枸杞黃酮提取方法的優(yōu)化以及不同生態(tài)因子與枸杞黃酮相關(guān)性研究

王鵬波，謝曉蓉 ，代云云，劉建書，陳 梅，張 霞，裴 棟, ，邸多隆

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州 730000；2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所，中國科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730000；3.陜西功能食品工程中心有限公司，陜西西安 710000）

枸杞（Lycium barbarumL.）是茄科植物寧夏枸杞的干燥成熟果實(shí)，具有補(bǔ)肝腎，益精血，明目的功效[1]。枸杞的主要化學(xué)成分有黃酮類、多糖類、氨基酸、維生素、生物堿類和礦物元素等[2-4]。現(xiàn)代研究表明，枸杞黃酮是其發(fā)揮抗氧化、抗衰老、治療心腦血管疾病等藥理活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[5-8]。因此，從枸杞中高效提取枸杞黃酮并應(yīng)用于食品和藥品領(lǐng)域具有重要意義。目前常見的提取枸杞黃酮的方法有溶劑浸提法、回流提取法、超聲提取法、微波輔助法[9-11]等。傳統(tǒng)的溶劑浸提法和回流提取法成本低，適用于工業(yè)化大生產(chǎn)，但提取效率低，提取物雜質(zhì)多[12]；微波輔助法、超聲法省時(shí)、提取率高，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)中，但選擇性差，含量低[13]。

高速剪切技術(shù)（High-speed Shear Dispersing Emulsifier，HSDE）（又稱閃提法）作為近年發(fā)展起來的一種均質(zhì)化技術(shù)，可高效、快速、低能耗地從生物質(zhì)樣品中提高有效成分，已被應(yīng)用到藥物研究相關(guān)的諸多領(lǐng)域[14-15]。低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvents，DESs）是一種新型的綠色溶劑，在提取分離天然產(chǎn)物中逐漸得到重視[16-17]。與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑提取方法相比，新型綠色的低共熔溶劑具有低污染、提取率高和可回收利用等優(yōu)點(diǎn)，近年來，已廣泛應(yīng)用于黃酮類物質(zhì)的提取[18-20]，并且明顯提高了黃酮類活性物質(zhì)的提取量。

本研究首次將高速剪切提取技術(shù)和DESs提取方法進(jìn)行組合用于枸杞黃酮的提取，分別比較了回流提取法、高速剪切輔助乙醇提取法、超聲輔助DESs提取法對枸杞總黃酮提取量的影響，并對高速剪切輔助DESs的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選出對枸杞黃酮的最佳提取條件。本研究結(jié)果對于枸杞黃酮和中藥中黃酮類化合物的提取提供了新方法，并在此基礎(chǔ)上采用SIMCA 14.1軟件分析不同產(chǎn)區(qū)生態(tài)因子和枸杞黃酮的相關(guān)性，為枸杞資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞樣品 來源于內(nèi)蒙古包頭，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)謝曉蓉教授鑒定為茄科植物寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）的干燥成熟果實(shí)，粉碎過50目篩，避光、保存?zhèn)溆?；蘆丁對照品 純度≧98%，批號1000800-171130，濟(jì)寧天之藍(lán)生物科技有限公司；氯化膽堿分析純，安耐吉化學(xué)試劑公司；乙二醇 分析純，利安隆博華（天津）醫(yī)藥化學(xué)有限公司。

XQ100克型多功能高速粉碎機(jī) 上海廣沙工貿(mào)有限公司；T25高速剪切機(jī) IKA公司；BSA224SCW型電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲清洗機(jī) 昆山超聲儀器有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；H1650型醫(yī)用離心機(jī)長沙湘儀儀器有限公司；TI-19系列雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取方法的初步篩選

1.2.1.1 乙醇回流法 參照文獻(xiàn)[21]中最佳的提取方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測定，具體操作如下：精密稱取枸杞樣品約3.0 g，以70%乙醇、料液比為1:15 g/mL回流提取2次，每次1.5 h，放至室溫，過濾，合并濾液，轉(zhuǎn)移至100.0 mL容量瓶中，以同濃度乙醇定容，搖勻。在15000 r/min離心機(jī)中離心20 min，取上清液即得總黃酮提取液I。

1.2.1.2 高速剪切輔助乙醇提取法 參照文獻(xiàn)[22]中最佳的提取方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測定，具體操作如下：精密稱取枸杞樣品約3.0 g，以70%乙醇、料液比為1:20 g/mL，室溫下在高速剪切機(jī)18000 r/min條件下處理5 min后，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至100.0 mL容量瓶中，以同濃度乙醇定容，搖勻在15000 r/min離心機(jī)中離心20 min，取上清液即得總黃酮提取液II。

1.2.1.3 超聲輔助DES提取法 參照文獻(xiàn)[23]中最佳的提取方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測定，具體操作如下：精密稱取枸杞樣品約3.0 g，以DESs（氯化膽堿:乙二醇，摩爾比1:2）、料液比為1:20 g/mL，室溫下在超聲清洗器（功率100 W）處理30 min后，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，以同濃度乙醇定容，搖勻在15000 r/min離心機(jī)中離心20 min，取上清液即得總黃酮提取液III。

1.2.1.4 高速剪切輔助DES提取法 參考本課題組之前相關(guān)研究[24]，精密稱取枸杞樣品約3.0 g，以DESs（氯化膽堿:乙二醇，摩爾比 1:2）、料液比為1:20 g/mL，室溫下在高速剪切機(jī)10000 r/min條件下處理5 min后，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至100.0 mL容量瓶中，以同濃度乙醇定容，搖勻在15000 r/min離心機(jī)中離心20 min，取上清液即得總黃酮提取液IV。

1.2.1.5 枸杞黃酮含量測定方法 參照文獻(xiàn)[25]進(jìn)行測定，具體操作如下：精密吸取上述制備的不同提取方法所得樣品溶液1.0 mL，置于10.0 mL容量瓶，各加0.5 mL 5% NaNO2水溶液，搖勻靜置6 min；再各加入 0.5 mL 10% Al（NO3）3水溶液，搖勻靜置6 min；繼續(xù)加入4.0 mL 4% NaOH水溶液，用70%乙醇定容，搖勻后靜置15 min。精密吸取水2.0 mL，同法制備以不加蘆丁對照品的空白溶液為參比溶液。分別取參比溶液、樣品溶液，于紫外可見光分光光度計(jì)上在吸收波長510 nm處測定。

根據(jù)線性回歸方程計(jì)算，求出吸取樣品溶液中的總黃酮含量。枸杞中總黃酮的含量按下式計(jì)算：

本研究通過前瞻性隊(duì)列研究，在 435例乙型肝炎病毒感染患者中進(jìn)一步探討和驗(yàn)證了 2型糖尿病與乙型肝炎病毒相關(guān)肝癌發(fā)病的關(guān)系，并提供了 2型糖尿病與乙型肝炎病毒相關(guān)肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的前瞻性研究證據(jù)。但本研究也存在一定的局限性，如沒有考慮糖尿病病程、糖尿病用藥、抗病毒治療等因素對研究結(jié)果的影響，因此尚需納入相關(guān)因素進(jìn)一步開展更大樣本量的研究?？傊?，在本隊(duì)列人群中，2型糖尿病和乙型肝炎病毒相關(guān)肝癌發(fā)病有關(guān)，2型糖尿病增加了乙型肝炎病毒感染患者的肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

式中：w為黃酮類化合物的含量，mg/g；c為樣品液所測吸光值對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度，mg/mL；V1為供試品溶液的體積，mL；V2為定容后待測樣品液體積，mL；V3為測吸光值時(shí)吸取的供試品溶液的體積，mL；m 為枸杞質(zhì)量，g。

按照文獻(xiàn)[26]，以蘆丁為對照品，采用UV法在510 nm處測定吸光度。得到蘆丁濃度（c）-吸光度（A）標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍分別為：A=11.981C+0.0037，R2=0.9995，線性范圍：0.01～0.06 mg/mL之間良好。

1.2.2 高速剪切輔助DES提取參數(shù)的單因素考察根據(jù)對四種不同方法提取枸杞黃酮的考察結(jié)果，優(yōu)選出高速剪切輔助DESs提取為最佳提取方法。在此基礎(chǔ)上，分別考察料液比（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL），高速剪切轉(zhuǎn)速（8000、10000、12000、14000、16000 r/min），提取時(shí)間為（1、3、5、7、9 min）對黃酮提取量的影響，料液比、轉(zhuǎn)速和提取時(shí)間三個(gè)因素的固定水平分別為1:25 g/mL、12000 r/min、5 min，在對各因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)探究時(shí)，其他因素均取固定水平。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以枸杞黃酮提取量為考察指標(biāo)，高速剪切的轉(zhuǎn)速為（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）為影響因素，并通過三因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal test factor level design

1.2.4 不同產(chǎn)區(qū)生態(tài)因子與枸杞黃酮含量的相關(guān)性分析 枸杞樣品于2017年9月分別采自15個(gè)具有代表性的地區(qū)（上述樣品均為寧杞7號），產(chǎn)地生態(tài)信息來自國家氣象信息中心（表2）。

表2 枸杞產(chǎn)地生態(tài)因子信息Table 2 Information on ecological factors of wolfberry production area

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述實(shí)驗(yàn)過程每組重復(fù)三次，采用Microsoft Excel 2017、Origin9.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種不同方法提取枸杞黃酮

表3可知四種提取方法中，高速剪切輔助DESs提取效果最佳，乙醇回流提取效果次之，其它2種提取方法效果較差。高速剪切輔助DESs提取法與乙醇回流提取法相比較，后者所用的溶劑體積、提取次數(shù)和提取時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于前者。僅僅從黃酮提取量評價(jià)，乙醇回流提取法比高速剪切輔助乙醇提取法和超聲輔助DESs提取法效率要高，但高速剪切輔助乙醇提取法和超聲輔助DESs提取法所用的溶劑體積、提取次數(shù)和提取時(shí)間要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于前者，尚不能簡單地做出結(jié)論。高速剪切輔助乙醇提取法和超聲輔助DESs提取法的提取率相當(dāng)，但后者所用時(shí)間要多于前者，是因?yàn)槌曁崛]有高速剪切強(qiáng)有力的破除植物細(xì)胞纖維促進(jìn)活性物質(zhì)流出的效果。高速剪切輔助DESs提取法和高速剪切輔助乙醇提取法相比，前者提取率顯著高于后者是因?yàn)镈ESs中的氫鍵受體易于黃酮類物質(zhì)的酚羥基結(jié)合，并且黃酮類化合物含有大量的酚羥基顯酸性，而DESs中氯化膽堿呈堿性，結(jié)合上述兩種原因，可明顯增加枸杞黃酮的提取量。所以高速剪切輔助DESs結(jié)合了兩者的優(yōu)勢，極大的增加了枸杞黃酮的提取量。因此，本研究選擇高速剪切輔助DESs提取枸杞黃酮。

表3 四種提取方法提取枸杞黃酮效果的比較（n=5）Table 3 Comparison of the effect of four extraction methods on extracting flavonoids from Lycium barbarum (n=5)

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 料液比對枸杞黃酮提取量的影響（n=3）Fig.1 Effect of material-liquid ratio on the extraction volume of Lycium barbarum flavonoids （n=3）

2.2.2 轉(zhuǎn)速比對枸杞黃酮提取量的影響 由圖2可知，在高速剪切轉(zhuǎn)速8000～12000 r/min時(shí)，黃酮提取量逐漸增大，當(dāng)12000 r/min達(dá)到最大值，隨著轉(zhuǎn)速的增加，黃酮提取量開始略微下降后保持幾乎不變。在適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速范圍內(nèi)，較大的轉(zhuǎn)速可以剪碎植物細(xì)胞壁使黃酮類化合物流出，從而增大提取量，若轉(zhuǎn)速大于12000 r/min后，可能導(dǎo)致除過黃酮以外多種雜質(zhì)剪切流出，影響黃酮類化合物的釋放與檢測。因此選擇10000、12000、14000 r/min進(jìn)行后續(xù)的正交試驗(yàn)。

圖2 轉(zhuǎn)速對枸杞黃酮提取量的影響（n=3）Fig.2 Effect of rotating speed on the extraction volume of Lycium barbarum flavonoids （n=3）

2.2.3 提取時(shí)間對枸杞黃酮提取量的影響 由圖3可知，在提取時(shí)間1～7 min時(shí)，黃酮提取量逐漸增加，7 min時(shí)黃酮提取量達(dá)到最大值，隨著提取時(shí)間的增加，黃酮提取量幾乎保持不變，可能是在7 min的時(shí)候?qū)⒅参锝M織中的黃酮類物質(zhì)全部溶出，達(dá)到最大值。因此選擇5、7、9 min進(jìn)行后續(xù)的正交試驗(yàn)。

圖3 提取時(shí)間對枸杞黃酮提取量的影響（n=3）Fig.3 Effect of extraction time time on the extraction volume of Lycium barbarum flavonoids （n=3）

2.3 正交試驗(yàn)

2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 以枸杞黃酮提取量為考察指標(biāo)，高速剪切的轉(zhuǎn)速為（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）為影響因素，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of orthogonal test

2.3.2 方差分析結(jié)果 由表4～表5可知，各因素影響程度依次為A（轉(zhuǎn)速）＞C（提取時(shí)間）＞B（料液比）。其中因素 A 為 K1＜K2＜K3，因素 B 為 K1＜K3＜K2，因素C為K1＜K2＜K3；因素A的影響程度最大且有顯著差異（P＜0.05），因素 B、C影響程度較小，無顯著性差異（P＞0.05），綜合上述條件，考慮到效率問題，最終確定最優(yōu)工藝為A3B1C1，即在料液比1:20 g/mL，高速剪切的轉(zhuǎn)速14000 r/min的情況下提取5 min。

表5 方差分析結(jié)果Table 5 Analysis of variance

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述優(yōu)化工藝條件，先按照正交最佳實(shí)驗(yàn)條件A3B1C1，即在料液比1:20 g/mL，高速剪切的轉(zhuǎn)速14000 r/min的情況下提取5 min，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩組，每組平行重復(fù)3次試驗(yàn)，按照“1.2.1.5”項(xiàng)中來制備和測定出枸杞黃酮提取量。平均結(jié)果見表6。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 6 Verification test results (n=3)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在上述驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行了兩組，每組平行3次，枸杞黃酮平均得率為7.11，RSD值＜5%，表明正交試驗(yàn)優(yōu)化的提取條件穩(wěn)定可行。此工藝可用來提取枸杞黃酮。

2.4 不同產(chǎn)區(qū)生態(tài)因子對枸杞黃酮含量的相關(guān)性分析

利用1.2.1.5的方法測得15個(gè)產(chǎn)地枸杞樣品黃酮提取量，見表7。

表7 不同產(chǎn)地枸杞總黃酮提取量Table 7 Extraction volume of total flavonoids of Lycium barbarum from different producing areas

通過SIMCA 14.1軟件，利用偏最小二乘回歸（PLS）法分析寧夏枸杞13個(gè)產(chǎn)區(qū)（韓國樣品a、樣品b采集地不詳，故不做樣品分析）11個(gè)生態(tài)因子與枸杞黃酮相關(guān)性。篩選影響枸杞黃酮含量的生態(tài)因子。

用PLS法分析，生態(tài)因子與不同產(chǎn)地的枸杞黃酮含量的相關(guān)性由變量投影重要性指標(biāo)（VIP）和正負(fù)回歸系數(shù)（CoeffCS）決定，其中VIP值越大，說明生態(tài)因子對枸杞黃酮含量的影響越大，圖4A中VIP值的貢獻(xiàn)值可以看出，年積溫和無霜期是枸杞黃酮形成、代謝、轉(zhuǎn)化過程最主要的影響因素。CoeffCS＞0時(shí)，生態(tài)因子與枸杞黃酮含量成正相關(guān)；CoeffCS＜0時(shí)，生態(tài)因子與枸杞黃酮含量成負(fù)相關(guān)。CoeffCS的絕對值越大，相關(guān)性越大，由圖4B可以看出枸杞黃酮含量與年積溫和無霜期正回歸系數(shù)值最大，與海拔的負(fù)回歸系數(shù)絕對值最大。

圖4 枸杞黃酮含量與生態(tài)因子的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of Lycium barbarum flavonoids content and ecological factors

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)考察利用常規(guī)方法亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法和紫外-可見分光光度法測定枸杞總黃酮，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在該條件下枸杞總黃酮的專屬性強(qiáng)，測定方法簡便、準(zhǔn)確、且重復(fù)性好，可作為枸杞中總黃酮的測定方法，并且確定了以高速剪切技術(shù)輔助DESs提取枸杞黃酮為最佳的提取方法，實(shí)驗(yàn)通過單因素初步篩選影響因素，在此基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化枸杞黃酮提取工藝，確定最佳提取工藝為料液比1:20 g/mL，轉(zhuǎn)速為14000 r/min，提取5 min，此條件經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)表明，該提取工藝穩(wěn)定、合理、可行。

本研究系統(tǒng)考察了主要生態(tài)因素對枸杞含量的影響，結(jié)果表明枸杞黃酮最主要的影響因素是年積溫，枸杞黃酮含量與年積溫和無霜期正回歸系數(shù)值最大，與海拔的負(fù)回歸系數(shù)絕對值最大，并且首次應(yīng)用PLS法分析了生態(tài)因子對枸杞黃酮得率的綜合影響，揭示了溫度、海拔等因素對枸杞活性成分重要作用。對進(jìn)一步研究枸杞發(fā)育過程中活性物質(zhì)的代謝、合成和變化規(guī)律具有一定的借鑒意義。