結(jié)直腸癌患者血漿外泌體中miR-590-3p的表達(dá)及其臨床意義

段吉舫 楊朝綱 向賢慧

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率和死亡率分別位居所有惡性腫瘤的第三位和第二位［1］。目前盡管CRC患者預(yù)后有所改善［2］，但是其早期診斷手段仍有限，確診時(shí)大部分患者伴淋巴轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致治療效果欠佳［3］。因此仍需尋找新的診斷及預(yù)后評(píng)估生物標(biāo)志物，以制定個(gè)體化治療策略，改善患者臨床結(jié)局。外泌體檢測(cè)作為新興的“液體活檢”技術(shù)，具有便捷、非侵入性且可以動(dòng)態(tài)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)［4］。微小RNA（microRNA，miR）是外泌體中含量最豐富的生物活性物質(zhì)，在外泌體介導(dǎo)的惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色［5］，檢測(cè)血漿外泌體miRNAs的表達(dá)水平也可用于輔助評(píng)估患者預(yù)后［6］。miR-590-3p是一種癌癥相關(guān)非編碼RNA，已被發(fā)現(xiàn)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［7-8］。研究報(bào)道，miR-590-3p可通過(guò)靶向抑制WIF1和DKK1激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖［7］。近期研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-590-3p可通過(guò)誘導(dǎo)CRC細(xì)胞放療抵抗，從而促進(jìn)其進(jìn)展與轉(zhuǎn)移［9］。然而，血漿外泌體來(lái)源的miR-590-3p在CRC患者中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系尚未清楚?；诖耍狙芯繑M通過(guò)檢測(cè)CRC患者血漿外泌體中miR-590-3p的表達(dá)水平，并分析其與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，以期闡明miR-590-3p在CRC中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性收集2015年1月至2015年12月在利川市人民醫(yī)院、武漢大學(xué)中南醫(yī)院住院并接受手術(shù)治療的97例CRC患者的血漿樣本。所有患者均于術(shù)前收集晨起空腹外周靜脈血5 mL，30～60 min內(nèi)進(jìn)行離心處理，分離血漿并保存于-80℃中備用。同時(shí)，收集我院體檢中心同期20名健康人的血漿樣本作為對(duì)照?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)病理確診為結(jié)直腸腺癌；⑵術(shù)前均未接受放療、化療等抗腫瘤治療；⑶術(shù)后病理分期為Ⅱ～Ⅲ期，且接受以5-氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的術(shù)后輔助放/化療；⑷具有完整的臨床病理資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴術(shù)前已轉(zhuǎn)移或接受姑息性切除術(shù)；⑵5年內(nèi)有其他惡性腫瘤病史；⑶伴有感染，或妊娠者。本研究中健康人群符合以下定義：⑴年齡＜35周歲；⑵全身體檢（包括胃腸鏡）結(jié)果正常。本研究經(jīng)利川市人民醫(yī)院和武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：2015137；2015012），所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要材料及儀器

主要材料：ExoQuick Exosome Precipitation Solution試劑盒（System Biosciences，USA），BCA試劑盒（碧云天，中國(guó)），TSG101、CD63和Calnexin抗體（Abcam，USA），miRNeasy serum/plasma micro kit（Qiagen，Valencia，CA，USA），synthetic C.elegans miRNA 試劑（Applied Biosystems，USA），TaqMan miRNA assays試劑盒（Applied Biosystems，USA），cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Applied Biosystems，USA），RT primer（廣州銳博生物科技有限公司，中國(guó)），SYBR Green PCR Master Mix（Applied BiStudioystems，USA）；主要儀器：透射電子顯微鏡（FEI Tecnai G2 Spirit，Thermo science，USA），NanoSightLM10（MalvernInstrumentsInc.，UK），ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)儀器（Bio-Rad，USA）。

1.3 研究方法

1.3.1 外泌體提取和鑒定 采用ExoQuick Exosome Precipitation Solution試劑盒并根據(jù)說(shuō)明書(shū)分離血漿中的外泌體。取血清樣本500 μL，加入126 μL ExoQuick試劑，上下顛倒混勻后置于4℃冰箱中孵育30 min，然后于室溫下以1 500 g離心30 min，去除上清液后加入200μLPBS緩沖液混勻重懸，最終獲得血漿外泌體懸液。

采用透射電鏡鑒定血漿外泌體，觀察外泌體形態(tài)，簡(jiǎn)要步驟如下：將外泌體滴入銅網(wǎng)，用2%磷鎢酸復(fù)染2 min。風(fēng)干15 min后，置于80 kV透射電子顯微鏡中進(jìn)行觀察，典型的外泌體形態(tài)通常為茶托型或一側(cè)凹陷的半球形；采用NanoSight LM10檢測(cè)外泌體的粒徑，簡(jiǎn)要步驟如下：提取的外泌體經(jīng)PBS重懸后，用無(wú)菌0.22 μm濾器過(guò)濾，然后利用無(wú)菌水對(duì)其進(jìn)行1∶3 000稀釋，約稀釋為1 mL懸液，上樣進(jìn)行分析，具體參照儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.2 Western blot法檢測(cè)外泌體特異性標(biāo)記蛋白TSG101、CD63的表達(dá)水平 提取外泌體中的總蛋白，應(yīng)用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。配制10%分離膠和5%濃縮膠，電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉后，孵育鼠抗人TSG101、CD63和Calnexin抗體（稀釋比例為1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜；TBST緩沖液洗滌3次后，滴加兔抗鼠二抗，室溫?fù)u床孵育1 h；再用TBST緩沖液洗滌3次，將PVDF膜置于ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)儀器中掃膜，用Image Lab軟件系統(tǒng)處理圖像。以Calnexin為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 RT-qPCR法檢測(cè)血漿外泌體中miR-590-3p的表達(dá)水平 采用miRNeasy serum/plasma micro kit試劑盒提取外泌體中的RNA，通過(guò)在每個(gè)血漿樣本中添加25 fmol的synthetic C.elegans miRNA試劑（cel-miR-39）進(jìn)行樣品均一化。然后，利用TaqMan miRNA assays試劑盒檢測(cè)血漿外泌體中miR-590-3p的表達(dá)水平，主要步驟如下：取1 μg RNA按照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA），加入SYBR Green PCR Master Mix，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95℃、10 min預(yù)變性；95℃、15 s變性；60℃、1 min退火延伸，45個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次。引物序列：miR-590-3p（F序列為5′-AAGGAGCUUACAAUCUAGCUGGG-3′，R序列為5′-CAGCUAGAUUGUAAGCUCCUUUU-3′）；cel-miR-39（5′-GGTCACCGGGTGTAAATCAGCTTG-3′）。以celmiR-39為內(nèi)參，結(jié)果以2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 資料收集及隨訪 通過(guò)醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)收集患者年齡、性別、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、淋巴脈管浸潤(rùn)情況及TNM分期等臨床病理資料。采用電話隨訪或門(mén)診復(fù)診等方式進(jìn)行隨訪，術(shù)后2年內(nèi)每3個(gè)月隨訪1次；術(shù)后2～5年每半年隨訪1次；術(shù)后5年后每年隨訪1次，隨訪截止時(shí)間為2020年12月31日。記錄患者的總生存期（overall survival，OS），OS定義為自確診之日至患者死亡或最后1次隨訪日期。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用χ2檢驗(yàn)分析血漿外泌體中miR-590-3p與患者臨床病理特征的關(guān)系；采用Kaplan-Meier計(jì)算生存率并繪制生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)比較組間生存率；采用單因素Cox回歸分析與CRC患者OS相關(guān)的因素，將單因素分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素納入多因素Cox回歸模型分析影響CRC患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以雙側(cè)P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿外泌體的鑒定

透射電鏡掃描顯示，正常健康人和CRC患者血漿中的外泌體均呈現(xiàn)典型的囊泡狀結(jié)構(gòu)，且單位體積CRC患者血漿外泌體中的數(shù)目明顯多于健康對(duì)照組（圖1A～B）；NanoSight分析結(jié)果顯示，正常健康人和CRC患者血漿外泌體呈不規(guī)則的布朗運(yùn)動(dòng)，粒徑在50～200 nm之間，其中多數(shù)集中在100 nm左右，1 mL腫瘤患者血漿中的外泌體數(shù)目約為8×106個(gè)，明顯多于同等體積健康對(duì)照組的5×106個(gè)（圖1C）；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，健康對(duì)照組和CRC患者血漿外泌體均表達(dá)CD63和TSG101，而不表達(dá)骨架蛋白Calnexin，且CRC患者血漿外泌體中的CD63和TSG101表達(dá)強(qiáng)度明顯高于健康對(duì)照者（圖1D）。

圖1 CRC患者及健康對(duì)照者血漿外泌體的鑒定Fig.1 Identification of plasma exosomes from CRC patients and healthy controls

2.2 血漿外泌體miR-590-3p表達(dá)水平與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，CRC患者血漿外泌體中miR-590-3p的表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組（7.163±0.147vs1.339±0.161，P＜0.001），見(jiàn)圖2。以血漿外泌體中miR-590-3p表達(dá)水平的中位數(shù)（5.18）為界，將97例CRC患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示，血漿外泌體miR-590-3p高表達(dá)與腫瘤分化程度差、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量多、淋巴脈管浸潤(rùn)陽(yáng)性及TNM分期晚有關(guān)（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

圖2 CRC患者及健康對(duì)照者血漿外泌體中miR-590-3p的表達(dá)水平Fig.2 Expression of miR-590-3p in plasma exosomes from CRC patients and healthy controls

表1 血漿外泌體miR-590-3p表達(dá)水平與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系（n=97）Tab.1 Relationship between plasma exosomal miR-590-3p expression level and clinicopathological characteristics of patients with CRC(n=97)

2.3 血漿外泌體miR-590-3p表達(dá)水平與CRC患者預(yù)后的關(guān)系

至隨訪結(jié)束，中位隨訪時(shí)間為53個(gè)月，失訪9例，死亡49例（其中低表達(dá)組16例，高表達(dá)組33例）。Kaplan-Meier生存分析顯示，血漿外泌體miR-590-3p高表達(dá)組CRC患者的1、3、5年生存率分別為100.0%、55.1%、32.7%，低表達(dá)組分別為100.0%、83.3%、66.7%；高表達(dá)組生存率低于低表達(dá)組患者（χ2=8.544，P=0.003），見(jiàn)圖3。單因素分析結(jié)果顯示，腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴脈管浸潤(rùn)、神經(jīng)侵犯、TNM分期和血漿外泌體miR-590-3p表達(dá)水平與OS有關(guān)（均P＜0.05）；多因素Cox回歸模型分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、TNM分期Ⅲ期和血漿外泌體miR-590-3p高表達(dá)是影響OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

圖3 CRC患者血漿外泌體miR-590-3p表達(dá)水平與OS的關(guān)系Fig.3 Relationship between plasma exosomal miR-590-3p expression level and OS in CRC patients

表2 影響CRC患者OS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素的單因素和多因素分析Tab.2 Univariable and multivariable analyses of risk factors affecting OS in CRC patients

3 討論

外泌體是一種直徑為50～150 nm的微小囊泡，幾乎所有類型的細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞都可以分泌外泌體，其中外泌體在腫瘤發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和血管生成作用，可能是理想的診斷和預(yù)后評(píng)估標(biāo)志物，而外泌體介導(dǎo)的治療也被認(rèn)為是腫瘤綜合治療的潛在策略［4］。外泌體在CRC中同樣顯示出以上優(yōu)勢(shì)［10］，其傳遞的miRNA已被證實(shí)在CRC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色［5］。此外，結(jié)合外泌體包裹的miRNA可以在患者血漿中保持穩(wěn)定，因此其可能作為一種非侵入性、便捷及敏感的標(biāo)志物而用于協(xié)助CRC的早期診斷和預(yù)后評(píng)估［11］。既往研究顯示，循環(huán)中裸露的miRNAs可被內(nèi)源產(chǎn)生的RNase迅速降解，而外泌體的包裹可保護(hù)miRNAs免受RNase降解［12］。因此，相較于循環(huán)中的總miRNA，檢測(cè)血漿外泌體中的miRNA更為準(zhǔn)確。當(dāng)前，惡性腫瘤患者循環(huán)血漿外泌體miRNA檢測(cè)已被證實(shí)是一種簡(jiǎn)單且可靠的早期診斷和預(yù)后評(píng)估手段［5，13］。如ZHENG等［14］研究發(fā)現(xiàn)miR-590-5p在胃癌患者血漿外泌體中呈低表達(dá)，且其低表達(dá)與患者總生存率降低顯著相關(guān)，可作為早期診斷標(biāo)志物及預(yù)后評(píng)估的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。WU等［15］研究顯示，miR-1290在肺腺癌患者血清外泌體中的表達(dá)較健康對(duì)照組顯著上調(diào)，miR-1290高表達(dá)還與腫瘤分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，生存分析也證實(shí)血清外泌體miR-1290高表達(dá)患者的無(wú)進(jìn)展生存期明顯短于低表達(dá)患者。在CRC中，多個(gè)血漿外泌體miRNAs也已被證實(shí)可用于早期輔助診斷和預(yù)后評(píng)估，如循環(huán)血漿外泌體miR-27a和miR-130a在CRC診斷中顯示了良好的特異度和靈敏度［16］；血清外泌體miR-548c-5p下調(diào)預(yù)示患者預(yù)后不良［17］；而高水平的血漿外泌體miR-6803-5p是影響患者無(wú)進(jìn)展生存期和OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［18］。本研究通過(guò)評(píng)估CRC患者血漿外泌體中miR-590-3p的表達(dá)水平及其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，證實(shí)了miR-590-3p在CRC患者血漿外泌體中呈高表達(dá)，且其高表達(dá)與多種不良臨床病理因素及OS縮短相關(guān)；在調(diào)整其他混雜因素后，循環(huán)血漿外泌體miR-590-3p高表達(dá)仍是影響CRC患者預(yù)后的獨(dú)立因危險(xiǎn)因素。上述研究結(jié)果表明，血漿外泌體miR-590-3p可能是CRC預(yù)后評(píng)估的潛在標(biāo)志物。

血漿外泌體miRNAs在評(píng)估CRC治療療效中也顯示出了潛在的預(yù)測(cè)價(jià)值。LIU等［19］報(bào)道，在接受FOLFOX方案化療的Ⅲ期CRC患者中，與血漿外泌體miR-4772-3p高表達(dá)組相比，低表達(dá)組中90%的患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，顯示了外泌體miRNA對(duì)輔助化療反應(yīng)的潛在預(yù)測(cè)價(jià)值。JIN等［20］也發(fā)現(xiàn)CRC患者血清外泌體miRNAs（包括miR-21-5p、miR-1246、miR-1229-5p和miR-96-5p）在評(píng)估傳統(tǒng)化療敏感性中展現(xiàn)出良好的效能，其中敏感度為78.0%，特異度為88.9%。而本研究結(jié)果也提示血漿外泌體miR-590-3p高表達(dá)的CRC患者可能具有更高的腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)及更差的預(yù)后，因此在治療過(guò)程中通過(guò)檢測(cè)miR-590-3p也可能有助于預(yù)測(cè)治療效果并對(duì)預(yù)后進(jìn)行分層，從而為患者制定個(gè)體化的治療方案，最終改善臨床結(jié)局。

綜上所述，miR-590-3p在CRC患者血漿外泌體中高表達(dá)且預(yù)示腫瘤惡性進(jìn)展和不良預(yù)后，miR-590-3p具有成為CRC預(yù)后評(píng)估生物標(biāo)志物的潛力。但本研究納入樣本量仍較少，且未囊括所有分期，因此血漿外泌體miR-590-3p在CRC中的作用以及通過(guò)調(diào)控下游哪些靶基因發(fā)揮作用仍需進(jìn)一步探索。