃度下，酶才能最大限度地發(fā)揮其作用。藜麥籽實(shí)由外部穎殼和內(nèi)部藜谷組成，富含纖維素。纖維素酶促進(jìn)植物細(xì)胞壁溶解的同時(shí)，還可促使纖維素和半纖維素分解成寡糖和單糖，加快胞內(nèi)物質(zhì)溶出速度［16］。由于底物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，纖維素酶能夠特異性地吸附在底物纖維素上，并與不同成分協(xié)同作用，使其降解為葡萄糖。

本試驗(yàn)采用未脫殼的藜麥籽實(shí)，在提取時(shí)間為2.0 h、溫度為60 ℃、料液比1∶20、酶濃度5%的條件下，其多糖提取率最高，為5.16%。這與郭怡等［6］報(bào)道的在料液比1∶32、酶用量2 000 U/g、溫度65 ℃、時(shí)間90 min 最優(yōu)條件基本一致。從提取率來(lái)看，本研究低于郭怡等［6］報(bào)道的提取率8.0%，但高于徐瀾等［17］報(bào)道的采用超聲波輔助法提取藜麥種子多糖的結(jié)果（偏關(guān)縣2 094.5 μg/g，靜樂(lè)縣1 781.5 μg/g）。分析其原因是因?yàn)楣仁褂玫氖寝见溍?，徐瀾等采用的是超聲波輔助水提法。由此可見(jiàn)，對(duì)于未脫殼的藜麥籽實(shí)體，采用纖維素酶提取多糖，可顯著增加多糖得率。

傅里葉紅外光譜測(cè)定表明，本研究獲得的藜麥多糖具有糖類(lèi)化合物紅外特征峰。紫外光譜顯示，純化后的藜麥多糖不含核酸和蛋白質(zhì)。多糖類(lèi)化合物是由糖苷鍵結(jié)合、聚合程度不同的物質(zhì)所混合的高分子碳水化合物，具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤和降血糖等生物活性［1］。從抗氧化性來(lái)看，隴藜1號(hào)藜麥籽實(shí)多糖對(duì)羥自由基和DPPH 自由基清除效果顯著，對(duì)ABTS+自由基清除作用一般。藜麥多糖含量豐富，具有無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)殘留、無(wú)抗藥性等特點(diǎn)，未來(lái)開(kāi)發(fā)利用前景廣闊。

4 結(jié)論

纖維素酶可促使纖維素和半纖維素分解，提高多糖提取率。影響未脫殼藜麥籽實(shí)多糖提取率的主要因素依次為提取溫度>提取時(shí)間>酶濃度>料液比，在提取時(shí)間為2.0 h、溫度為60 ℃、料液比1∶20、纖維素酶濃度5%的條件下，其多糖提取率可達(dá)到5.16%左右?？寡趸允窃u(píng)價(jià)多糖的重要指標(biāo)之一，隴藜1號(hào)藜麥籽實(shí)多糖對(duì)羥自由基、DPPH 自由基清除率效果好，對(duì)ABTS+自由基清除率相對(duì)較低。