一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定天芷金黃貼膏中5種活性成分含量的適用性研究

譚娥玉，馬少鋒，章光華，李 放，王賢兒，林信亨

（江門市五邑中醫(yī)院，廣東 江門 529000）

天芷金黃貼膏源自如意金黃散，記載于明代陳實(shí)功編著的《外科正宗》，由大黃、黃柏、厚樸、姜黃、白芷、陳皮、甘草、蒼術(shù)、天南星、天花粉10 味中藥組成［1］，用于熱毒瘀滯肌膚所致瘡瘍腫痛、丹毒流注，癥見(jiàn)膚紅、腫、熱、痛，亦可用于跌打損傷［2］。天芷金黃方在我院臨床上使用40余年，本課題組在前期研究中通過(guò)優(yōu)化提取工藝及制備工藝，已將其成功制備為凝膠貼膏［2］。單一成分質(zhì)控模式對(duì)中藥復(fù)方制劑具有局限性，一測(cè)多評(píng)法（QAMS）廣泛應(yīng)用于中藥及復(fù)方制劑的質(zhì)控研究［3-10］。為了有效控制制劑質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合QAMS建立方中主要藥味的有效成分含量測(cè)定方法，采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿、厚樸酚的含量，研究一測(cè)多評(píng)法在天芷金黃貼膏質(zhì)量評(píng)價(jià)中的可行性和準(zhǔn)確性，為天芷金黃貼膏的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 Agilent 1260 InfinityⅡ高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；LC-10 型高效液相色譜儀（日本島津企業(yè)管理公司）；Agilent ZORBAX Eclipse XDBC18（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國(guó)Agilent 公司）；Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國(guó)Agilent公司）；島津VP-ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm，日本島津企業(yè)管理公司）；XS205 電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司，感量：0.01 mg）；WH-800 超聲波清洗機(jī)（濟(jì)寧萬(wàn)和超聲電子設(shè)備有限公司）；Best-S30 超純水機(jī)（芷昂儀器上海有限公司）；SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；DLSB-10/20 低溫冷卻循環(huán)泵（鞏義市予華儀器有限公司）；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥與試劑 鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：0713-9906，純度：98.14%）、厚樸酚對(duì)照品（批號(hào)：110729-201714，純度：100%）由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；大黃酚對(duì)照品（批號(hào)：MUST-17041310，純度：99.50%）、大黃素對(duì)照品（批號(hào)：MUST-17102702，純度：99.48%）、大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)：MUST-17102702，純度：99.00%）由成都曼思特生物科技有限公司提供；天芷金黃貼膏（自制，批號(hào)：20190805、20190809、20190820、20190903、20190911、20190915）；甲醇為色譜純，水為超純水，磷酸、鹽酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 分別稱取鹽酸小檗堿、厚樸酚、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，精密稱定，同置于25 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，制成濃度分別為鹽酸小檗堿0.260 8 mg/ml、厚樸酚0.088 0 mg/ml、大黃素0.042 0 mg/ml、大黃酚0.065 6 mg/ml 及大黃素甲醚0.033 2 mg/ml 的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱保存。

2.2 供試品溶液制備 取天芷金黃貼膏半片，約23 g，剪碎，精密稱定，置于250 ml 具塞錐形瓶中，加入1%HCl 甲醇溶液 100 ml，浸漬 3 h，超聲 30 min，抽濾，濾液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，濃縮液轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中，并用適量甲醇洗滌燒瓶3～4次，洗滌液也并入容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3 陰性溶液的制備 按處方稱取除大黃、黃柏、厚樸外的各味中藥，制成陰性樣品，再按“2.2”的方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)［2，11］Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液A-甲醇B，梯度洗脫：0～5 min，67%A～67%A；5～7 min，67%A～57%A；7～17 min，57%A～57%A；17～19 min，57%A～18%A；19～45 min，18%A～18%A；流速為1 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為5 μl。在此色譜條件下，各成分分離度高，陰性對(duì)照無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液各 1.0 ml、2.0 ml、4.0 ml、6.0 ml、8.0 ml于10 ml 量瓶中，用甲醇稀釋并定容，制得系列混合對(duì)照品溶液。將各混合對(duì)照品溶液及混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，混合對(duì)照品濃度（X，μg/ml）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各化學(xué)成分標(biāo)準(zhǔn)曲線 （n=6）

2.5.2 定量限與檢測(cè)限考察 精密吸取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。按信噪比為10∶1、3∶1 分別計(jì)算定量限、檢測(cè)限。結(jié)果，鹽酸小檗堿、厚樸酚、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚定量限分別為7.98 ng/ml、6.62 ng/ml、4.06 ng/ml、0.66 ng/ml、2.72 ng/ml，檢測(cè)限分別為 2.39 ng/ml、1.98 ng/ml、1.22 ng/ml、0.20 ng/ml、0.82 ng/ml。

2.5.3 儀器精密度試驗(yàn) 取上述混合對(duì)照品溶液，按“2.4”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次5 μl，測(cè)定鹽酸小檗堿、厚樸酚、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積，其RSD 分別為0.65%、0.33%、0.49%、0.16%、0.57%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品（批號(hào)：20190805）適量，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別于制備后的0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h 進(jìn)樣，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下每次進(jìn)樣5 μl，測(cè)定鹽酸小檗堿、厚樸酚、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積，其RSD 分別為0.24%、0.63%、0.50%、0.67%、0.86%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品（批號(hào)：20190805）6 份，按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算鹽酸小檗堿、厚樸酚、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量分別為 0.131 1 mg/g、0.063 3 mg/g、0.026 9 mg/g、0.038 7 mg/g、0.015 7 mg/g，以平均含量計(jì)算，結(jié)果RSD值分別為0.30%、0.61%、0.39%、0.67%、0.88%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的樣品（批號(hào)：20190805，鹽酸小檗堿、厚樸酚、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量分別為0.131 5 mg/g、0.063 0 mg/g、0.027 2 mg/g、0.039 1 mg/g、0.015 2 mg/g）6份，每份10 g，精密稱定，剪碎置于250 ml 具塞錐形瓶中，分別精密加入混合對(duì)照品溶液（鹽酸小檗堿、厚樸酚、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的濃度分別為0.658 mg/ml、0.315 mg/ml、0.136 mg/ml、0.196 mg/ml、0.076 mg/ml）2 ml，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定峰面積，由回歸方程計(jì)算鹽酸小檗堿、厚樸酚、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量，并計(jì)算平均回收率和RSD，見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

2.6 待測(cè)指標(biāo)的相對(duì)校正因子的計(jì)算 以鹽酸小檗堿為內(nèi)參物，在上述特定的范圍內(nèi)按照公式fs/i=（As/ns）/（Ai/n）i計(jì)算，As和 ns為內(nèi)參物的峰面積和濃度，Ai和ni為待測(cè)成分對(duì)照品的峰面積和濃度。精密量取“2.1”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣 2 μl、4 μl、5 μl、6 μl、8 μl、10 μl，計(jì)算各個(gè)成分的峰面積。以鹽酸小檗堿為內(nèi)參物，計(jì)算厚樸酚、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚相對(duì)于鹽酸小檗堿的相對(duì)校正因子。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 待測(cè)指標(biāo)的相對(duì)校正因子

2.7 校正因子耐用性考察

2.7.1 不同儀器及色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響 采用2 臺(tái)不同的儀器和3 根不同型號(hào)的色譜柱，分別考察其對(duì)鹽酸小檗堿相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同儀器和色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.7.2 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響 采用Agilent 1260 高效液相系統(tǒng)和Agilent XDB-C18 色譜柱，分別考察不同柱溫（29 ℃、30 ℃、31 ℃）對(duì)鹽酸小檗堿相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.7.3 待測(cè)成分的色譜峰定位 本實(shí)驗(yàn)采用相對(duì)保留時(shí)間對(duì)待測(cè)成分色譜峰進(jìn)行定位，即各待測(cè)成分與鹽酸小檗堿間保留時(shí)間的比值，并考察相對(duì)保留值在不同品牌高效液相色譜儀和不同型號(hào)色譜柱上的重現(xiàn)性，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 待測(cè)成分的色譜峰定位-相對(duì)保留值法

2.8 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法的比較 取6 批次的樣品，按“2.2”項(xiàng)的方法制備供試品溶液，并按“2.4”項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)樣。分別采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算天芷金黃貼膏中鹽酸小檗堿、厚樸酚、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量，并利用夾角余弦算法來(lái)評(píng)價(jià)兩種方法的差異性，測(cè)得外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法之間的相似度為0.999 9，表明兩種方法測(cè)得的含量無(wú)顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法測(cè)定天芷金黃貼膏各指標(biāo)成分含量的比較 （mg/g）

3 討 論

方中黃柏、大黃、厚樸為主藥，黃柏具有瀉火解毒、清熱燥濕的功效，黃柏中小檗堿有抗病原微生物、抗炎、抗腫瘤等作用［12］；大黃具有瀉下攻積、清熱瀉火、活血化瘀等功效，蒽醌類是其有效活性成分，有抗菌消炎、抗病毒、抗癌、保肝利膽等作用［13］；厚樸酚是厚樸主要活性物質(zhì)之一，其對(duì)消化、神經(jīng)、心血管與呼吸系統(tǒng)等均具有明顯的藥理活性［14］。由于鹽酸小檗堿對(duì)照品廉價(jià)易得，且在供試品中，鹽酸小檗堿的含量明顯比其它成分（厚樸酚、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚）高，因此選擇鹽酸小檗堿作為內(nèi)參物，計(jì)算內(nèi)參物與其它待測(cè)成分間的相對(duì)校正因子。

預(yù)試驗(yàn)中曾分別考察了水-甲醇系統(tǒng)、水-乙腈系統(tǒng)、0.1%磷酸水溶液-甲醇系統(tǒng)、0.2%磷酸水溶液-甲醇系統(tǒng)，結(jié)果采用0.1%磷酸水溶液-甲醇作為流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí)各成分的峰形較好，分離度較理想。參考相關(guān)文獻(xiàn)的液相洗脫條件［2，11］，最終確定本實(shí)驗(yàn) HPLC 梯度洗脫在45 min 內(nèi)完成5 個(gè)成分的同時(shí)分析測(cè)定，大大提高了分析效率。

待測(cè)組分色譜峰的準(zhǔn)確定位是一測(cè)多評(píng)成功應(yīng)用的關(guān)鍵［15］，本實(shí)驗(yàn)考察了相對(duì)保留時(shí)間和保留時(shí)間差在不同儀器和不同色譜柱的重現(xiàn)性。結(jié)果表明，保留時(shí)間差法在不同儀器中的重現(xiàn)性較不穩(wěn)定，大黃素甲醚色譜峰的保留時(shí)間差RSD＞5%，而采用相對(duì)保留時(shí)間法，所有待測(cè)成分峰的相對(duì)保留時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定，其RSD 均＜5%。因此，確定使用相對(duì)保留時(shí)間法定位色譜峰。

醫(yī)院制劑作為藥品的一種特殊補(bǔ)充形式，長(zhǎng)期以來(lái)，因其便捷、有效等特點(diǎn)在臨床診療服務(wù)中發(fā)揮著重要作用。醫(yī)院制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定目的是為了保證藥品的安全、有效和質(zhì)量穩(wěn)定。然而，由于各醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑水平、科研儀器設(shè)備等原因，很多醫(yī)院制劑在標(biāo)準(zhǔn)制訂的內(nèi)容上與國(guó)家規(guī)范存在一定差距，控制指標(biāo)參差不齊，不能達(dá)到質(zhì)量控制的要求。一測(cè)多評(píng)法是一種多成分質(zhì)控模式，適用于中藥復(fù)方制劑的標(biāo)準(zhǔn)制訂，本實(shí)驗(yàn)探索其應(yīng)用于天芷金黃貼膏定量分析的可行性和準(zhǔn)確性，為該法應(yīng)用于醫(yī)院制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂提供一定參考。