基于HPLC指紋圖譜與多元統(tǒng)計分析的太平猴魁產(chǎn)地判別方法

高薇，王秀，李見春，涂密密，高菲，徐峰，王玉帥

蚌埠醫(yī)學院 藥學院，安徽 蚌埠 233030

0 引言

太平猴魁是我國十大名茶之一，因其獨特的品質深受國內外消費者喜愛，成為國茶珍品。該茶的核心產(chǎn)地為黃山市黃山區(qū)新明鄉(xiāng)猴坑、猴崗、顏家3個自然村落的鳳凰尖、獅彤山、雞公尖一帶，不同產(chǎn)地和等級的太平猴魁色、香、味及口感各有差異。市場上不同品質的太平猴魁價格懸殊，從幾百元500 g到幾千元500 g不等。在利益的驅使下，一些不法商人以非核心產(chǎn)地茶假冒核心產(chǎn)地茶，坑騙廣大消費者以獲取暴利，嚴重影響了太平猴魁品牌的信譽。近年來，茶葉地理標志保護產(chǎn)品越來越多，國家工商總局、農業(yè)部等部門也對地理標志保護產(chǎn)品實行不同的管理和保護模式[1-2]。太平猴魁作為我國地理標志產(chǎn)品，尋找簡單、可靠的分析方法對原產(chǎn)地與非原產(chǎn)地產(chǎn)品進行鑒別，對維護生產(chǎn)者和消費者的權益具有重要意義。

傳統(tǒng)的茶葉鑒別方法是通過茶葉的外形、湯色、香氣、滋味與葉底進行判斷，這種方法易受人為因素及評判標準的影響，且鑒定結果無法量化[3-5]。而基于指紋圖譜及多元統(tǒng)計分析的數(shù)學模型具有較強的預測能力，在食品檢測、醫(yī)學診斷等領域應用廣泛。張俊杰等[6]通過構建分子指紋圖譜實現(xiàn)了對福建不同茶品種的鑒別。陳琦等[7]開發(fā)了一種基于元素及近紅外分析的方法，可對來自6個產(chǎn)地的太平猴魁樣品進行產(chǎn)區(qū)甄別，但無法進行產(chǎn)地甄別。雷攀登等[8]對采集自不同產(chǎn)地的13種太平猴魁中的水浸出物、游離氨基酸、咖啡堿、茶多酚含量進行了分析測定，并利用GC-MS進行香氣成分分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的太平猴魁香氣成分差異較大，但未明確對品質起關鍵作用的特征成分。楊停等[9]采用頂空固相微萃取-氣質聯(lián)用結合主成分分析(PCA)法對3個產(chǎn)地7種太平猴魁香氣成分進行分析，共鑒定出了29種特征香氣成分。

高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜是一種簡單高效、應用廣泛的指紋圖譜檢測方法，可分析鑒定茶葉中的兒茶酚類、沒食子酸、嘌呤生物堿、茶氨酸等36種成分[10]。目前，HPLC指紋圖譜已被用于多種名優(yōu)茶產(chǎn)品(如龍井茶、烏龍茶、普洱茶、大紅袍、紫陽毛尖茶等)的品質控制[11-15]，但關于太平猴魁指紋圖譜的研究尚未見報道。多元統(tǒng)計分析是研究多變量問題的常用方法，主要包括PCA、判別分析、偏最小二乘回歸分析(OPLS-DA)、因子分析等，該方法在茶葉產(chǎn)地溯源和鑒別方面應用廣泛[16]。本研究擬對來自核心產(chǎn)地(新明鄉(xiāng)猴坑、猴崗和顏家)的太平猴魁進行HPLC指紋譜圖相似度評價，并對來自核心產(chǎn)地與非核心產(chǎn)地(龍門鄉(xiāng)東坑和汪王嶺)太平猴魁進行PCA和OPLS-DA分析，以期開發(fā)一種快速、高效的太平猴魁產(chǎn)地判別方法，用于太平猴魁的品質鑒定與評價，為核心產(chǎn)地太平猴魁的鑒別提供理論依據(jù)。

1 樣品溶液制備

1.1 供試樣品溶液制備

將從不同核心產(chǎn)地(新明鄉(xiāng)猴坑(S1—S4)、猴崗(S5—S7)、顏家(S8—S10))采摘的一芽二葉或一芽三葉新鮮太平猴魁茶葉采用傳統(tǒng)手工加工方式(揀尖、攤放、殺青、理條、整形、毛烘、足烘、復焙)制作太平猴魁。將制得的太平猴魁成品用小型高速粉碎機(WK-1000A型，重慶瑞仟順制藥設備有限公司產(chǎn))粉碎，精密稱取1.0 g置于旋轉蒸發(fā)儀(IKARV10 型，上海人和科學儀器有限公司產(chǎn))的100 mL圓底燒瓶中，加入50 mL體積分數(shù)為70%的乙醇溶液，于85 ℃條件下加熱回流提取兩次，每次30 min；合并濾液并轉移至100 mL容量瓶中，加水定容，搖勻后過 0.45 μm微孔濾膜，收集的濾液即為供試樣品溶液。按產(chǎn)地標注供試樣品溶液，備用。

1.2 標準品溶液制備

分別稱取適量標準品(沒食子酸(GA)、5-沒食子酰基奎寧酸(5-GC)和沒食子兒茶素(GC)，上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)；可可堿(TB)、表沒食子兒茶素(EGC)、兒茶素(Cat)、表兒茶素(EC)、咖啡因(Caf)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)和表兒茶素沒食子酸酯(ECG)，南京源植生物科技有限公司產(chǎn))，利用體積分數(shù)為80%的甲醇溶液超聲溶解后，配制成質量濃度分別為0.204 mg/mL、0.198 mg/mL、0.226 mg/mL、0.236 mg/mL、0.218 mg/mL、0.210 mg/mL、0.231 mg/mL、1.056 mg/mL、1.126 mg/mL、0.228 mg/mL和0.308 mg/mL的混合標準品母液；分別精密量取標準品母液0.05 mL、0.25 mL、1.00 mL、5.00 mL，置于10 mL容量瓶中，以體積分數(shù)為80%的甲醇溶液稀釋至刻度線，將混合標準品母液和稀釋后的標準品母液各取10 μL進行HPLC檢測分析，每個標準品均重復檢測3次，以色譜峰面積對質量濃度進行線性回歸，繪制各標準品的標準曲線。

2 HPLC檢測方法優(yōu)化

筆者前期對HPLC分析方法進行了很多摸索，發(fā)現(xiàn)單獨使用甲醇作為有機相時，EGC和Cat的色譜峰重疊，而單獨使用乙腈作為有機相時，GC和TB無法完成分離，即使高效液相色譜儀(包括Waters 1525二元梯度泵、Waters 2998 PDA型檢測器和2707 waters自動進樣器，美國Waters公司產(chǎn))改變洗脫條件或更換不同型號(包括ZORBAX SAX、YMC-Pack ODS-AM、Sunfire C-18、Watchers 120 ODS-AP、Discovery?C18、Acclaim 120等)色譜柱，均不能達到很好的分離效果(如圖1所示)。

圖1 前期HPLC色譜圖Fig.1 Preliminary HPLC chromatograms注：1為GA，2為5-GC，3為GC，4為TB，5為EGC，6為Cat，7為EC，8為Caf，9為EGCG，10為GCG，11為ECG，下同。

為了檢測太平猴魁中的11種主要成分(GA、5-GC、GC、TB、EGC、Cat、EC、Caf、EGCG、GCG和ECG)，并使各成分獲得較好的分離度，在前期研究的基礎上，筆者選擇甲醇和乙腈的混合溶液作為有機相進行洗脫。水相(A)確定為體積分數(shù)為0.2%的甲酸水溶液，有機相(B)確定為甲醇和乙腈混合溶液(V(甲醇)∶V(乙腈)=65∶35)，色譜條件確定為：0～3 min，5% B；3～8 min，5%～15% B；8～20 min，15%～30% B；20～32 min，30%～50% B；32～35 min，50%～95% B；35～38 min，95% B；38～41 min，95%～5% B；41～45 min，5% B。另外，設定流速為1.0 mL/min，進樣量為10 μL，柱溫為30 ℃，檢測波長為270 nm。在此條件下，太平猴魁中的11種主要成分可實現(xiàn)很好的分離，分離度均大于1.5，且峰形對稱，無拖尾現(xiàn)象(見圖2)。

圖2 優(yōu)化后的太平猴魁HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of Taiping Houkui after optimization

3 HPLC檢測方法評價

3.1 線性關系評價

太平猴魁中各待測成分的線性關系考察結果見表1。由表1可知，所有回歸方程的相關系數(shù)R2≥0.999 9，表明在質量濃度檢測范圍內，11種成分的線性關系良好。

表1 太平猴魁中各待測成分的線性關系考察結果Table 1 Linear regression data of the analytes in Taiping Houkui

3.2 精密度評價

精密吸取同一質量濃度混合標準品溶液，按優(yōu)化后的HPLC檢測方法重復檢測6次，記錄各成分的色譜峰面積及相對峰面積的相對標準偏差(RSD)。結果顯示，11種待測成分的色譜峰面積RSD介于0.31%～1.39%之間，保留時間RSD介于0.27%～0.55%之間，表明優(yōu)化后的HPLC檢測方法精密度良好。

3.3 重復性評價

以S1為例，取樣品溶液6份，按優(yōu)化后的HPLC檢測方法分別進行定量分析，并以外標法計算11種待測成分含量及其RSD。結果顯示，S1的GA、5-GC、GC、TB、EGC、Cat、EC、Caf、EGCG、GCG、ECG平均含量分別為0.11 μg/g、1.99 μg/g、1.39 μg/g、0.51 μg/g、40.90 μg/g、1.60 μg/g、8.37 μg/g、18.15 μg/g、49.24 μg/g、0.21 μg/g和12.23 μg/g，RSD介于0.94%～1.92%之間，表明優(yōu)化后的HPLC檢測方法重復性良好。

3.4 穩(wěn)定性評價

以S1為例，取樣品溶液于室溫放置0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h，按優(yōu)化后的HPLC檢測方法分別進行定量分析，計算可得11種待測成分色譜峰面積RSD在0.26%～3.75%范圍內，表明供試樣品溶液在室溫條件下放置48 h內的主要成分含量穩(wěn)定。

3.5 回收率評價

以S1為例，取樣品9份，每份約1.0 g，分成3組，分別精密加入含GA、5-GC、GC、TB、EGC、Cat、EC、Caf、EGCG、GCG、ECG的混合標準品溶液0.5 mL、2.0 mL、5.0 mL，按1.1所述方法制備供試樣品溶液，然后按優(yōu)化后的HPLC檢測方法分別進行定量分析，計算11種待測成分的平均加標回收率及其RSD。結果顯示，GA、5-GC、GC、TB、EGC、Cat、EC、Caf、EGCG、GCG、ECG的平均加標回收率分別為98.0%、101.6%、98.7%、99.5%、100.7%、99.1%、102.4%、100.4%、99.8%、99.2%、99.0%；RSD分別為2.5%、4.1%、2.6%、1.9%、2.9%、3.6%、2.8%、1.7%、2.3%、3.7%、2.6%。這表明優(yōu)化后的HPLC檢測方法具有較好的回收率。

4 HPLC指紋圖譜的建立與相似度評價

鑒于優(yōu)化后的HPLC檢測方法具有良好的精密度、重復性、穩(wěn)定性和較好的回收率，可用于核心產(chǎn)地太平猴魁的定量分析，取S1-S10樣品溶液，利用外標法計算其11種主要成分含量(見表2)，并記錄HPLC色譜圖。

表2 核心產(chǎn)地太平猴魁中11個主要成分含量測定結果Table 2 Contents of 11 analytes in Taiping Houkui from core producing area mg/g

將10種太平猴魁供試樣品的色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)進行分析，以S1色譜圖為參照圖譜，時間窗寬度設定為0.3 s，經(jīng)過多點校正、自動匹配后得到太平猴魁HPLC指紋圖譜，如圖3所示。由圖3可知，通過與標準品保留時間比對，共鑒定出11個共有峰，分別為GA、5-GC、GC、TB、EGC、Cat、EC、Caf、EGCG、GCG、ECG，其中，Caf出峰時間適中、峰面積較大、對稱性較好，可將其作為參照峰，分別計算其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算相應的RSD，結果見表3。由表3可知，共有峰相對保留時間RSD均小于2.73%，相對峰面積RSD均小于15.30%，表明本研究建立的HPLC指紋圖譜是一種穩(wěn)定的、重現(xiàn)性較好的方法，可以用于評定太平猴魁的品質。EGCG的相對峰面積RSD>15%，表明該成分在不同樣品中的差異較大，這可能是因為在加工過程中EGCG發(fā)生了不同程度的降解[17-18]。

表3 太平猴魁HPLC指紋圖譜的11個共有峰的相對保留時間和相對峰面積Table 3 Relative retention time and relative peak area of 11 common peaks in HPLC fingerprints of Taiping Houkui

圖3 核心產(chǎn)地太平猴魁的HPLC指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of Taiping Houkui from core producing area

將太平猴魁樣品的HPLC指紋圖譜分別導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)，計算各樣品的指紋圖譜與對照色譜圖(S1)之間的相似度。結果顯示，各太平猴魁相似度為0.982～0.992，表明這10種太平猴魁樣品的品質成分相似，建立的HPLC指紋圖譜可以作為太平猴魁的參考指紋信息用于鑒定和評價太平猴魁的品質。

5 多元統(tǒng)計分析

5.1 PCA結果分析

為判別不同產(chǎn)地太平猴魁的品質差異，從非核心產(chǎn)地龍門鄉(xiāng)東坑(D1—D4)和汪王嶺(W1—W4)兩地各取樣4種，按照1.1方法制備非核心產(chǎn)地供試樣品，并按優(yōu)化后的HPLC檢測方法進樣定量分析。采用UV scaling法將定量分析結果與核心產(chǎn)地太平猴魁樣品定量分析結果進行歸一化處理，并導入Simca-P 14.1軟件進行PCA分析。通過PCA分析所提取的2個主成分PC1和PC2的累計貢獻率為63.9%，可反映太平猴魁主要成分含量的大部分信息。不同產(chǎn)地太平猴魁的PCA得分圖如圖4所示。

由圖4可知，來自核心產(chǎn)地與非核心產(chǎn)地的太平猴魁樣品在PCA中實現(xiàn)了較好的分離，各樣品在圖中按照產(chǎn)地聚集，表明利用PCA分析可以有效區(qū)分不同產(chǎn)地太平猴魁。

圖4 不同產(chǎn)地太平猴魁的PCA得分圖Fig.4 PCA score plot of Taiping Houkui tea from different producing areas

5.2 OPLS-DA結果分析

PCA分析是一種無監(jiān)督的模型驗證方法，不能消除組內噪音，而OPLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分析方式，更能突出組間差異[19]。采用Simca-P 14.1軟件對來自不同產(chǎn)地的太平猴魁主要成分含量進行OPLS-DA分析，結果如圖5所示。由圖5可知，不同產(chǎn)地太平猴魁均按其產(chǎn)地聚為一類。擬合模型R2X=0.635，R2Y=0.891，Q2=0.802，均大于0.5，表明該模型擬合效果較好，預測結果可靠，可用于對太平猴魁產(chǎn)地進行判別。變量重要性投影值(Variable Importance in Projection，VIP)常用來衡量各變量對各組樣本分類判別的影響強度和解釋能力，其值越大，代表變量越重要，一般以VIP>1的變量作為生物標志物。不同產(chǎn)地太平猴魁OPLS-DA模型中不同變量的VIP如圖6所示。由圖6可知，11種主要成分中共篩選出6種生物標志物，即EC、GC、Cat、TB、EGC和Caf可作為區(qū)分太平猴魁是否來自核心產(chǎn)地的特征性成分。

圖5 不同產(chǎn)地太平猴魁OPLS-DA得分圖Fig.5 OPLS-DA score plot of Taiping Houkui tea from different producing areas

圖6 不同產(chǎn)地太平猴魁OPLS-DA模型中不同變量的VIP Fig.6 VIP of different variable in OPLS-DA model for Taiping Houkui from different producing areas

6 結論

本文在前期研究的基礎上，對太平猴魁的HPLC檢測方法進行了優(yōu)化，基于前期甲醇和乙腈單獨作為有機相時均不能很好實現(xiàn)成分分離的問題，最終確定流動相中水相A為體積分數(shù)為0.2%的甲酸水溶液，有機相B為甲醇和乙腈混合溶液(V(甲醇)∶V(乙腈)=65∶35)，在此條件下，HPLC色譜圖中11種化合物各峰無干擾，分離度均大于1.5，且峰形對稱，無拖尾現(xiàn)象，該方法具有良好的精密度、重復性、穩(wěn)定性和較好的回收率。核心產(chǎn)地10種太平猴魁的HPLC指紋圖譜中，11種主要成分的相對保留時間RSD均小于2.73%，相似度為0.982～0.992，表明本文建立的HPLC指紋圖譜是一種穩(wěn)定、重現(xiàn)性較好的方法，可以作為太平猴魁品質評定的可靠方法。利用PCA對不同產(chǎn)地太平猴魁樣品進行分析發(fā)現(xiàn)，來自核心產(chǎn)地與非核心產(chǎn)地的樣品分別聚集成類，提取得到兩個主成分累計貢獻率達63.9%，可反映太平猴魁主要成分含量的大部分信息。進一步的OPLS-DA分析則顯示了該方法較為可靠的產(chǎn)地預測能力，通過各成分VIP的確定發(fā)現(xiàn)EC、GC、Cat、TB、EGC、Caf這6種成分在不同產(chǎn)地樣品中差異較大，可作為區(qū)分是否來自核心產(chǎn)地的特征成分。該研究可為太平猴魁的產(chǎn)地判別和品質鑒定提供參考，為進一步完善太平猴魁品質標準的制定提供理論依據(jù)。