十一方藥酒對(duì)急性軟組織損傷大鼠的保護(hù)作用研究

張文濤，楊家焱，蔣欽虹，毛德文，劉舒凌，田 慧，馬雯芳*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

急性軟組織損傷多由于各種撞擊、擠壓等原因?qū)θ梭w皮膚、韌帶、關(guān)節(jié)囊、骨骼肌肉、椎間盤等組織造成皮下出血點(diǎn)、局部腫脹、淤血、疼痛、功能障礙等病理性損傷，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1-3］。十一方藥酒為廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，具有舒筋活絡(luò)、消腫散瘀、接骨止痛的功效，臨床上用于治療開放性骨折、膝關(guān)節(jié)炎、慢性軟組織損傷及改善微循環(huán)等，療效顯著［4-6］。本研究觀察十一方藥酒對(duì)急性軟組織損傷大鼠的保護(hù)作用，旨為其進(jìn)一步開發(fā)提供現(xiàn)代藥理學(xué)研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)大鼠房飼養(yǎng)，溫度18～25 ℃，濕度40%～70%。

1.2 儀器 TGL-20M 醫(yī)用離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；SQP電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DW-8GL338 海爾超低溫保溫箱，Haier BIO-MEDICAL 公司；INFINITE M200PRO 連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，TECAN 公司；Blue Pard生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 藥品與試劑 十一方藥酒由本課題組自制，批號(hào)：20200302，生藥量為193 mg/ml；扶他林軟膏（雙氯芬酸二乙胺乳膠劑），北京洛華制藥有限公司，批號(hào)：4B5U；IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2ELISA 試劑盒，江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)202105；SOD、MDA 試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20210520。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 急性軟組織損傷模型建立 參考文獻(xiàn)［7］方法，取50 只SD 雄性大鼠，先剃除大鼠右后肢大腿處的毛發(fā)，再用6%硫化鈉溶液進(jìn)一步清除殘余毛發(fā)。造模前用游標(biāo)卡尺測(cè)量各大鼠左右后肢大腿肌肉直徑，然后隨機(jī)選取8 只大鼠作為空白組不造模，其余大鼠用20%烏拉坦溶液腹腔注射麻醉。預(yù)先將30 cm 長(zhǎng)的PVC 塑料管垂直固定于鐵架臺(tái)上，將麻醉后的大鼠右后肢彎曲平放固定于鐵架臺(tái)上，并處于塑料管的正下方，將200 g 的砝碼從塑料管的頂部做自由落體運(yùn)動(dòng)，使其正好砸中大鼠右后肢大腿肌肉處，重復(fù)進(jìn)行5次，造成大鼠急性軟組織損傷。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：通過(guò)肉眼觀察以及用手觸摸，大鼠大腿皮下有明顯的出血點(diǎn)、淤青及腫脹，但皮膚無(wú)出血破損，無(wú)關(guān)節(jié)脫位以及骨折等開放性損傷狀況，且其他部位一切都正常。本次造模有2 只大鼠骨折淘汰，選取造模成功的40 只大鼠作為實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)象。

2.2 動(dòng)物分組及給藥 將造模成功的40 只大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性組及十一方藥酒高、中、低劑量組，每組8只。給藥前用游標(biāo)卡尺測(cè)量各大鼠左右后肢大腿肌肉直徑。各組大鼠在軟組織損傷部位涂抹相應(yīng)的藥物，空白組涂抹生理鹽水，模型組涂抹白酒基質(zhì)，陽(yáng)性組予扶他林軟膏500 mg/kg，十一方藥酒高、中、低劑量組分別給予十一方藥酒965 mg/kg、483 mg/kg、241 mg/kg，給藥體積均為5 ml/kg。十一方藥酒組用1 ml 注射器準(zhǔn)確吸取藥酒均勻涂抹于大鼠大腿損傷處，再用棉簽涂抹1～2 min 促進(jìn)藥物吸收。各組每天給藥2次，連續(xù)給藥3 d。

2.3 指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥后，于次日上午用游標(biāo)卡尺測(cè)量各大鼠左右后肢大腿肌肉直徑，計(jì)算腫脹度。腫脹度（cm）=右后肢肌肉直徑-左后肢肌肉直徑。麻醉大鼠，剪開大鼠右后肢大腿損傷部位的皮膚，分離皮下組織，剪取部分肌肉組織，用PBS 液漂洗掉肌肉組織上的血跡后，濾紙吸干水分，剪取0.2 g，用玻璃勻漿器在冰水浴中制備10%勻漿液，將制備好的勻漿液用離心機(jī)以3 000 r/min 離心10 min，取上清液，分別用ELISA 測(cè)定IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2因子水平，TBA法檢測(cè) MDA 含量，WST-1 法檢測(cè) SOD 活力；另取部分肌肉組織用10%多聚甲醛溶液固定，制作HE 染色切片進(jìn)行軟組織病理形態(tài)檢查。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠造模后及給藥后右后肢腫脹情況 見(jiàn)圖1、圖2。結(jié)果顯示，除空白組外，其余各組大鼠在造模后，肉眼觀察可見(jiàn)右后肢大腿皮下有明顯的淤青及腫脹，但皮膚無(wú)破損及出血，無(wú)開放性骨折情況，說(shuō)明軟組織損傷模型建立成功。給藥治療后，模型組大鼠右后肢腫脹無(wú)明顯改善；陽(yáng)性組（扶他林）及十一方藥酒高、中、低劑量組大鼠右后肢腫脹明顯減輕。

圖1 造模后各組大鼠右后肢腫脹情況

圖2 給藥后各組大鼠右后肢腫脹情況

3.2 十一方藥酒對(duì)軟組織損傷大鼠后肢腫脹度的影響 見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，各組大鼠在造模后平均腫脹度均顯著升高，與空白組比較均有顯著性差異（P＜0.01）。給藥后，陽(yáng)性組（扶他林）及十一方藥酒高、中劑量組均能顯著減輕大鼠后肢腫脹度，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05 或P＜0.01），十一方藥酒低劑量組大鼠后肢腫脹度也有減輕趨勢(shì)，但與模型組比較，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠后肢腫脹度比較 （，n=8）

表1 各組大鼠后肢腫脹度比較 （，n=8）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組 別空白組模型組陽(yáng)性組（扶他林）十一方藥酒高劑量組十一方藥酒中劑量組十一方藥酒低劑量組劑量（mg/kg）— —500 965 483 241造模前（cm）0.002 5±0.005 0.002 5±0.005 0.006 3±0.007 0.003 4±0.007 0.003 8±0.011 0.001 3±0.004造模后（cm）0.002 6±0.005 0.241 3±0.174①0.252 5±0.141①0.227 5±0.073①0.228 8±0.109①0.240 0±0.198①給藥后（cm）0.001 3±0.004 0.218 8±0.131①0.097 5±0.060③0.088 8±0.051③0.106 4±0.046②0.147 5±0.067

3.3 十一方藥酒對(duì)炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平的影響 見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠組織勻漿液中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性組及高、中劑量十一方藥酒組能顯著降低IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平（P＜0.01或P＜0.05）。

表2 各組炎癥因子水平比較 （，n=8）

表2 各組炎癥因子水平比較 （，n=8）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組 別空白組模型組陽(yáng)性組（扶他林）十一方藥酒高劑量組十一方藥酒中劑量組十一方藥酒低劑量組PGE2（ng/ml）1.49±0.06 1.74±0.11①1.50±0.07③1.61±0.10②1.62±0.17 1.63±0.17劑量（mg/kg）— —500 965 483 241 IL-1β（pg/ml）33.81±3.56 40.43±2.49①34.82±1.92③35.20±3.53③36.05±4.67②38.46±3.12 IL-6（pg/ml）132.84±10.15 155.62±16.44①134.91±14.24②136.04±15.19②138.89±12.20②141.70±14.69 TNF-α（pg/ml）333.70±12.11 397.44±37.33①336.89±22.57③346.20±27.86③347.42±38.94②350.15±39.74②

3.4 十一方藥酒對(duì)軟組織氧化指標(biāo)MDA、SOD 的影響 見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組MDA水平顯著升高，SOD 活性顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性組及十一方藥酒高、中劑量組均能顯著降低MDA水平（P＜0.05）；陽(yáng)性組及十一方藥酒高、中、低劑量組能顯著升高SOD活性（P＜0.05）。

表3 各組大鼠軟組織MDA、SOD含量 （，n=8）

表3 各組大鼠軟組織MDA、SOD含量 （，n=8）

注：與空白組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

SOD（U/mg）16.36±1.45 12.58±4.05①17.63±4.59②17.12±1.38②17.41±1.35②16.69±3.50②組 別空白組模型組陽(yáng)性組（扶他林）十一方藥酒高劑量組十一方藥酒中劑量組十一方藥酒低劑量組劑量（mg/kg）— —500 965 483 241 MDA（nmol/mg）43.35±9.70 74.31±27.33①42.10±27.29②46.11±8.82②50.60±10.56②56.41±20.79

3.5 十一方藥酒對(duì)大鼠軟組織的影響 見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，空白組大鼠的肌肉組織內(nèi)肌束大小不一，肌細(xì)胞細(xì)而長(zhǎng)，呈纖維狀或不規(guī)則狀，排列緊密整齊，肌漿染色均勻，細(xì)胞核呈扁平或橢圓形、染色質(zhì)少、核仁明顯，未見(jiàn)明顯變性或壞死。肌間可見(jiàn)血管、神經(jīng)等分布，無(wú)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生，未見(jiàn)明顯病理形態(tài)改變。與空白組比較，模型組肌束紊亂、肌纖維溶解、壞死、并有炎性因子浸潤(rùn)，組織損傷明顯；與模型組比較，陽(yáng)性組及十一方藥酒組肌束稍紊亂、壞死明顯減少，炎性因子減少，損傷程度明顯降低。

圖3 大鼠軟組織HE染色切片（×200）

4 討 論

當(dāng)機(jī)體局部軟組織受到損傷之后，會(huì)直接導(dǎo)致局部組織細(xì)胞變性壞死，毛細(xì)血管破裂、血管壁通透性增加等病理改變。同時(shí)，局部血液循環(huán)被破壞后，引起局部水腫，組織缺氧，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞壞死等，而炎癥反應(yīng)會(huì)貫穿軟組織損傷與修復(fù)的整個(gè)過(guò)程，其中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2是炎癥反應(yīng)過(guò)程中重要的炎癥細(xì)胞因子［8-9］。白介素是主要由多種免疫細(xì)胞經(jīng)過(guò)刺激后所分泌的一種具有生物活性的細(xì)胞因子，其中IL-1β 和IL-6 是常見(jiàn)的促炎因子，在炎癥和免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。TNF-α 是由活化的巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，不僅參與炎癥反應(yīng)，同時(shí)能進(jìn)一步刺激白介素等細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加深。PGE2是一類活性較強(qiáng)的炎癥介質(zhì)，同時(shí)也有致熱與致痛作用，并與其他炎癥介質(zhì)產(chǎn)生協(xié)同作用加速炎癥反應(yīng)［10-11］。

機(jī)體組織在炎癥反應(yīng)和創(chuàng)傷應(yīng)激期間，多形核白細(xì)胞等炎癥細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)，產(chǎn)生許多的自由基及代謝產(chǎn)物，且自由基清除酶活性下降，引起膜的脂質(zhì)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致組織和細(xì)胞損傷進(jìn)一步加劇，使受損組織愈合延緩。所以減少自由基的生成和釋放將緩解炎癥反應(yīng)［12］。MDA 是自由基攻擊脂質(zhì)而引起過(guò)氧化的最終代謝產(chǎn)物，對(duì)組織細(xì)胞具有毒害作用，通過(guò)測(cè)定體內(nèi)MDA的生成量，可間接地反映自由基的水平以及對(duì)組織細(xì)胞的損傷程度，是目前普遍公認(rèn)能體現(xiàn)自由基產(chǎn)生和引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的間接性指標(biāo)［13］。SOD 是廣泛存在于人體組織中的一種酶，具有強(qiáng)抗氧化性、消除體內(nèi)自由基，保護(hù)正常細(xì)胞免受毒害，加快修復(fù)受損組織的能力，表現(xiàn)出超強(qiáng)的抗炎作用［14］。

本研究中大鼠急性軟組織損傷模型的造模方法稱為自由落體組織損傷法、機(jī)械沖擊挫傷法，該方法屬于非開放性軟組織造模，引起腫脹淤血等軟組織損傷病癥，其體征和致病原因與臨床上的軟組織損傷相似，實(shí)驗(yàn)方法成熟可靠，且重復(fù)性較好［15］。本實(shí)驗(yàn)中使用重200 g的砝碼，將其從高30 cm 處做自由落體砸傷大鼠右后肢大腿，造模后可以立刻看到大腿皮下有出血點(diǎn)以及腫脹，因腫痛而導(dǎo)致大鼠走路跛行，無(wú)骨折和皮膚破損出血，符合臨床標(biāo)準(zhǔn)。

十一方藥酒作為傳統(tǒng)醫(yī)院制劑，由重樓、自然銅、紅花、沒(méi)藥、續(xù)斷、蟲等多味中藥組成。本研究以軟組織損傷大鼠為模型，觀察其對(duì)軟組織損傷的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，十一方藥酒對(duì)急性軟組織損傷大鼠有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與降低炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平，降低氧化指標(biāo)MDA 水平，提高SOD活力有關(guān)。