意大利蜜蜂Ci蛋白的生物信息學(xué)分析

王 玨，于點點，郭 媛，郭麗娜

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西 太谷 030801）

0 引言

【研究意義】Hedgehog（Hh）信號通路在不同物種間具有一定的保守性，從昆蟲到人類均普遍存在，其主要功能是調(diào)節(jié)體節(jié)形成、胚胎發(fā)育及成體組織穩(wěn)態(tài)（王露林等，2021）。Hh信號通路活性的喪失會導(dǎo)致多種人類出生缺陷，包括前腦無裂畸形、多指畸形、顱面缺損和骨骼畸形（Huangfu and Anderson，2006）。在無脊椎動物中，轉(zhuǎn)錄因子（Cubitus interruptus，Ci）修飾是Hh信號通路轉(zhuǎn)錄激活前最后一個被識別的步驟。Ci可形成一個截斷的阻遏因子（CiR/Ci75）或基于Hh作為激活因子（CiA/Ci155）調(diào)控靶基因表達（Little et al.，2020）。在脊椎動物中，與Ci同源的膠質(zhì)母細胞瘤（Glioblastomas，Glis）在Hh信號通路調(diào)控中發(fā)揮著類似且更復(fù)雜的作用（Koh et al.，2021）。Hh信號通路在胚胎發(fā)育及組織穩(wěn)態(tài)期間參與一系列復(fù)雜的過程（Xiong et al.，2015）。因此，了解意大利蜜蜂Ci蛋白基本信息，明確其結(jié)構(gòu)特點及生物學(xué)功能，可為揭示Ci蛋白在意大利蜜蜂Hh信號通路中的作用機理和功能提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】Hh信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過轉(zhuǎn)錄因子Ci/Gli來實現(xiàn)（Shi et al.，2014）。Ci包含5個典型的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，具有高度保守性（Jiang，2022）。Ci也是Hh信號通路中唯一的轉(zhuǎn)錄因子，由1397個氨基酸殘基組成，可被切割成75 kD大小的轉(zhuǎn)錄抑制因子——CiR，且能同時激活轉(zhuǎn)錄靶點（Robbins et al.，2012）。Hh信號通路中其他成分蛋白的主要功能是調(diào)節(jié)Ci的分布及其活性，包括：（1）fu，一種特定的絲氨酸—蘇氨酸蛋白激酶（Maloverjan and Piirsoo，2012）；（2）fu抑制劑［Su（fu）］，與fu和Costal-2（Cos-2）發(fā)生物理作用（Oh et al.，2015）；（3）類運動蛋白Cos-2，與微管的高親和性結(jié)合被Hh信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)逆轉(zhuǎn)（Kalderon，2004）；（4）蛋白激酶A（PKA），其功能發(fā)揮需要抑制Hh 信號（Kotani，2012）；（5）CREB-結(jié)合蛋白（dCBP），一種被認為能直接與Ci結(jié)合的轉(zhuǎn)錄輔助激活因子（Chen et al.，2000）；（6）Slimb，一種含WD40的F-box蛋白，其功能是切割全長Ci（Smelkinson and Kalderon，2006）；（7）微管蛋白（Cohen，2003）。已有研究表明，在果蠅中Hh信號通路通過Ci發(fā)出信號控制幼蟲胚胎表皮細胞命運，細胞間相互作用產(chǎn)生分泌的信號分子成為Hh信號通路表達的一部分，分泌信號分子通常協(xié)同作用，進而調(diào)節(jié)細胞命運（Angelats et al.，2002）。因此，推測Ci蛋白在蜜蜂胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著控制幼蟲表皮細胞發(fā)育的作用?！颈狙芯壳腥朦c】Hh信號通路廣泛參與脊椎動物及無脊椎動物的發(fā)育過程，但至今尚無針對意大利蜜蜂Ci蛋白結(jié)構(gòu)及功能的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以意大利蜜蜂Ci蛋白為研究對象，利用在線生物信息學(xué)工具進行預(yù)測分析并闡述其功能，為揭示Ci蛋白在意大利蜜蜂Hh信號通路中的功能和作用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

使用NCBI-Smart BLAST檢索Ci蛋白的同源氨基酸序列，包括黑腹果蠅、斑馬魚、小鼠、人類及意大利蜜蜂Ci蛋白序列，均從NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）獲取。

1.2 試驗方法

使用在線生物信學(xué)分析軟件（表1）對意大利蜜蜂Ci信息數(shù)據(jù)庫進行結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測分析，包括ProtParam、SignalP-5.0、SoftBerry等。

表1 在線生物信息學(xué)分析軟件Table 1 Online software of bioinformatic and phylogenetic analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 意大利蜜蜂Ci蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果

利用ProtParam對意大利蜜蜂Ci蛋白進行理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示：意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型的開放閱讀框（ORF）為4338 bp，編碼1445個氨基酸殘基，編碼蛋白分子量為15.50 kD，理論等電點（pI）為8.39；包含20種常見的氨基酸，其中脯氨酸（Pro）含量最高（占11.2%）、色氨酸（Trp）含量最低（占0.5%）；蛋白分子結(jié)構(gòu)為C6586H10266N2056O2123S86，脂溶指數(shù)為49.51，總平均親水性為-0.806（屬于親水性蛋白），不穩(wěn)定系數(shù)為65.85（蛋白穩(wěn)定參數(shù)＜40為穩(wěn)定蛋白質(zhì)）。意大利蜜蜂Ci蛋白XP_006558245.2亞型的ORF為3873 bp，編碼1290個氨基酸殘基，編碼蛋白分子量為13.99 kD，pI為8.48；包含20種常見的氨基酸，其中絲氨酸（Ser）含量最高（占11.4%）、Trp含量最低（占0.5%）；蛋白分子結(jié)構(gòu)為C5909H9293N1849O1932S85，脂溶指數(shù)為50.26，總平均親水性為-0.849（屬于親水性蛋白），不穩(wěn)定系數(shù)為66.77。由于意大利蜜蜂Ci蛋白2個亞型的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，故推測意大利蜜蜂Ci為不穩(wěn)定蛋白。

2.2 意大利蜜蜂Ci蛋白信號肽及亞細胞定位預(yù)測結(jié)果

利用SignalP-5.0對意大利蜜蜂Ci蛋白進行信號肽預(yù)測，結(jié)果顯示，Ci蛋白XP_624136.4亞型和XP_006558245.2亞型的第1～20位氨基酸殘基間無信號肽（圖1），也無跨膜結(jié)構(gòu)（圖2），不屬于膜蛋白。以在線網(wǎng)站http://linux1.softberry.com/all.htm蛋白數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，對意大利蜜蜂Ci蛋白進行亞細胞定位預(yù)測，發(fā)現(xiàn)Ci蛋白XP_624136.4亞型主要定位于細胞核（占91.3%），在囊細胞質(zhì)中有少量分布（占8.7%）；Ci蛋白XP_006558245.2亞型主要定位于細胞核（占87.0%），8.7%位于囊細胞質(zhì)中，在線粒體中也有少量分布（占4.3%），表明意大利蜜蜂Ci參與維持蛋白完整性。

圖1 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型（左）和XP_006558245.2亞型（右）信號肽預(yù)測結(jié)果Fig.1 Signal peptide prediction of XP_624136.4 subtype（left）and XP_006558245.2 subtype（right）of Ci proteins in A.mellifera

圖2 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型（左）和XP_006558245.2亞型（右）跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.2 Transmembrane structure prediction of XP_624136.4 subtype（left）and XP_006558245.2 subtype（right）of Ci proteins in A.mellifera

2.3 意大利蜜蜂Ci蛋白糖基化位點、磷酸化位點和蘇木素化位點預(yù)測結(jié)果

分別利用NetOGlyc 3.1和NetPhos 3.1對意大利蜜蜂Ci蛋白的O-糖基化位點、N-糖基化位點和磷酸化位點進行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Ci蛋白XP_624136.4亞型3Thr（0.519）和248Thr（0.542）的2個O-糖基化位點均高于閾值0.50，說明其存在2個O-糖基化位點（圖3）；Ci蛋白XP_006558245.2亞型12Thr、39Thr、189Thr、205Thr、228Thr、244Thr、246Thr、251Thr、252Thr、256Thr、469Thr、640Thr、669Thr、682Thr、692Thr、707Thr、714Thr、841Thr、851Thr、863Thr、893Thr、929Thr、1070Thr、1113Thr、1246Thr和1273Thr的26個O-糖基化位點均高于閾值0.50，即存在26個O-糖基化位點（圖3）。Ci蛋白XP_624136.4亞型預(yù)測到127Thr（0.741）、171Thr（0.618）、255Thr（0.642）、402Thr（0.604）、550Thr（0.664）、790Thr（0.543）、871Thr（0.504）、1133Thr（0.593）和1402Thr（0.615）共9個N-糖基化位點（圖4），XP_006558245.2亞型預(yù)測到16Thr（0.638）、100Thr（0.659）、247Thr（0.618）、395Thr（0.679）、635Thr（0.557）、716Thr（0.515）、978Thr（0.614）和1247Thr（0.618）共8 個N-糖基化位點（圖4）。

圖3 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型（左）和XP_006558245.2亞型（右）O-糖基化位點預(yù)測結(jié)果Fig.3 O-glycosylation site prediction of XP_624136.4 subtype（left）and XP_006558245.2 subtype（right）of Ci proteins in A.mellifera

圖4 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型（左）和XP_006558245.2亞型（右）N-糖基化位點預(yù)測結(jié)果Fig.4 N-glycosylation site prediction of XP_624136.4 subtype（left）and XP_006558245.2 subtype（right）of Ci proteins in A.mellifera

意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型存在174個磷酸化位點，其中，磷酸絲氨酸位點127個（88Ser、89Ser、90Ser、110Ser、130Ser、138Ser、142Ser、166Ser、169Ser、173Ser、197Ser、203Ser、209Ser、210Ser、214Ser、218Ser、223Ser、229Ser、230Ser、231Ser、234Ser、241Ser、246Ser、249Ser、252Ser、257Ser、259Ser、260Ser、261Ser、263Ser、265Ser、274Ser、330Ser、333Ser、343Ser、362Ser、365Ser、370Ser、372Ser、376Ser、384Ser、385Ser、389Ser、417Ser、419Ser、464Ser、473Ser、510Ser、521Ser、536Ser、543Ser、554Ser、574Ser、575Ser、604Ser、613Ser、615Ser、617Ser、626Ser、628Ser、629Ser、631Ser、634Ser、636Ser、640Ser、643Ser、650Ser、703Ser、714Ser、733Ser、736Ser、766Ser、771Ser、773Ser、783Ser、789Ser、791Ser、794Ser、799Ser、802Ser、807Ser、810Ser、811Ser、814Ser、817Ser、828Ser、834Ser、838Ser、841Ser、842Ser、845Ser、848Ser、861Ser、863Ser、873Ser、901Ser、913Ser、922Ser、973Ser、980Ser、1011Ser、1026Ser、1033Ser、1034Ser、1041Ser、1060Ser、1068Ser、1071Ser、1076Ser、1085Ser、1176Ser、1192Ser、1221Ser、1235Ser、1239Ser、1292Ser、1296Ser、1360Ser、1362Ser、1366Ser、1378Ser、1393Ser、1406Ser、1411Ser、1430Ser、1432Ser和1433Ser），磷酸蘇氨酸位點32個（145Thr、167Thr、194Thr、344Thr、348Thr、373Thr、374Thr、383Thr、388Thr、390Thr、399Thr、400Thr、405Thr、406Thr、407Thr、432Thr、445Thr、493Thr、517Thr、552Tyr、567Thr、624Thr、667Thr、740Thr、770Tyr、795Tyr、824Tyr、837Thr、846Thr、847Thr、869Thr和909Tyr），磷 酸 色 氨酸位點15個（8Tyr、233Tyr、559Tyr、570Tyr、589Tyr、797Tyr、1020Tyr、1028Tyr、1043Tyr、1121Tyr、1331Tyr、1343Tyr、1379Tyr、1385Tyr和1440Tyr）（圖5）。Ci 蛋 白XP_006558245.2 亞 型 存 在156個磷酸化位點，其中，磷酸絲氨酸位點120個（11Ser、14Ser、18Ser、42Ser、48Ser、54Ser、55Ser、59Ser、63Ser、68Ser、74Ser、75Ser、76Ser、79Ser、86Ser、91Ser、94Ser、97Ser、102Ser、104Se、105Ser、106Ser、108Ser、110Ser、119Ser、175Ser、178Ser、188Ser、207Ser、210Ser、215Ser、217Ser、221Ser、229Ser、230Ser、234Ser、262Ser、264Ser、309Ser、318Ser、355Ser、366Ser、381Ser、388Ser、399Ser、419Ser、420Ser、449Ser、458Ser、460Ser、462Ser、471Ser、473Ser、474Ser、476Ser、479Ser、481Ser、485Ser、488Ser、495Ser、548Ser、559Ser、578Ser、581Ser、611Ser、616Ser、618Ser、628Ser、634Ser、636Ser、639Ser、644Ser、647Ser、652Ser、655Ser、656Ser、659Ser、662Ser、673Ser、679Ser、683Ser、686Ser、687Ser、690Ser、693Ser、706Ser、708Ser、718Ser、746Ser、758Ser、767Ser、818Ser、825Ser、856Ser、871Ser、878Ser、879Ser、886Ser、905Ser、913Ser、916Ser、921Ser、930Ser、1021Ser、1037Ser、1066Ser、1080Ser、1084Ser、1137Ser、1141Ser、1205Ser、1207Ser、1211Ser、1223Ser、1238Ser、1251Ser、1256Ser、1275Ser、1277Ser和1278Ser），磷酸蘇氨酸位點29個（12Thr、193Thr、219Thr、228Thr、245Thr、250Thr、252Thr、277Thr、290Thr、362Thr、412Thr、512Thr、585Thr、615Thr、640Thr、669Thr、682Thr、691Thr、692Thr、714Thr、841Thr、929Thr、953Thr、1004Thr、1041Thr、1056Thr、1071Thr、1113Thr和1252Thr），磷酸色氨酸位點7個（404Tyr、642Tyr、966Tyr、1176Tyr、1224Tyr、1230Tyr和1285Tyr）（圖5）。

圖5 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型（左）和XP_006558245.2亞型（右）磷酸化位點預(yù)測結(jié)果Fig.5 Phosphorylation site prediction of XP_624136.4 subtype（left）and XP_006558245.2 subtype（right）of Ci proteins in A.mellifera

意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型存在5個易發(fā)生蘇木素化的修飾位點（Score＞0.5），分別是642K（0.93）、398K（0.93）、770K（0.91）、1388K（0.84）和364K（0.61）（圖6）；XP_006558245.2亞型也存在5個易發(fā)生蘇木素化的修飾位點，分別是484K（0.93）、241K（0.93）、613K（0.91）、1231K（0.84）和206K（0.61）（圖7）。

圖6 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型蘇木素化位點預(yù)測結(jié)果Fig.6 Sumolation site prediction of XP_624136.4 subtype of Ci proteins in A.mellifera

圖7 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_006558245.2亞型蘇木素化位點預(yù)測結(jié)果Fig.7 Sumolation site prediction of XP_006558245.2 subtype of Ci proteins in A.mellifera

2.4 意大利蜜蜂Ci蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

蛋白多肽鏈在各種二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進一步盤曲或折疊形成具有一定規(guī)律的三維空間結(jié)構(gòu)，蛋白三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性主要靠次級鍵，包括氫鍵、疏水鍵、鹽鍵及范德華力等（羅鈞文，2022）。采用GOR4預(yù)測意大利蜜蜂Ci蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖8）顯示，XP_624136.4亞型二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占13.49%（195個氨基酸殘基）、延伸鏈占15.22%（220個氨基酸殘基）、無規(guī)則卷曲占71.28%（1030個氨基酸殘基）；XP_006558245.2亞型二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占11.47%（148個氨基酸殘基）、延伸鏈占15.58%（201個氨基酸殘基）、無規(guī)則卷曲占72.95%（941個氨基酸殘基）。

圖8 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型（上）和XP_006558245.2亞型（下）二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.8 Secondary structure prediction of XP_624136.4 subtype（up）and XP_006558245.2 subtype（down）of Ci proteins in A.mellifera

通過NCBI的CD-Search軟件，輸入Ci氨基酸序列即獲得該蛋白的模體預(yù)測結(jié)果。意大利蜜蜂Ci蛋白2個亞型均擁有5個典型的C2H2型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域（圖9），只是所處位點不同，說明該蛋白屬于SPF1家族。通過SWISS-MODEL預(yù)測意大利蜜蜂Ci蛋白三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，GMQE為0.07，QMEAN為0.67，蛋白氨基酸序列與2Gli.1.C模板序列具有高度相似性，相似性為81.94%，說明該模型具有相對合理的結(jié)構(gòu)，且2個亞型選取的合適模型相同。意大利蜜蜂Ci蛋白三級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲分布較多（圖10），此類結(jié)構(gòu)對生物學(xué)功能的發(fā)揮具有重要作用。

圖9 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型（上）和XP_006558245.2亞型（下）模體結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.9 Motif structure prediction XP_624136.4 subtype（up）and XP_006558245.2 subtype（down）of Ci proteins in A.mellifera

圖10 意大利蜜蜂Ci蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.10 Tertiary structure prediction of Ci proteins in A. mellifera

基于意大利蜜蜂Ci蛋白三級結(jié)構(gòu)構(gòu)象和同源蛋白相似性波形圖，進一步對預(yù)測模型的可靠性進行驗證，采用The Structure Analysis and Verification Server對預(yù)測模型進行拉曼圖分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)意大利蜜蜂Ci蛋白2個亞型均顯示預(yù)測的蛋白殘基二面角位于黃色核心區(qū)域（圖11）。該區(qū)域構(gòu)象是立體化學(xué)允許區(qū)，可穩(wěn)定存在，說明該模型的構(gòu)象符合立體化學(xué)規(guī)則。

圖11 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型（左）和XP_006558245.2亞型（右）三級結(jié)構(gòu)模型拉曼圖Fig.11 Ramachandran map of tertiary structure predication of XP_624136.4 subtype（left）and XP_006558245.2 subtype（right）of Ci proteins in A.mellifera

2.5 意大利蜜蜂Ci蛋白結(jié)構(gòu)域與物種同源性分析結(jié)果

通過SMART對意大利蜜蜂Ci蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)意大利蜜蜂Ci蛋白具有5個典型的C2H2型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域（圖12）。XP_624136.4亞型的C2H2型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域分別位于第432～457位、第465～492位、第498～522位、第528～553位和第559～584位氨基酸殘基處，能與DNA結(jié)合而激活靶蛋白轉(zhuǎn)錄；還有13個低復(fù)雜性區(qū)域，分別位于第17～86位、第88～132位、第214～231位、第251～272位、第284～333位、第396～411位、第593～613位、第626～640位、第704～712位、第836～851位、第913～922位、第1256～1272 位 和 第1310～1321 位 氨 基 酸 殘 基 處。XP_006558245.2亞型的C2H2型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域分別位于第277～302位、第310～337位、第343～367位、第373～398位和第404～429位氨基酸殘基處；還有11個低復(fù)雜性區(qū)域，分別位于第59～76位、第96～117位、第129～178位、第241～256位、第438～458位、第471～485位、第549～557位、第681～696位、第758～767位、第1101～1117位和第1155～1166位氨基酸殘基處。

圖12 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型（上）和XP_006558245.2亞型（下）保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果Fig.12 Conserved domain prediction of XP_624136.4 subtype（up）and XP_006558245.2 subtype（down）of Ci proteins in A.mellifera

使用NCBI的BLAST 檢索Ci蛋白同源氨基酸序列，結(jié)果顯示，意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型與黑腹果蠅A型和B型及小鼠、人類、斑馬魚具有較高的氨基酸序列相似性，對應(yīng)的相似性分別為59%、57%、51%、47%和31%（圖13）；XP_006558245.2亞型與黑腹果蠅A型和B型的氨基酸序列相似度均為64%，與小鼠、人類、斑馬魚的氨基酸序列相似性分別為58%、52%和34%（圖14）。同時以DNAMAN對意大利蜜蜂Ci蛋白2個亞型氨基酸序列進行對比，并使用MEGA 11.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果顯示在昆蟲中意大利蜜蜂Ci蛋白的2條氨基酸序列均與黑腹果蠅A型的親緣關(guān)系較近（圖15），即意大利蜜蜂Ci蛋白在昆蟲到哺乳動物間的保守性較高，與多重序列比對結(jié)果一致。

圖13 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型與其他物種Ci氨基酸序列的比對分析結(jié)果Fig.13 Alignment of amino acid sequences of XP_624136.4 subtype of Ci proteins in A.mellifera sequence with Ci amino acid sequences in other species

圖14 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_006558245.2亞型與其他物種Ci氨基酸序列的比對分析結(jié)果Fig.14 Alignment of amino acid sequences of XP_006558245.2 subtype of Ci proteins in A.mellifera sequence with Ci amino acid sequences in other species

圖15 基于Ci蛋白氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.15 Phylogenetic tree based on Ci protein amino acid sequence similarity

2.6 意大利蜜蜂Ci蛋白的互作蛋白預(yù)測結(jié)果

通過String數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析與意大利蜜蜂Ci蛋白發(fā)生相互作用的蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)意大利蜜蜂Ci蛋白2個亞型的序列構(gòu)象相同，均與kinesin-B、Ptc、Poz、Su（fu）、slmb、smo、Csnk1a1、cul-3和fu等驅(qū)動蛋白樣蛋白（Kines in family member）形成相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖16）。

圖16 意大利蜜蜂Ci蛋白的互作蛋白網(wǎng)絡(luò)Fig.16 Interacting protein network of Ci proteins in A. mellifera

3 討論

Hh信號通路對脊椎動物和無脊椎動物的發(fā)育至關(guān)重要（Liu，2019），但目前鮮見針對Hh信號通路中Ci蛋白的相關(guān)研究報道。本研究通過探析意大利蜜蜂Ci蛋白的基本生物學(xué)信息，發(fā)現(xiàn)意大利蜜蜂Ci蛋白屬于不穩(wěn)定的兩性蛋白（總平均親水性在-0.5～0.5時為兩性蛋白），無信號肽，無跨膜結(jié)構(gòu)，具有5個典型的C2H2型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，能與DNA結(jié)合而激活靶蛋白轉(zhuǎn)錄，與Hh信號通路中Suppressor of Fused與Gli/Ci蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)及功能研究結(jié)果（張燕，2014）一致；亞細胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型定位在細胞核及囊細胞質(zhì)中，XP_006558245.2亞型定位于細胞核、囊細胞質(zhì)和線粒體中，與Wang和Holmgren（2000）報道的果蠅Ci蛋白僅定位于細胞核的研究結(jié)論有所不同，說明意大利蜜蜂Ci參與維持細胞正常形態(tài)，具有運輸及結(jié)合的作用。Hh蛋白通過與Patched受體結(jié)合，激活Smoothened蛋白（smo），并最終改變Gli/Ci家族蛋白的轉(zhuǎn)錄活性（Zhou and Kalderon，2010），即Hh信號輸出的決定因素是Gli/Ci轉(zhuǎn)錄因子活性（Pan et al.，2017）。

蛋白翻譯后修飾通過功能基團或蛋白的共價添加、調(diào)節(jié)亞基蛋白水解切割或整個蛋白降解來增加蛋白組功能多樣性，包括磷酸化、糖基化、泛素化、亞硝基化、甲基化、乙?；?、脂質(zhì)化和蛋白水解，幾乎影響正常細胞生物學(xué)及發(fā)病機制的所有過程（Jiang，2022）。蛋白磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白活力與功能最基本、最普遍、最重要的作用機制（Lee et al.，2019），同時調(diào)節(jié)多種細胞過程，如基因表達、代謝、細胞周期調(diào)節(jié)、分化及凋亡（Cohen，2002）。蛋白糖基化是翻譯后最常見、最復(fù)雜的修飾之一，不僅極大地促進生物體蛋白組的擴展，超出基因組編碼范圍，還對蛋白的功能、穩(wěn)定性、亞細胞定位等有重要影響（Eichler，2019）。蘇木素化能調(diào)節(jié)細胞過程，如核運輸、轉(zhuǎn)錄、染色體分離和DNA修復(fù)等（Gareau and Lima，2010），其發(fā)揮的具體作用包括改變底物與DNA、RNA或其他蛋白的相互作用，改變蛋白構(gòu)象或酶活性，以及調(diào)節(jié)其他修飾（Flotho and Melchior，2013）。本研究結(jié)果表明，意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型存在2個O-糖基化位點、174個磷酸化位點及5個蘇木素化位點，XP_006558245.2亞型存在26個O-糖基化位點、156個磷酸化位點及5個蘇木素化位點。雖然意大利蜜蜂Ci蛋白為不穩(wěn)定蛋白，但磷酸化、糖基化和蘇木素化促使Ci蛋白變得穩(wěn)定，在細胞發(fā)育、細胞間信號傳遞及神經(jīng)細胞功能調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

基于Ci蛋白氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示，從昆蟲到哺乳動物Ci蛋白序列高度保守。意大利蜜蜂Ci蛋白二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲、延伸鏈分布較多，α-螺旋分布較少，其三級結(jié)構(gòu)中長鏈卷曲較多；同時意大利蜜蜂Ci蛋白與kinesin-B、Ptc、Poz、Su（fu）、slmb、smo、Csnk1a1、cul-3和fu等驅(qū)動蛋白樣蛋白形成相互作用網(wǎng)絡(luò)。已有研究表明，介導(dǎo)Ci 轉(zhuǎn)錄的Hh 蛋白可結(jié)合到十二通道跨膜受體Patched蛋白（Ptc）上，從而解除Ptc介導(dǎo)的smo抑制七通道跨膜蛋白（Han et al.，2019）；激活的smo又反向進行一系列復(fù)雜過程，包括抑制Ci抑制因子的加工及翻譯后修飾，促進全長Ci在細胞質(zhì)中積累與激活（Lum and Beachy，2004；Jiang and Hui，2008），最終全長Ci激活因子移位進入細胞核并刺激Hh靶蛋白表達，這些靶蛋白在細胞命運的進一步規(guī)范中發(fā)揮作用。Gli/Ci蛋白家族由多個結(jié)構(gòu)域組成，含有不同的蛋白基序及其行使功能的相關(guān)修飾位點；而Ci/Gli轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定性調(diào)控是調(diào)節(jié)Hh信號活性的重要途徑（周紫章，2015）。由此可見，意大利蜜蜂Ci蛋白在生長發(fā)育、跨膜運輸、突觸傳遞、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白生成過程中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

意大利蜜蜂Ci蛋白屬于不穩(wěn)定的兩性蛋白，主要定位于細胞核中，少量分布在囊細胞質(zhì)或線粒體中，具有5個典型的C2H2型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，蛋白序列高度保守，在意大利蜜蜂Hh信號通路中主要承擔(dān)轉(zhuǎn)錄功能，對意大利蜜蜂的生長發(fā)育、跨膜運輸、突觸傳遞、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及蛋白生成等起重要調(diào)控作用。