活動性肺結(jié)核免疫耗竭及免疫治療的研究進(jìn)展

彭 濤，如克亞木·阿不都沙拉木，房 珂，宋維維，丁萌譞，謝 娜，舒占鈞

結(jié)核病是慢性感染性疾病，目前以抗結(jié)核藥物治療為主。而機(jī)體的免疫功能對結(jié)核病患者病情的發(fā)展至關(guān)重要，抗結(jié)核治療的效果以及后期復(fù)發(fā)與否與患者免疫功能的強(qiáng)弱關(guān)系密切。在活動性肺結(jié)核患者的疾病進(jìn)程中，結(jié)核分枝桿菌（結(jié)核桿菌）長期刺激宿主的免疫細(xì)胞可導(dǎo)致這些免疫細(xì)胞功能耗竭，在免疫耗竭的狀態(tài)下宿主免疫細(xì)胞不能對結(jié)核桿菌產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，從而使結(jié)核桿菌不斷增殖，導(dǎo)致在某些時候單純采用抗結(jié)核藥物治療的難度增大。胸腺肽和細(xì)胞因子可以增強(qiáng)T細(xì)胞對結(jié)核桿菌的免疫應(yīng)答，過繼免疫細(xì)胞治療通過外源性補(bǔ)充免疫細(xì)胞的方式提高患者的細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而以輔助治療的方式改善免疫耗竭的狀況，使結(jié)核桿菌能被更好的清除。

1 免疫耗竭的概念及表現(xiàn)

“免疫耗竭”是用來描述當(dāng)免疫細(xì)胞在受到高劑量抗原持續(xù)刺激的情況下所導(dǎo)致的一種免疫細(xì)胞功能受損的狀態(tài)。該詞的由來可以追溯到20世紀(jì)60～70年代。正常的效應(yīng)T細(xì)胞通常會在病原體被清除、炎癥被消除后死亡或分化為記憶T細(xì)胞。但20世紀(jì)90年代Zajac等[1]在感染淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)膜腦膜炎病毒的小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了某種特殊表型的CD8+T細(xì)胞，這種CD8+T細(xì)胞可以持續(xù)存在但不具備正常的抗病毒的免疫效應(yīng)，即不能激發(fā)其正常的細(xì)胞毒性和有效產(chǎn)生IFN-γ，這些CD8+T細(xì)胞似乎在進(jìn)行一種持續(xù)而無效的努力。這種特殊的狀態(tài)被稱為“免疫耗竭”，CD8+T細(xì)胞的免疫耗竭可以看成是分化為記憶CD8+T細(xì)胞的程序發(fā)生了改變[2]。

現(xiàn)以CD8+T細(xì)胞舉例說明免疫耗竭的表現(xiàn)。與正常的效應(yīng)CD8+T細(xì)胞以及正常的記憶CD8+T細(xì)胞相比，耗竭的CD8+T細(xì)胞存在許多不同之處，主要表現(xiàn)在以下幾個方面。第一，免疫效應(yīng)功能逐步受損[3]。開始首先是IL-2的產(chǎn)生減少，然后產(chǎn)生減少的是TNF，到了CD8+T細(xì)胞嚴(yán)重耗竭階段的時候IFN-γ的產(chǎn)生減少[4]。第二，多種抑制性受體（inhibitory receptors, IRs）上調(diào)并且持續(xù)表達(dá)[5]。這些IRs本來功能是為了防止免疫應(yīng)答進(jìn)行過度而引起病理性免疫反應(yīng)或自身免疫反應(yīng)，但是其過度持續(xù)地表達(dá)會抑制CD8+T細(xì)胞的免疫功能。這些抑制性受體主要有：程序性死亡受體1（programmed death 1, PD-1）、淋巴細(xì)胞活化基因3、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4、T細(xì)胞免疫球蛋白粘液素結(jié)合區(qū)域3（T cell immunoglobulin mucin 3 polypeptide N terminal,TIM-3）、含Ig及免疫受體酪氨酸抑制基序結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞免疫受體等，目前對PD-1的研究較多。第三，增殖能力的改變[6]。正常情況下通過IL-7和IL-15的介導(dǎo)，正常的記憶CD8+T細(xì)胞可以進(jìn)行穩(wěn)態(tài)增殖，具有不依賴抗原而實現(xiàn)自我更新的特性，而耗竭的CD8+T細(xì)胞由于信號通路的缺陷，不具備這種特性，它是通過抗原信號來維持其持續(xù)增殖[7-8]（見圖1）。第四，細(xì)胞代謝的改變。由于PD-1抑制磷酸肌醇3激酶和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路，直接影響代謝途徑的信號，導(dǎo)致耗竭的CD8+T細(xì)胞對葡萄糖的攝取減少和線粒體能量代謝失調(diào)[9]。第五，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和表觀遺傳學(xué)的改變。耗竭的CD8+T細(xì)胞具有和正常的記憶CD8+T細(xì)胞不同的轉(zhuǎn)錄程序[10]。

圖1 T細(xì)胞耗竭示意圖[7]Figure 1 Schematic diagram of T cell exhaustion[7]

除了CD8+T細(xì)胞之外，CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞均可發(fā)生類似的免疫耗竭。

2 活動性肺結(jié)核與免疫耗竭

肺結(jié)核是一種慢性傳染病，由結(jié)核桿菌感染引起，是最嚴(yán)重的傳染病之一。機(jī)體免疫力的強(qiáng)弱與結(jié)核病的發(fā)展密切相關(guān)，固有免疫和適應(yīng)性免疫均參與到了抗結(jié)核感染當(dāng)中。

固有免疫是機(jī)體抵抗結(jié)核桿菌感染的第一道防線。包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（dentritic cell,DC）、中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞在內(nèi)的固有免疫細(xì)胞可以通過多種模式識別受體（pattern recognition receptors, PRRs）識別結(jié)核桿菌。PRRs再啟動與固有免疫防御相關(guān)的多種細(xì)胞功能，包括吞噬、細(xì)胞凋亡、自噬、炎性小體的激活[11]。而結(jié)核桿菌也可以通過多種機(jī)制逃避機(jī)體的固有免疫，例如細(xì)胞溶質(zhì)的逃逸，抑制抗菌肽的產(chǎn)生，抑制吞噬體成熟，抑制細(xì)胞凋亡，抑制自噬作用，抑制炎性小體激活[12]。

機(jī)體抗結(jié)核免疫效應(yīng)的正常發(fā)揮還依賴于適應(yīng)性免疫中的細(xì)胞免疫。由于結(jié)核桿菌是胞內(nèi)寄生菌，而由CD4+T細(xì)胞分化的Th1分泌的IFN-γ可促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧中介物和活性氮中介物殺傷其已吞噬的結(jié)核桿菌。而且Th1還能輔助CD8+T細(xì)胞的增殖分化，促使CD8+T細(xì)胞也分泌IFN-γ來激活巨噬細(xì)胞殺滅其已吞噬的結(jié)核桿菌，或者使CD8+T 細(xì)胞直接通過釋放顆粒酶、穿孔素導(dǎo)致感染結(jié)核桿菌的巨噬細(xì)胞被溶解，從而殺死巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核桿菌[13]。所以，在抗結(jié)核桿菌感染的過程中，CD4+T細(xì)胞發(fā)揮著重要的作用[14]。

Roberts等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，相比于對照組，涂陽肺結(jié)核患者體內(nèi)Th1內(nèi)的IFN-γ減少，并且在應(yīng)對卡介苗刺激的應(yīng)答過程中，叉頭狀家族轉(zhuǎn)錄因子FOXP3、TNF-β和IL-4 mRNA的表達(dá)增加，暗示著這組患者出現(xiàn)了免疫抑制。Jayaraman等[16]的研究表明，在感染早期，結(jié)核桿菌特異性的CD4+T細(xì)胞還能夠分泌一些IFN-γ、IL-2和TNF，可是隨著感染進(jìn)展，這些結(jié)核桿菌特異性CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2減少，產(chǎn)生TNF的能力也逐漸下降，并且表達(dá)多種抑制性受體。Day等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，與潛伏性結(jié)核感染者相比，活動性結(jié)核病患者體內(nèi)結(jié)核桿菌特異性CD4+T細(xì)胞的增殖能力嚴(yán)重下降。這些都提示CD4+T細(xì)胞功能出現(xiàn)障礙，進(jìn)入了免疫耗竭。由于處于免疫耗竭狀態(tài)的CD4+T細(xì)胞不能有效地介導(dǎo)抗結(jié)核桿菌的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，導(dǎo)致結(jié)核桿菌不斷增殖，進(jìn)而造成結(jié)核病的不斷進(jìn)展。

CD8+T細(xì)胞對于控制結(jié)核桿菌感染也非常重要。和CD4+T細(xì)胞一樣，CD8+T細(xì)胞也能夠產(chǎn)生一些與抗結(jié)核桿菌感染相關(guān)的重要細(xì)胞因子，如TNF、IL-2和IFN-γ[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠慢性感染時CD8+T細(xì)胞的減少導(dǎo)致結(jié)核桿菌數(shù)量增加，表明CD8+T細(xì)胞對于控制結(jié)核感染是必要的[19]。但是Day等[20]通過結(jié)核桿菌慢性感染的小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，在抗結(jié)核免疫中結(jié)核桿菌特異性CD8+T細(xì)胞的多功能活性減弱，其增殖能力也有所下降，TNF-α、IL-2和IFN-γ的生成也有減少。并且其在后續(xù)的研究中還發(fā)現(xiàn)，在結(jié)核桿菌慢性感染的小鼠模型以及活動性結(jié)核病患者體內(nèi)，抑制性受體在CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)增高[17]。這些都表明CD8+T細(xì)胞出現(xiàn)了免疫耗竭。處于耗竭狀態(tài)的CD8+T細(xì)胞不能有效地參與對抗結(jié)核桿菌的免疫應(yīng)答，會出現(xiàn)細(xì)胞毒性功能受損[21]，即顆粒酶和穿孔素等細(xì)胞毒性分子的產(chǎn)生減少[22]，不能很好地殺傷被結(jié)核桿菌感染的靶細(xì)胞，從而導(dǎo)致結(jié)核桿菌在體內(nèi)的載量不斷升高。

3 免疫治療

3.1 肺結(jié)核難治的原因 當(dāng)抗結(jié)核藥物把結(jié)核桿菌清除后，免疫細(xì)胞受到結(jié)核桿菌持續(xù)刺激的狀況得到解除，免疫耗竭也就得到改善。然而，單純依賴抗結(jié)核藥物治療活動性肺結(jié)核存在很多困難。朱培福等[23]認(rèn)為，年齡大、生理功能減弱、同時合并嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病、肺組織結(jié)核空洞的形成以及外周淋巴細(xì)胞出現(xiàn)明顯的調(diào)亡，致使患者免疫功能下降，是導(dǎo)致肺結(jié)核難治的主要原因。當(dāng)然，其他原因還有結(jié)核桿菌耐藥、患者服藥依從性差、醫(yī)療機(jī)構(gòu)新的有效抗結(jié)核藥物品種不足等。這些原因使得體內(nèi)結(jié)核桿菌載量居高不下，持續(xù)地刺激機(jī)體免疫細(xì)胞，導(dǎo)致免疫細(xì)胞耗竭，耗竭的免疫細(xì)胞不能發(fā)揮有效的抗結(jié)核免疫應(yīng)答，并且還使得結(jié)核肉芽腫的形成不典型，不能將結(jié)核桿菌的感染局限化[24]，從而又使體內(nèi)的結(jié)核桿菌載量進(jìn)一步增加，形成惡性循環(huán)。所以，免疫耗竭可能是導(dǎo)致肺結(jié)核發(fā)病以及難治的機(jī)制之一。

3.2 胸腺肽治療 胸腺肽是從動物胸腺組織提取的一組可溶性的多肽混合物，可輔助T細(xì)胞的發(fā)育，增強(qiáng)T細(xì)胞對抗原的免疫應(yīng)答，常用于輔助治療臨床上各種免疫功能降低的疾病，臨床常用的主要有胸腺五肽和胸腺素α1。任萍[25]的臨床研究顯示，在常規(guī)抗結(jié)核治療的同時，加用胸腺肽治療，CD3+T細(xì)胞、CD4+/CD8+水平的提升幅度會比單純采用抗結(jié)核藥物治療更大。Liu等[26]的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，胸腺素α1輔助治療能降低患者耗竭CD8+T細(xì)胞上抑制性受體Tim-3和PD-1的表達(dá)，使嚴(yán)重T細(xì)胞減少患者的CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞數(shù)量得以恢復(fù)，逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞的耗竭，從而降低了病死率。孫瑩等[27]通過Meta分析發(fā)現(xiàn)，胸腺肽聯(lián)合基礎(chǔ)抗結(jié)核藥物治療患者的病灶吸收率、肺空洞縮小及閉合率、3個月痰培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰率方面均優(yōu)于單用基礎(chǔ)抗結(jié)核藥治療患者。所以，胸腺肽也許可作為一種輔助治療的方式改善活動性肺結(jié)核患者的T細(xì)胞耗竭。

3.3 細(xì)胞因子治療 被用于結(jié)核病輔助治療研究的一些常用細(xì)胞因子主要有IFN-γ、IL-2、人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF） 等。20世 紀(jì)90年代，Raad等[28]在1例耐多藥的腦和脊髓結(jié)核患者使用過6種抗結(jié)核藥物治療無明顯效果后，對其使用IFN-γ與粒細(xì)胞集落刺激因子聯(lián)合輔助治療，治療5個月時，患者的神經(jīng)系統(tǒng)實質(zhì)以及影像學(xué)方面出現(xiàn)了明顯的改善，持續(xù)治療12個月時，大腦和脊髓病變完全消失。Gao等[29]的系統(tǒng)綜述中，IFN-γ輔助治療，尤其是氣霧劑治療，可能對結(jié)核病患者有益。但是劉其會等[30]認(rèn)為，IFN-γ輔助治療的臨床效果不是很理想，持續(xù)時間短暫。T細(xì)胞耗竭時，IFN-γ是其所缺乏的重要細(xì)胞因子，結(jié)合上述分析，使用IFN-γ輔助治療可能會對結(jié)核病患者T細(xì)胞耗竭有所改善，但是近年來關(guān)于IFN-γ治療結(jié)核病的相關(guān)研究較少，還需要多中心的大規(guī)模的臨床試驗來對其安全性和療效進(jìn)行評估。

IL-2也是結(jié)核病細(xì)胞因子輔助治療研究中的常用細(xì)胞因子之一。Zhang等[31]的Meta分析顯示，IL-2的輔助免疫治療可以促進(jìn)結(jié)核病患者CD4+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖和分化，改善宿主免疫功能，還可以提高耐多藥結(jié)核病患者痰涂片和痰培養(yǎng)的轉(zhuǎn)陰率，從而控制肺結(jié)核病情的進(jìn)展，但對結(jié)核病患者的胸部影像學(xué)并沒有明顯的改善。

GM-CSF最初被定義為造血生長因子，因為它能促使骨髓祖細(xì)胞增殖和分化形成粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落[32]。作為重要抗原提呈細(xì)胞的DC也屬于髓系細(xì)胞，GM-CSF對于DC的增殖和成熟來說至關(guān)重要。Chuang等[33]創(chuàng)造了一種新型白蛋白融合GM-CSF的分子，它能增加結(jié)核病小鼠的肺和引流淋巴結(jié)內(nèi)DC的數(shù)量，增加抗原的提呈，從而使T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答能被有效地激活，改善T細(xì)胞耗竭，降低小鼠體內(nèi)的結(jié)核桿菌載量，具有一定應(yīng)用前景。張雍容等[34]的小鼠模型試驗表明，當(dāng)IL-2或GM-CSF其中之一與抗結(jié)核藥物聯(lián)合治療時，在抑菌率上并沒有表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，但是小鼠肺組織的病理損傷有明顯的減弱。然而相比于單純采用抗結(jié)核藥物治療，IL-2和GM-CSF共同參與的輔助免疫治療聯(lián)合抗結(jié)核藥物治療不僅能減少肺部損傷，還能更有效地提高抑菌率，而且還能比其他治療組在提高小鼠存活率上有明顯優(yōu)勢。所以，多種細(xì)胞因子聯(lián)合使用應(yīng)該可以作為在抗結(jié)核藥物基礎(chǔ)上輔助治療活動性肺結(jié)核免疫耗竭的策略之一。

3.4 過繼免疫細(xì)胞治療 過繼免疫細(xì)胞治療是一種將自體或異體的免疫細(xì)胞在體外用細(xì)胞因子激活、擴(kuò)增后再輸給患者，從而直接殺傷抗原的被動免疫治療。Xu等[35]報道了1例將細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞（cytokine-induced killer, CIK）過繼免疫細(xì)胞療法聯(lián)合二線抗結(jié)核藥物用于耐多藥結(jié)核病患者治療的個案，顯示出了較好的療效。唐佩軍[13]的一項關(guān)于CIK聯(lián)合抗結(jié)核藥物治療的隨機(jī)對照試驗顯示，CIK與抗結(jié)核藥物聯(lián)合使用可以明顯緩解耐多藥肺結(jié)核患者的呼吸道癥狀、痰檢情況以及肺部病灶的吸收情況。Zhao等[36]的Meta分析顯示，細(xì)胞治療具有較好的安全性。Ramos-Espinosa等[37]也表示有證據(jù)支持其有效性和安全性?；顒有苑谓Y(jié)核患者處于免疫耗竭時，體內(nèi)耗竭的免疫細(xì)胞不能對結(jié)核桿菌產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，所以將免疫細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增后再回輸給患者，以補(bǔ)充體內(nèi)細(xì)胞免疫應(yīng)答的不足，不失為一種有效的策略。

4 結(jié) 論

活動性肺結(jié)核患者體內(nèi)的結(jié)核桿菌長期持續(xù)地刺激免疫細(xì)胞可引起免疫耗竭，處于免疫耗竭狀態(tài)下的免疫細(xì)胞難以像正常的免疫細(xì)胞那樣對結(jié)核桿菌發(fā)揮有效的免疫應(yīng)答，使患者體內(nèi)的結(jié)核桿菌載量不斷升高，導(dǎo)致在某些時候單純地使用抗結(jié)核藥物治療變得困難，從而容易使結(jié)核病不斷進(jìn)展。免疫耗竭可能是導(dǎo)致肺結(jié)核發(fā)病以及難治的機(jī)制之一。

胸腺肽和細(xì)胞因子可以增強(qiáng)T細(xì)胞對結(jié)核桿菌的免疫應(yīng)答，過繼免疫細(xì)胞治療通過外源性補(bǔ)充免疫細(xì)胞的方式提高患者的細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而以輔助治療的方式改善免疫耗竭。所以，抗結(jié)核藥物治療與多種免疫治療的聯(lián)合應(yīng)用也許是未來治療活動性肺結(jié)核患者免疫耗竭的有效手段。