1株白魔芋軟腐病病原菌鑒定及其室內(nèi)藥劑篩選

羅林麗，趙興麗，周羅娜，賀圣凌，劉思睿，張 欣，羅 可，周玉鋒

（1貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 貴州 貴陽 550006；2貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550006；3貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所, 貴州 貴陽 550006）

0 引言

【研究意義】魔芋（Amorphophallus）是天南星科魔芋屬多年生草本植物的總稱，栽培學(xué)上屬薯芋類作物，葡甘聚糖型魔芋是目前發(fā)現(xiàn)的僅有幾種能合成葡甘露聚糖（Konjac glucomannan，KGM）的經(jīng)濟(jì)作物之一（劉佩瑛，2004；代雪鳳等，2021）。魔芋KGM因獨(dú)特的理化特性已被廣泛用于食品、醫(yī)療、日用化工和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，具有廣闊的市場前景（Yuan et al.，2018；Zhang et al.，2018；李嘉欣等，2020；Du et al.，2021；夏玉婷等，2022）。白魔芋（A.albus）為我國特有種，自然分布于四川南部和云南北部的金沙江干熱河谷地區(qū)（劉佩瑛，2004），與傳統(tǒng)種植的花魔芋（A.konjac）和珠芽魔芋（A.bulbifer）相比，白魔芋在KGM含量和品質(zhì)上更具優(yōu)勢，且因其在耐熱性、抗病性、抗褐變等方面強(qiáng)于花魔芋和珠芽魔芋，所以近年來被引種到貴州、湖北、云南、重慶等地（劉二喜，2016）。近年來，隨著魔芋市場需求的不斷增長，魔芋人工種植呈現(xiàn)規(guī)模化，魔芋病害也越來越嚴(yán)重，軟腐病、根腐病等多種病害嚴(yán)重制約著魔芋產(chǎn)量的提高，其中以魔芋軟腐病最嚴(yán)重。魔芋軟腐病是一種細(xì)菌性病害，其侵染性強(qiáng)，魔芋整個生活周期均可染病，該病害傳播快、防治難，迄今為止尚無特效防治方法（徐佳欣等，2018）。因此，明確魔芋軟腐病病原的種類，并針對性地開展藥劑篩選，對魔芋軟腐病的田間防控具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】已報(bào)道的魔芋軟腐病病原主要是果膠桿菌屬（Pectobacterium）和迪基氏菌屬（Dickyeya）菌株。最早的研究認(rèn)為魔芋軟腐病病原菌為胡蘿卜歐文氏菌胡蘿卜亞種［Erwinia carotovorasubsp.carotovora，后更名為胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種（P.carotovorumsubsp.carotovorum）］，該菌株會因宿主作物的不同而表現(xiàn)出不同強(qiáng)弱的致病力（沈業(yè)壽和儲蘇，2002；劉佩瑛，2004）。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，相關(guān)研究在形態(tài)和生理生化分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合16S～23S rDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的序列分析鑒定花魔芋軟腐病的病原菌主要是胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種和菊果膠桿菌［P.chrysanthemi，后被更名為菊迪基氏菌（D.chrysanthemi）］2種（修建華等，2006；王健等，2009；Wu et al.，2011；孫苗苗，2019；Sun et al.，2019）。近年又發(fā)現(xiàn)了其他的魔芋軟腐病病原，魏環(huán)宇等（2020）基于形態(tài)學(xué)觀察和生理生化及16S rDNA序列分析，將從云南珠芽魔芋分離到的軟腐病致病菌鑒定為環(huán)狀果膠桿菌（P.aroidearum）；Wei等（2020）首次報(bào)道環(huán)狀果膠桿菌引起花魔芋軟腐?。淮揠p等（2021）從云南魔芋產(chǎn)區(qū)的發(fā)病植株中分離到3株魔芋軟腐病致病菌，通過形態(tài)、致病性和分子特征分析鑒定3株菌株均為環(huán)狀果膠桿菌；李珩珺（2021）分別從患病的珠芽魔芋和花魔芋中分離軟腐病菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和16S rDNA鑒定確定環(huán)狀果膠桿菌為花魔芋的致病菌，而導(dǎo)致珠芽魔芋患軟腐病的是一株未知菌株，尚未確定。在生產(chǎn)實(shí)踐中，魔芋軟腐病的防治存在一定困難，通過合理密植、輪作、間套作等栽培措施，可在一定程度上降低發(fā)病率。實(shí)際生產(chǎn)中魔芋軟腐病防治主要依賴化學(xué)藥劑，但多選用廣譜殺菌劑，存在一定盲目性，常用藥劑有各種含銅制劑、異氰尿酸類殺菌劑、噻唑類等（古洪輝等，2018；王紅巖等，2019）。李江濤（2014）研究表明72%農(nóng)用硫酸鏈霉素灌根處理對魔芋軟腐病的防治效果達(dá)89%。和積飛（2018）通過田間藥效試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)20%葉枯唑可濕性粉劑和20%噻菌銅懸浮劑對魔芋軟腐病的防治效果優(yōu)于72%硫酸鏈霉素可溶性粉劑和53.8%氫氧化銅水分散粒劑?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本課題組在前期的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)貴州省興義市安龍縣白魔芋種植基地出現(xiàn)了一種細(xì)菌性病害，而白魔芋一直被認(rèn)為是抗病性較強(qiáng)的品種，目前未見白魔芋軟腐病方面的研究報(bào)道，因此有必要開展白魔芋軟腐病病原菌鑒定和防治藥劑篩選工作?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用平板劃線分離法對白魔芋軟腐病病原菌進(jìn)行分離純化，結(jié)合形態(tài)、致病性和分子生物學(xué)分析鑒定病原菌種類，并探究13種殺菌劑對病原菌的室內(nèi)抑制活性，以期為白魔芋軟腐病田間防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病樣來源 病樣于2020年6月采自貴州省興義市安龍縣白魔芋種植基地發(fā)生軟腐病的田塊。

1.1.2 培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基：牛肉浸膏3.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，葡萄糖2.5 g/L，瓊脂15.0 g/L，pH 7.0。LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，瓊脂15.0 g/L，pH 7.0；LB液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

1.1.3 供試藥劑 室內(nèi)抑菌試驗(yàn)的供試藥劑見表1。

表1 供試藥劑Table 1 Experimental reagents

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離純化 利用平板劃線分離法分離病原菌（林可竟等，2021）。取發(fā)病白魔芋植株莖部組織的病健交界處切成小塊，利用75%醫(yī)用酒精進(jìn)行表面消毒2 min，用無菌去離子水漂洗3次，隨后將病樣組織置于盛有1 mL無菌水的10 mL離心管中搗碎，使病樣組織中的細(xì)菌流出，制成細(xì)菌懸浮液，利用無菌接種環(huán)取細(xì)菌懸浮液在NA培養(yǎng)基上劃線，置于28 ℃培養(yǎng)24 h，根據(jù)菌落的形態(tài)特征，繼續(xù)挑取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接純化3次后的純培養(yǎng)物于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測定 將分離得到的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃下180 r/min培養(yǎng)24 h，得到菌懸液。分別對健康白魔芋盆栽植株和新鮮健康白魔芋球莖進(jìn)行人工接種，接種前用75%醫(yī)用酒精對魔芋植株接種莖干和球莖表面擦拭消毒，晾干后用無菌針刺傷魔芋莖干和球莖的表皮層，然后取10 μL菌懸液接種到針刺傷的傷口處，每天觀察記錄發(fā)病情況，設(shè)接種無菌水為對照。從接種發(fā)病的魔芋莖干和球莖組織中重新分離病原菌，利用柯赫氏法則對病原菌進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 病原菌形態(tài)觀察 觀察并記錄病原菌株在LB固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征，在掃描電子顯微鏡觀察病原菌的形態(tài)特征、菌落形狀、大小等。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定 將2次分離得到的病原菌菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃下200 r/min培養(yǎng)24 h，利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒DP302［天根生化科技（北京）有限公司］提取菌株的總DNA。采用16S rDNA的通用引物27F/1492R（Osborne et al.，2005）對病原菌菌株的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增酶為PrimeSTAR?HS DNA Polymerase（TaKaRa公司）。PCR產(chǎn)物電泳檢測后送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果經(jīng)校驗(yàn)后提交GenBank數(shù)據(jù)庫，并利用MEGA 6.06構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.5 殺菌劑對病原菌的室內(nèi)抑菌試驗(yàn) 參照馮迪南等（2018）采用抑菌圈法開展不同殺菌劑對病原菌的抑菌試驗(yàn)。將病原菌單菌落接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃下200 r/min搖床培養(yǎng)24 h，調(diào)整OD600約為0.5，同時(shí)將LB固體培養(yǎng)基高溫高壓滅菌后冷卻至50 ℃左右，每100 mL加入1 mL病原菌菌液，充分混勻后倒入90 mm無菌培養(yǎng)皿中，制成每皿20 mL的含魔芋軟腐病病原菌的LB平板，待含菌LB平板凝固后，用5 mm打孔器在平板上打孔，并在孔內(nèi)加入50 μL殺菌劑，每個藥劑濃度3次重復(fù)，以無菌水作對照。28 ℃培養(yǎng)20 h后，測量抑菌圈直徑，并計(jì)算殺菌劑對病原菌生長的抑制率。抑制率（%）=（處理組抑菌直徑-對照組抑菌直徑）/處理組抑菌直徑×100。針對有抑菌效果的殺菌劑，在DPS 7.05進(jìn)行一元回歸分析，以殺菌劑的有效成分濃度的對數(shù)為自變量x，對應(yīng)的抑制率的幾率值為因變量y，得到毒力回歸方程，并比較不同殺菌劑的抑制中濃度（EC50）和相關(guān)系數(shù)（r）。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用DPS 7.05對室內(nèi)毒力測定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法比較各藥劑在不同濃度下的抑制率，進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間病害特征

田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，白魔芋軟腐病多發(fā)生在植株莖干部位，整個生長期均可發(fā)病，病害初期在莖干上出現(xiàn)小面積的水漬狀斑點(diǎn)，病斑會不斷擴(kuò)大導(dǎo)致莖干部組織腐爛，有汁液流出，伴隨有臭味，最終導(dǎo)致整株倒伏（圖1）。

圖1 白魔芋軟腐病的發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms of soft rot on A.albus

2.2 病原菌分離與鑒定結(jié)果

2.2.1 病原菌的分離與致病性驗(yàn)證 從采集的白魔芋病樣組織中共分離得到6株菌株。取分離得到的菌株分別對健康白魔芋盆栽植株和新鮮健康白魔芋球莖進(jìn)行人工接種，其中僅有菌株XYmy-A1對白魔芋產(chǎn)生病癥。將菌株XYmy-A1回接到魔芋植株的莖干上，48 h開始出現(xiàn)水漬狀斑點(diǎn)，隨后不斷擴(kuò)大，第6 d整株倒伏（圖2-A）；將菌株XYmy-A1接種到刺傷的白魔芋球莖表面，48 h后接種部位出現(xiàn)輕微水漬狀，隨后開始腐爛、變軟，腐爛部位不斷擴(kuò)大，并伴有惡臭味，將球莖切開可看到膿狀的腐爛組織（圖2-C-1和圖2-C-2）；對照組均無癥狀（圖2-B和圖2-D），說明菌株XYmy-A1在白魔芋莖部和球莖部均可致病。發(fā)病后從發(fā)病組織上重新分離的菌株與接種菌株XYmy-A1一致，說明該菌株為白魔芋軟腐病的病原菌。

圖2 白魔芋植株和球莖接種菌株XYmy-A1后的軟腐病病癥Fig.2 Soft rot symptoms on A.albus plants and corms after inoculation with strain XYmy-A1

2.2.2 菌株XYmy-A1的形態(tài)特征 菌株XYmy-A1在LB固體培養(yǎng)基上為乳白色的菌落，菌落表面光滑，中間隆起（圖3-A），革蘭氏染色為陰性（圖3-B）。掃描電鏡下觀察，菌株XYmy-A1呈短桿狀，兩頭鈍圓，具有多根鞭毛（圖3-C）。

圖3 菌株XYmy-A1的形態(tài)Fig.3 Morphological characteristics of strain XYmy-A1

2.2.3 菌株XYmy-A1分子生物學(xué)鑒定 測序結(jié)果顯示，菌株XYmy-A1的16S rDNA序列長度為1451 bp（GenBank登錄號：OM721736）。NCBI序列比對結(jié)果顯示，菌株XYmy-A1的16S rDNA序列與已報(bào)道的菌株P(guān)ectobacterium aroidearumstrain SCRI 109（NR159926.1）的相似性為99.72%。以迪基氏菌屬（Dickeya dieffenbachiae）為外群，構(gòu)建基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖4）顯示，菌株XYmy-A1與環(huán)狀果膠桿菌（P.aroidearum）聚為一個類群，而與胡蘿卜果膠桿菌（P.carotovorum）、馬蹄蓮果膠桿菌（P.zantedeschiae）、黑腐果膠桿菌（P.atrosepticum）和山葵果膠桿菌（P.wasabiae）的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖4 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株XYmy-A1系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain XYmy-A1 constructed based on 16S rDNA sequence

結(jié)合形態(tài)、致病性和16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，確定引起白魔芋軟腐病的病原菌XYmy-A1為環(huán)狀果膠桿菌。

2.3 殺菌劑對菌株XYmy-A1的室內(nèi)抑菌活性

室內(nèi)平板抑菌試驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，供試的13種殺菌劑中，只有80%乙蒜素乳油、5%氨基寡糖素·20%乙蒜素微乳劑、25%溴菌腈微乳劑、3%中生菌素可溶液劑、0.3%四霉素水劑、1.5%噻霉酮水乳劑和1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑7種殺菌劑對病原菌的生長具有抑制作用，且不同殺菌劑的抑制效果存在差異。80%乙蒜素、5%氨基寡糖素·20%乙蒜素微乳劑、25%溴菌腈微乳劑、3%中生菌素可溶液劑和0.3%四霉素水劑5種殺菌劑在5個梯度濃度下均有明顯的抑制效果，而1.5%噻霉酮水乳劑和1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑只有在高濃度時(shí)才具有抑菌效果。7種殺菌劑室內(nèi)毒力測定結(jié)果（表3）顯示，0.3%四霉素水劑對菌株XYmy-A1的抑制活性最強(qiáng)，其EC50較低，為0.1980 mg/L，說明病原菌株對該殺菌劑最敏感，5%溴菌腈微乳劑次之，其EC50為9.1359 mg/L，1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑對病原菌的抑制作用最差，其EC50較高，為654.5806 mg/L。

表2 不同殺菌劑對菌株XYmy-A1的抑菌效果Table 2 Inhibitory activity of different bactericides against the pathogen strain XYmy-A1

3 討論

果膠桿菌屬的菌株高度異質(zhì)化，目前已被報(bào)道的有10多種，其宿主范圍廣泛，可引起多種植物的軟腐?。∕a et al.，2007；商雨等，2015；馮潔，2017；Portier et al.，2019）。Nabhan等（2013）基于表型、DNA-DNA雜交、16S rDNA和多位點(diǎn)序列分析等將環(huán)狀果膠桿菌從胡蘿卜果膠桿菌中分離出來，確立為一個新種，認(rèn)為該菌株主要侵染和引發(fā)單子葉植物細(xì)菌性軟腐病，隨后，該物種首次在我國報(bào)道為大白菜軟腐病的病原菌，并發(fā)現(xiàn)在人工接種條件下該菌株還可侵染多種單、雙子葉植物（李曉穎等，2018；Xie et al.，2018）。該病原菌的已知寄主范圍不斷擴(kuò)大，近年來在天南星科如半夏、芋頭、合果芋、花魔芋和珠芽魔芋等多種作物上均有發(fā)現(xiàn)由環(huán)狀果膠桿菌侵染引起的軟腐?。ㄎ涵h(huán)宇等，2020；Wei et al.，2020；Xu et al.，2020；Wang et al.，2021；趙玳琳等，2022），但目前尚無針對白魔芋軟腐病的相關(guān)研究報(bào)道。本研究分離、鑒定白魔芋軟腐病病原菌菌株XYmy-A1，其引起的病癥與其他魔芋軟腐病的發(fā)病癥狀相似，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示其與環(huán)狀果膠桿菌的相似性最高，但與已報(bào)道的引起魔芋軟腐病的病菌環(huán)狀果膠桿菌不同（孫苗苗，2019；Sun et al.，2019；魏環(huán)宇等，2020；Wei et al.，2020；崔雙等，2021），推測可能是病原菌適應(yīng)不同環(huán)境因素及宿主作物不同，使得不同環(huán)境因素及宿主作物的優(yōu)勢病原菌株也存在差異。

殺菌劑對病原菌的室內(nèi)毒力是衡量藥劑對病原菌毒力大小的一個重要指標(biāo)，能直接體現(xiàn)藥劑對病原菌的抑制或致死能力（趙洪濤等，2019）。本研究的室內(nèi)毒力測定結(jié)果顯示，80%乙蒜素乳油、5%氨基寡糖素·20%乙蒜素微乳劑、25%溴菌腈微乳劑、3%中生菌素可溶液劑和0.3%四霉素水劑5種殺菌劑在供試濃度下對白魔芋軟腐病病原菌生長具有抑制作用，1.5%噻霉酮水乳劑和1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑只有在高濃度下對白魔芋軟腐病病原菌生長具有抑制作用，其余殺菌劑均無抑制效果。有抑制效果的殺菌劑可大致分為三類：化學(xué)殺菌劑（25%溴菌腈微乳劑、1.5%噻霉酮水乳劑和1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑），新型植物仿生農(nóng)藥（80%乙蒜素乳油和5%氨基寡糖素·20%乙蒜素微乳劑）以及農(nóng)用抗生素類（3%中生菌素可溶液劑和0.3%四霉素水劑）。溴菌腈是一種廣譜性殺菌劑，尤其是對炭疽病的防治效果較好（肖敏等，2017；韓文啟等，2018），蒙姣榮等（2015）發(fā)現(xiàn)溴菌腈對桑樹細(xì)菌性枯萎病菌有一定的抑制效果；葉火春等（2020）發(fā)現(xiàn)丙硫唑與溴菌腈以質(zhì)量比1∶2混配對杧果細(xì)菌性角斑病菌田間防效高達(dá)80%。本研究中白魔芋軟腐病病原菌XYmy-A1對25%溴菌腈微乳劑的敏感性很高，1600倍液（有效濃度156.25 mg/L）時(shí)的抑制率達(dá)71.95%，EC50為9.1359 mg/L。噻霉酮多用于防治真菌病害，近年來也有少量利用噻霉酮防治細(xì)菌性病害的研究，范可地等（2018）發(fā)現(xiàn)3%噻霉酮可濕性粉劑在田間能有效防治水稻細(xì)菌性條斑病，尤其是與20%噻唑鋅懸浮劑或20%噻菌酮懸浮劑復(fù)配使用的效果更佳；馮迪南等（2018）發(fā)現(xiàn)1.5%噻霉酮水乳劑對馬鈴薯軟腐病病原菌具有平板抑菌效果，但本研究發(fā)現(xiàn)1.5%噻霉酮水乳劑在高于推薦使用濃度時(shí)才對菌株XYmy-A1有抑制效果。乙蒜素是大蒜素的同系物，其作為一種植物仿生農(nóng)藥被廣泛應(yīng)用于防治棉花枯萎病等，近年來也有少量關(guān)于其對細(xì)菌性病害的防治研究，如張京等（2021）通過室內(nèi)和田間藥效試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，80%乙蒜素乳油可作為防治大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病的首選藥劑。本研究中白魔芋軟腐病病原菌對80%乙蒜素乳油和5%氨基寡糖素·20%乙蒜素微乳劑的敏感性也較高，80%乙蒜素乳油在2000倍液（有效成分濃度為400.00 mg/L）時(shí)的抑制率可達(dá)60.00%以上，EC50為99.9482 mg/L，因此，乙蒜素是一種對抑制白魔芋軟腐病病原菌有效的殺菌劑，但其與氨基寡糖素復(fù)配使用能否協(xié)同增效還有待田間進(jìn)一步驗(yàn)證。農(nóng)用抗生素類殺菌劑0.3%四霉素水劑與3%中生菌素可溶液劑相比，0.3%四霉素水劑在1000倍液（有效成分濃度為3.00 mg/L）時(shí)對菌株XYmy-A1的抑制率可達(dá)65.71%，EC50為0.1980 mg/L，而3%中生菌素可溶液劑在1000倍液（有效成分濃度為30.00 mg/L）時(shí)的抑制率為35.44%，EC50為102.5101 mg/L，因此，0.3%四霉素水劑可作為一種首選藥劑與其他藥劑交替使用以防治白魔芋軟腐病。本研究僅限于室內(nèi)平板篩選的毒力測定結(jié)果，有一定的局限性，如銅制劑、內(nèi)吸性殺菌劑氯溴異氰尿酸等在平板上的抑菌效果雖然未體現(xiàn)出來，但也不能否定其田間的利用效果，且不同的殺菌劑在植物上的作用機(jī)理不同，其對病害的防治效果也不同（張盧慧等，2021）。因此，篩選獲得的殺菌劑還需進(jìn)一步開展田間試驗(yàn)確定其防治效果及最適濃度，以便為田間病害防控提供依據(jù)。

4 結(jié)論

引起貴州省安龍縣白魔芋軟腐病的病原菌為環(huán)狀果膠桿菌，可首選0.3%四霉素水劑和25%溴菌腈微乳劑進(jìn)一步開展田間防效試驗(yàn)，1.5%噻霉酮水乳劑、3%中生菌素可溶液劑、80%乙蒜素乳油和5%氨基寡糖素·20%乙蒜素微乳劑可作為備選藥劑。