肝臟駐留自然殺傷細(xì)胞在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用

王俊旗， 徐 鋒

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 普通外科， 沈陽(yáng) 110004

目前，原發(fā)性肝癌仍是威脅人類(lèi)健康的重要癌癥，其中肝細(xì)胞癌(HCC)約占85%[1]。針對(duì)HCC，由于傳統(tǒng)治療手段(如手術(shù)切除、肝移植、消融、放化療等)的局限性，免疫治療有望成為一種能讓更多患者受益的治療手段[2-3]。然而，當(dāng)前針對(duì)免疫檢查點(diǎn)(如PD-1、CTLA-4)的治療僅在一部分HCC患者中產(chǎn)生持續(xù)效應(yīng)。免疫檢查點(diǎn)治療主要作用于T淋巴細(xì)胞，而肝臟作為免疫器官，先天性淋巴細(xì)胞(innate lymphoid cells，ILC)約占肝淋巴細(xì)胞的65%，這些ILC在肝臟抗病原體和抗腫瘤過(guò)程中同樣發(fā)揮著重要作用，可能成為免疫治療研究的新方向[4-5]。在ILC中，自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞具有促進(jìn)肝免疫耐受和抗腫瘤的雙重作用[5-6]。最近有研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，肝臟中存在一種獨(dú)特的NK細(xì)胞亞群，它們以組織駐留的形式常駐于肝臟中且表現(xiàn)出與傳統(tǒng)NK(conventional NK，cNK)細(xì)胞不同的表型和發(fā)育特征，這種NK細(xì)胞被稱(chēng)為肝臟駐留NK(liver-resident NK，LrNK)細(xì)胞。隨著對(duì)LrNK細(xì)胞的進(jìn)一步研究，其功能和作用逐漸明晰。本文重點(diǎn)綜述LrNK細(xì)胞在HCC研究中的最新進(jìn)展，并探討其在HCC免疫治療中的潛在價(jià)值。

1 LrNK細(xì)胞

1.1 小鼠LrNK細(xì)胞 LrNK細(xì)胞最早發(fā)現(xiàn)于小鼠肝臟內(nèi)，當(dāng)時(shí)被稱(chēng)為“凹陷細(xì)胞”，后經(jīng)研究證實(shí)，它是駐留在肝竇中具有高度細(xì)胞毒性的NK細(xì)胞[9]。通過(guò)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD49a和DX5可將小鼠肝臟NK細(xì)胞劃分為CD49a+DX5-和CD49a-DX5+兩類(lèi)，前者為L(zhǎng)rNK細(xì)胞，后者類(lèi)似于脾臟cNK細(xì)胞[10]。兩者的發(fā)育路徑不同，分別由共同輔助樣先天淋巴祖細(xì)胞和NK祖細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，且LrNK細(xì)胞中成熟相關(guān)表面標(biāo)志物(如CD11b、Ly49受體、CD43和KLRG1)的表達(dá)水平更低[10-11]。小鼠LrNK細(xì)胞具有較強(qiáng)的組織駐留特性，只存在于肝竇血液中，而不存在于肝臟的輸入和輸出血液中[10]。

1.2 人LrNK細(xì)胞 在人肝臟中存在大量從血液轉(zhuǎn)運(yùn)而來(lái)的未成熟CD16-NK細(xì)胞，這些NK細(xì)胞在肝內(nèi)可以分化為CD49a+和CXCR6+NK細(xì)胞，從而駐留在肝臟[12]。此外，近50%的肝臟NK細(xì)胞為CD56+，且都位于肝竇內(nèi)。肝內(nèi)CD56+NK細(xì)胞表達(dá)多種趨化因子受體如CCR5和CXCR6，這些受體與NK細(xì)胞的肝臟駐留密切相關(guān)。它們能促使NK細(xì)胞選擇性地向其相應(yīng)的配體遷移(如CCR5配體CCL3、CCL5，以及CXCR6配體CXCL16)并與之結(jié)合使NK細(xì)胞駐留于肝組織[5,13]。研究[5]表明，某些趨化因子(如CCL3、CCL5、CXCL16)選擇性存在于肝竇間隙，這有助于表達(dá)CCR5和CXCR6的CD56+NK細(xì)胞特異性地駐留于肝竇內(nèi)。與CD56+NK細(xì)胞相比，CD56-NK細(xì)胞不表達(dá)上述趨化因子受體，而表達(dá)與循環(huán)免疫細(xì)胞歸巢到周?chē)M織有關(guān)的趨化因子受體如CX3CR1，在轉(zhuǎn)錄和表型上與外周循環(huán)中的NK細(xì)胞更相似。

然而，CD56和CXCR6的表達(dá)都不能準(zhǔn)確定義人LrNK細(xì)胞的肝臟駐留特性，因?yàn)橥庵芙M織和血液中也存在CD56+和CXCR6+NK細(xì)胞群。目前存在一種共識(shí)，即區(qū)分人類(lèi)cNK細(xì)胞和LrNK細(xì)胞的最好方法是通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Eomes的表達(dá)。Eomes高表達(dá)T-bet低表達(dá)(EomeshiT-betlo)NK細(xì)胞約占人類(lèi)肝臟NK細(xì)胞的50%，但完全不存在于血液之中，并且與CD56+和CXCR6+細(xì)胞群大部分重疊。盡管如此，人肝臟中的EomeshiNK細(xì)胞群體與CD49a+NK細(xì)胞群體并不重疊，這表明在人類(lèi)肝臟中可能存在兩種類(lèi)型的LrNK細(xì)胞，其中CD49a+LrNK細(xì)胞存在于肝實(shí)質(zhì)，而EomeshiT-betloNK細(xì)胞則存在于肝竇內(nèi)[14]?？傊孕韪嘌芯堪l(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞表面標(biāo)志物去準(zhǔn)確定義人LrNK細(xì)胞。

2 LrNK細(xì)胞免疫功能

2.1 免疫記憶 作為固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，ILC由于缺乏RAG重組酶而不能表達(dá)多種抗原受體，因此過(guò)去人們認(rèn)為其不具有適應(yīng)性免疫功能(即免疫記憶)。但最近的研究[15-16]發(fā)現(xiàn)，在特定條件下ILC也能顯示出其潛在的記憶功能。Peng等[10]證實(shí)了小鼠LrNK細(xì)胞能夠在半抗原的刺激下介導(dǎo)接觸性超敏反應(yīng)并產(chǎn)生記憶應(yīng)答，當(dāng)機(jī)體再次接觸相同半抗原時(shí)能增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷作用。

芳烴受體(aryl hydrocarbon receptor，Ahr)是一種受外源性和內(nèi)源性配體調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)屏障部位免疫細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)起著重要作用。在小鼠肝臟中， LrNK細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)Ahr，且Ahr能維持LrNK細(xì)胞的半抗原記憶功能[17]。此外，人類(lèi)CD49a+LrNK細(xì)胞能夠表達(dá)殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptors, KIR)和NKG2C，且在體外培養(yǎng)長(zhǎng)期擴(kuò)增后仍能保持原有表型，這都說(shuō)明人類(lèi)LrNK細(xì)胞也可能具有適應(yīng)性免疫功能[18]。然而，LrNK細(xì)胞成熟相關(guān)表面標(biāo)志物的表達(dá)水平較低，說(shuō)明其相對(duì)于cNK細(xì)胞來(lái)說(shuō)較不成熟，這種幼稚性并不利于免疫記憶。因此，LrNK細(xì)胞的免疫記憶功能還有待進(jìn)一步研究。

2.2 免疫調(diào)節(jié) 肝臟不同部位的LrNK細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)功能上有所不同。人肝實(shí)質(zhì)中的CD49a+LrNK表達(dá)MHC-Ⅰ類(lèi)受體和細(xì)胞毒性效應(yīng)分子，這可能與識(shí)別并殺死病毒感染或癌變的肝細(xì)胞有關(guān)；而存在于肝血竇中的EomeshiLrNK則較少表達(dá)MHC受體，它們可能更多地識(shí)別來(lái)源于腸道的細(xì)菌及其產(chǎn)物，并產(chǎn)生殺傷作用[14]。此外，與血液中的NK細(xì)胞相比，EmosehiLrNK細(xì)胞表面刺激性受體(NKp44、NKp46和NKG2D)表達(dá)增加，細(xì)胞毒性作用增強(qiáng)但產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子(如IFNγ)的能力降低[13]。這表明LrNK細(xì)胞也許能在保留免疫監(jiān)視功能的前提下削弱自身促炎癥作用對(duì)組織的病理?yè)p傷。有研究[19-21]發(fā)現(xiàn)，LrNK細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞之間存在著相互調(diào)節(jié)的作用。一方面，CD8+T淋巴細(xì)胞通過(guò)CD70/CD27信號(hào)促進(jìn)未成熟的CD27+LrNK細(xì)胞向成熟的CD27LrNK細(xì)胞轉(zhuǎn)化；另一方面，LrNK細(xì)胞可以通過(guò)免疫抑制信號(hào)PD-1/PD-L1來(lái)削弱肝內(nèi)T淋巴細(xì)胞的抗病毒作用。還有研究[22]報(bào)道，小鼠LrNK細(xì)胞中的DX5-CD11chi亞型能夠通過(guò)抑制CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖從而抑制自身免疫性膽管炎的進(jìn)展，并且這種抑制作用在炎癥環(huán)境下尤為明顯。目前，對(duì)LrNK細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的認(rèn)識(shí)尚不深入，還需更多研究去闡明其免疫調(diào)節(jié)作用的內(nèi)在機(jī)制。

3 LrNK細(xì)胞與HCC的發(fā)生發(fā)展

3.1 LrNK細(xì)胞與肝炎、肝纖維化以及肝硬化 肝炎、肝纖維化以及肝硬化是HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，LrNK細(xì)胞在這些肝臟疾病中均發(fā)揮一定作用[23]。病毒性肝炎初期，NK細(xì)胞能夠直接識(shí)別并清除病毒感染的肝細(xì)胞，但CD8+T淋巴細(xì)胞仍是發(fā)揮抗病毒作用的主要免疫細(xì)胞[24-25]。Zheng等[25]通過(guò)建立小鼠HBV肝炎模型，發(fā)現(xiàn)cNK細(xì)胞能夠通過(guò)產(chǎn)生IFNγ誘導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞的活化，從而間接發(fā)揮抗HBV的作用，但LrNK細(xì)胞卻不存在上述調(diào)節(jié)作用。另有研究[26-27]表明，在病毒性肝炎進(jìn)展中，盡管LrNK細(xì)胞表面激活性受體NKp46和NKG2D表達(dá)有所上調(diào)，但腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)的表達(dá)下調(diào)以及脫顆粒能力的減弱,最終導(dǎo)致LrNK細(xì)胞的細(xì)胞毒性受損。在肝纖維化過(guò)程中，γδT細(xì)胞能通過(guò)CD137/CD137L信號(hào)促進(jìn)LrNK細(xì)胞的活化并上調(diào)其表面細(xì)胞毒性效應(yīng)分子(如穿孔素) 。活化的LrNK細(xì)胞能夠誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞(HSC)凋亡，并且有效殺傷活化的HSC，從而抑制肝纖維化的進(jìn)程[28]。然而，在肝纖維化進(jìn)展為肝硬化的過(guò)程中，LrNK細(xì)胞中NKp46和穿孔素的表達(dá)均減少，其對(duì)HSC的殺傷作用也明顯減弱[29-31]。LrNK細(xì)胞在不同肝臟狀態(tài)下的功能改變?nèi)鐖D1所示。

注：a，在正常肝臟中，LrNK細(xì)胞高表達(dá)NKp44、NKp46和NKG2D，低表達(dá)IFNγ[13]；b，在病毒性肝炎中，LrNK細(xì)胞NKp46和NKG2D表達(dá)水平升高，但其TRAIL的表達(dá)以及脫顆粒能力減弱[26-27]；c，在肝纖維化和肝硬化中，LrNK細(xì)胞NKp46、CD161的表達(dá)及穿孔素的分泌減少，且對(duì)HSC的殺傷活性受到抑制[29-31]；d，在HCC中，LrNK細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)(TIM-3、LAG-3、TIGIT)表達(dá)上調(diào)，且抗腫瘤活性(NKG2D、TRAIL、FASL)受到抑制[32-34]。

3.2 LrNK細(xì)胞在HCC進(jìn)展中的作用 NK細(xì)胞具有很好的抗HCC活性，但在HCC的進(jìn)展過(guò)程中，NK細(xì)胞的數(shù)量及細(xì)胞毒性發(fā)生了改變。不同分期HCC患者的肝內(nèi)NK細(xì)胞數(shù)量均有所減少，且這種減少在晚期(Ⅱ期和Ⅲ期)HCC患者中尤其顯著[35]。此外，與早期(Ⅰ期)HCC患者相比，晚期HCC患者肝內(nèi)NK細(xì)胞分泌顆粒酶B和穿孔素的能力明顯下降，細(xì)胞毒性嚴(yán)重受損[35]。這說(shuō)明隨著HCC的進(jìn)展，肝內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量下降、功能受損，最終導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸。與之相似，LrNK細(xì)胞在HCC進(jìn)展中的不同時(shí)期也發(fā)揮著不同的作用。早期HCC中，LrNK細(xì)胞通過(guò)NKG2D、TRAIL和FASL等表面受體能夠有效清除癌變的肝細(xì)胞，維持正常肝臟微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[34]。然而，隨著HCC的進(jìn)展，逐漸形成的HCC微環(huán)境影響了LrNK細(xì)胞的抗腫瘤活性。例如，在乳酸富集的HCC微環(huán)境中，LrNK細(xì)胞內(nèi)乳酸水平升高，由于自身NKp46、CD107a和顆粒酶B表達(dá)下調(diào)或線(xiàn)粒體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而失活[36]；IFNγ能夠增強(qiáng)造血前體細(xì)胞的增殖促進(jìn)LrNK細(xì)胞的發(fā)育，但HCC微環(huán)境中IFNγ水平明顯下降，這可能通過(guò)減少LrNK細(xì)胞的數(shù)量削弱其抗腫瘤作用[20-21,37]。

免疫檢查點(diǎn)作用機(jī)制是腫瘤進(jìn)展的重要原因之一。T淋巴細(xì)胞表面的免疫檢查點(diǎn)(如PD-1、CTLA-4)能通過(guò)抑制其腫瘤殺傷活性而促進(jìn)HCC細(xì)胞的免疫逃逸，且HCC微環(huán)境中的T淋巴細(xì)胞高表達(dá)免疫檢查點(diǎn)分子是晚期HCC的一個(gè)重要特征[38]。在HCC進(jìn)展過(guò)程中，腫瘤浸潤(rùn)性L(fǎng)rNK細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)T淋巴細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白3(T cell immunoglobulin and mucin domain 3, TIM-3)的表達(dá)明顯上調(diào)。TIM-3與HCC組織中的磷脂酰絲氨酸相互作用后發(fā)生磷酸化，磷酸化的TIM-3與PI3K的p110亞基競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合p85，隨后抑制下游的Akt/mTORC1信號(hào)，導(dǎo)致LrNK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子減少、細(xì)胞毒性作用減弱[39]。最新的研究[33,39]表明，除了TIM-3外，HCC組織內(nèi)的LrNK細(xì)胞還高表達(dá)PD-1、LAG-3、TIGIT等免疫檢查點(diǎn)分子，且瘤內(nèi)表達(dá)免疫檢查點(diǎn)LrNK細(xì)胞所占比例越高的患者更容易出現(xiàn)癌栓和無(wú)腫瘤包膜，總生存期和無(wú)病生存期也較短?？傊?，在HCC微環(huán)境的影響下，晚期HCC組織中的LrNK細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)分子表達(dá)上調(diào)，免疫功能受損，且可能導(dǎo)致患者預(yù)后不良。這說(shuō)明針對(duì)LrNK細(xì)胞的免疫治療可能對(duì)晚期HCC患者有益，但仍需更多研究進(jìn)一步闡明免疫檢查點(diǎn)在LrNK細(xì)胞中的作用機(jī)制及相關(guān)免疫治療的可行性。

4 小結(jié)與展望

目前，對(duì)于小鼠LrNK細(xì)胞的定義較為明確，而人LrNK細(xì)胞的定義則主要靠細(xì)胞表面標(biāo)志物(如CD49、CD96、CXCR6)和轉(zhuǎn)錄因子(如Eomes、T-bet)，且存在一定的爭(zhēng)議。如今公認(rèn)的人LrNK細(xì)胞表型主要包括CD56+CD49a+CD69+CD103+CXCR6-和CD56+EomeshiCD69+CD103-CXCR6+，但也有報(bào)道[40-41]稱(chēng)CD56+CD49e-CD69+CXCR6+NK細(xì)胞具有肝臟駐留特性。LrNK細(xì)胞可能具有記憶功能且能發(fā)揮較強(qiáng)的細(xì)胞殺傷作用，這對(duì)于機(jī)體的抗腫瘤免疫具有十分重要的意義。在HCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，LrNK細(xì)胞受到HCC環(huán)境中多種因素的影響而功能受損，同時(shí)通過(guò)上調(diào)相關(guān)免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)促進(jìn)HCC的免疫逃逸。綜上所述，LrNK細(xì)胞作為新近發(fā)現(xiàn)的組織駐留性NK細(xì)胞，有望成為HCC免疫治療的新靶點(diǎn)，但其發(fā)揮免疫作用的機(jī)制仍需要進(jìn)一步探索。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王俊旗、徐鋒負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，收集數(shù)據(jù)，資料分析，撰寫(xiě)論文并最后定稿。