響應面法優(yōu)化紅景天多酚提取工藝及其體外α-葡萄糖苷酶抑制活性

任衛(wèi)合，羅龍龍，王麗萍，高彩雯，余金鳳，皮爾·穆罕默德·阿卜杜勒，丁功濤，陳士恩

（1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730124；2.西北民族大學生物研究中心，中國-馬來西亞國家聯(lián)合實驗室，甘肅蘭州 730124；3.馬來西亞國立大學工程與建筑環(huán)境學院，雪蘭莪邦吉 43600）

II型糖尿?。═2DM）是一種全球流行的代謝和內分泌失調疾病，占所有糖尿病患者95%左右[1]，長期高血糖易損傷血管和神經，誘發(fā)多種疾病。T2DM的餐后血糖升高主要是由于攝入的碳水化合物被小腸刷狀緣絨毛膜上皮細胞的α-葡萄糖苷酶分解成易于被人體吸收的葡萄糖而導致[2]。α-葡萄糖苷酶抑制劑可通過抑制α-葡萄糖苷酶活性，減弱或減緩葡萄糖在腸道中的吸收[3]，改善餐后高血糖。目前，T2DM主要治療途徑是通過阿卡波糖等α-葡萄糖苷酶抑制劑控制餐后血糖水平，然而此類藥物為人工合成，長期服用將引起脹氣、腹部不適等不良反應，還有可能產生藥物耐藥性[4]及毒副作用。因此尋找一種天然、安全、高效、溫和、不良反應少的α-葡萄糖苷酶抑制劑具有重要意義。研究表明，鳳凰單樅多酚[5]、檳榔多酚提取物[6]均存在一定體外α-葡萄糖苷酶抑制作用。

紅景天（Rhodiola rosea）為景天科景天屬多年生草本植物，是一種藥食同源性藥材，在我國主要分布于吉林、西藏、新疆及云南西北部等高海拔或極高海拔地區(qū)。紅景天富含多酚、多糖等天然活性物質[7-8]，這些物質是其發(fā)揮各種活性功能的基礎，使其具有抗缺氧、抗疲勞[9]、抗腫瘤[10]、降血脂[11]、降血糖[12]等多種藥理作用。

目前國內外對紅景天多酚的研究主要集中于提取工藝優(yōu)化、分離純化、含量測定、抗氧化等方面[13-17]，關于紅景天多酚對α-葡萄糖苷酶活性抑制方面研究較少。其提取方法有超臨界二氧化碳萃取法[15]、低共溶劑提取[13]、有機溶劑萃取等，但均存在操作繁瑣、成本較高等劣勢，與其他的提取技術相比，超聲波輔助提取法具備價格低廉、高速快捷、所需溫度低等特點，因此本研究采用超聲輔助乙醇提法提取紅景天多酚，探究乙醇濃度、料液比、超聲功率、超聲溫度以及超聲提取時間對紅景天多酚提取的影響，通過單因素及Box-Behnken響應面實驗優(yōu)化提取工藝，并構建體外α-葡萄糖苷酶抑制體系，研究紅景天多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，同時通過酶抑制動力學，判斷其抑制類型，研究旨為天然降血糖物質開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅景天 大花紅景天（Rhodiola crenulata（HK.f.et Thoms.） H.Ohba），采自西藏昌都，由西北民族大學陳士恩教授鑒定；α-葡萄糖苷酶 Sigma公司；沒食子酸標準品 Solarbio公司；無水乙醇、無水碳酸鈉、氫氧化鈉 分析純，天津市大茂化學試劑廠；福林酚 大連美倫生物有限公司；磷酸二氫鈉 上海廣諾化學科技有限公司；96孔板 康寧生命科學有限有限公司。

QE-200型高速萬能粉碎機 浙江屹立工貿有限公司；X1R型高速冷凍離心機、1510型酶標儀美國賽默飛世爾科技公司；LGJ-20F型真空冷凍干燥機 日本松源華興科技有限公司；DL-1500Y型超聲波提取儀 中科都菱公司；L8型紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅景天多酚提取 采用超聲輔助乙醇提法對紅景天多酚進行提取。紅景天根、莖置于鼓風干燥箱中80 ℃烘干至恒重，粉碎后過50目篩，密封避光保存?zhèn)溆谩Ｈ? g紅景天粉末，按料液比加入一定體積分數乙醇溶液，后在一定超聲功率、超聲溫度、超聲時間下進行提取，將所得提取固體與液體10000 r/min離心10 min，上清液即為紅景天多酚提取液，提取3次。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 乙醇濃度對多酚得率的影響 在料液比1:30 g/mL，溫度55 ℃、超聲功率270 W條件下，按1.2.1中提取流程，分別利用體積分數為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇超聲提取30 min，探究乙醇濃度對紅景天多酚得率的影響。

1.2.2.2 超聲溫度對多酚得率的影響 將濃度為70%的乙醇用作提取溶劑，在料液比1:30 g/mL、超聲功率270 W條件下，按1.2.1中提取流程，設置溫度為 35、45、55、65、75 ℃，超聲提取 30 min，探究超聲溫度對紅景天多酚得率的影響。

1.2.2.3 料液比對多酚得率的影響 將濃度為70%的乙醇用作提取溶劑，在溫度55 ℃、超聲功率270 W條件下，按1.2.1中提取流程，分別采用料液比為1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL的比例超聲提取30 min，探究料液比對紅景天多酚得率的影響。

1.2.2.4 超聲功率對多酚得率的影響 將濃度為60%的乙醇用作提取溶劑，在料液比1:30 g/mL、溫度55 ℃條件下，超聲功率分別設為150、210、270、330、390 W，超聲提取30 min，探究超聲功率對紅景天多酚得率的影響。

1.2.2.5 提取時間對多酚得率的影響 將濃度為60%的乙醇用作提取溶劑，在料液比1:40 g/mL、溫度55 ℃、超聲功率150 W條件下，按1.2.1中提取流程，分別超聲 10、20、30、40、50 min，探究提取時間對紅景天多酚得率的影響。

1.2.3 響應面試驗 依據單因素實驗結果，選取乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲功率（C）和超聲溫度（D）為影響因素，以提取得率為響應值，采用4因素3水平分析方法，利用Design-Expert 8.0.6 軟件進行Box-Behnken 實驗設計，優(yōu)化紅景天多酚提取工藝，設計見表1。

表1 Box-Behnken 試驗設計因素與水平Table 1 Box-Behnken experimental design factors and levels

1.2.4 紅景天多酚含量測定

1.2.4.1 沒食子酸標準曲線繪制 配制濃度為2、4、6、8、10、12 μg/mL 沒食子酸標準溶液，分別精密量取各標準溶液20 μL置于10 mL棕色容量瓶中，加入蒸餾水3 mL，福林酚0.5 mL，搖勻，放置在避光處3 min，加入濃度7.5 mg/mL碳酸鈉溶液1.5 mL，加蒸餾水稀釋至刻度，于760 nm處進行比色測定吸光值A，重復3次，得回歸方程：y=0.0324x+0.0114（R2=0.9997）。

1.2.4.2 多酚含量測定 采用福林-酚比色法[18]進行紅景天多酚含量測定。紅景天多酚提取液按1.2.4.1所述方法處理后測定吸光值，由標準曲線回歸方程得紅景天多酚濃度，后按下式計算多酚得率：

式中：C為紅景天多酚提取液稀釋后濃度，μg/mL；V為提取液稀釋后體積，mL；m為樣品質量，g；n為稀釋倍數。

1.2.5 紅景天多酚體外α-葡萄糖苷酶抑制活性測定 以最優(yōu)條件進行紅景天多酚提取，將提取液旋轉蒸發(fā)濃縮體積至1/3，然后冷凍干燥得多酚提取物，并配置成不同濃度樣品溶液備用。參考Usman的方法[19]，并加以修改，測定其體外α-葡萄糖苷酶抑制活性，取 10 μL 樣品溶液與 45 μL 5 U/mLα-葡萄糖苷酶磷酸鹽溶液（0.2 mol/L，pH5.0），振蕩混勻后置于54 ℃培養(yǎng)箱，使其反應 10 min。然后加入35 μL 5 mmol/L 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）溶液啟動反應，并置于54 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min，加入100 μL溶液（0.2 mol/L）終止反應，于 405 nm處測定其吸光值。以PBS溶液替代α-葡萄糖苷酶溶液測定樣品空白；以PBS替代樣品測定酶液空白。并按照下列公式計算抑制率：

式中：AC為未添加樣品反應液的吸光值；為酶液空白吸光值；AS為添加樣品反應液的吸光值；為樣品空白吸光值。

1.2.6α-葡萄糖苷酶抑制動力學測定 以酶濃度為橫坐標，酶促反應初速率V（ΔA/min）為縱坐標作圖，以判斷其是否為可逆抑制；以底物濃度的倒數（1/[s]）為橫坐標，反應初速率的倒數（1/V）為縱坐標，得Lineweaver-Burk雙倒數曲線，判斷其抑制類型。

1.3 數據處理

所有試驗平行測定3次，采用Microsoft Excel 2010、Origin 2018、SPSS 21進行數據處理、分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇濃度對多酚得率的影響 由圖1可知，隨著乙醇濃度增大，多酚得率逐漸增大，這種結果可能是由于含有一定體積水的溶劑有利于提取溶劑潤濕提取物，使溶劑極性、水溶性增大而導致的，乙醇濃度增至70%時，多酚得率達最大值。但當乙醇濃度繼續(xù)增大后多酚得率卻降低，這是由于紅景天中多酚氫鍵和疏水鍵破壞，不利于在組織內提取出所致[20]。因此選取乙醇濃度為60%、70%、80%為響應面分析的3個水平。

圖1 乙醇濃度對紅景天多酚得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of Rhodiola rosea polyphenols

2.1.2 超聲溫度對多酚得率的影響 由圖2可知，在35～55 ℃之間，隨溫度升高，紅景天多酚得率明顯增加，于55 ℃時達最大值，超聲溫度繼續(xù)升高，得率反而降低，因此，最佳提取溫度為55 ℃。造成這種現(xiàn)象的原因可能是多酚類物質對熱極不穩(wěn)定，溫度過高會致使多酚物質被破壞[14]，這與藍莓[21]、鳳凰單樅[5]、嘉寶果葉[22]等多種植物多酚的提取研究結果較為一致，均需在較為溫和溫度下進行。因此，選取超聲溫度45、55、65 ℃為響應面設計的3個水平。

圖2 超聲溫度對紅景天多酚得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the yield of Rhodiola rosea polyphenols

2.1.3 料液比對多酚得率的影響 由圖3可知，隨溶劑比例增加，紅景天多酚得率逐漸升高，當料液比為1:40時，多酚得率達最大值，繼續(xù)增加溶劑量，得率反而下降，這可能因為溶劑體積過大，其他物質從組織中斷裂和擴散出來所致。因此，料液比設置1:30、1:40、1:50 g/mL為響應面設計3個水平。

圖3 料液比對紅景天多酚得率的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on the yield of Rhodiola rosea polyphenols

2.1.4 超聲功率對多酚得率的影響 由圖4可知，隨超聲功率增加，多酚得率先升高后降低，達330 W時得率最高，當功率繼續(xù)增加，得率反而降低，這種現(xiàn)象可能是隨著超聲功率增加，產生的氣泡越來越明顯，使散射衰減增加，進而形成聲屏障所導致[23]。因此功率為330 W時，提取效果最佳。設置270、330、390 W為響應面3個水平。

圖4 超聲功率對紅景天多酚得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of Rhodiola rosea polyphenols

2.1.5 提取時間對多酚得率的影響 提取時間對多酚得率的影響結果如圖5所示，提取時間在10～30 min內，多酚得率明顯增大，超聲30 min后，多酚得率變化不大，且超聲30與40、50 min處理，多酚得率差異不明顯，因此為節(jié)約時間成本，選取最佳提取時間為30 min，并不進行響應面優(yōu)化。

圖5 提取時間對紅景天多酚得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the yield of Rhodiola rosea polyphenols

2.2 響應面試驗結果

響應面設計及結果見表2，采用Design expert 8.0軟件對表2中試驗結果進行多項擬合回歸，得到紅景天多酚得率Y對乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲功率（C）和超聲溫度（D）的二次多項回歸模型方程：Y=11.38+0.60A+0.058B-0.58C+0.27D+0.64AB+0.90AC-0.15AD-0.12BC-0.075BD-0.51CD-1.67A2-1.86B2-1.61C2-2.87D2

表2 響應面設計及結果Table 2 Response surface design and results

為檢驗回歸方程有效性并確定各因素對紅景天多酚得率影響程度，對回歸模型進行方差分析，結果見表3和圖6。所建立方程模型極顯著相關（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），表明該模型方程與實際擬合度較好。決定系數R2=0.9768，調整決定系數R2Adj=0.9537，變異系數CV值為4.85%，表明模型離散程度小。一次項中乙醇濃度與超聲功率對多酚得率存在極顯著影響（P＜0.01），超聲溫度存在顯著影響（P＜0.05）；二次項中乙醇濃度、料液比、超聲功率和超聲溫度均對多酚得率曲面效應影響極顯著（P＜0.01）；交互項中，乙醇濃度和料液比、乙醇濃度和超聲功率對多酚得率具有極顯著影響（P＜0.01），超聲功率和超聲溫度對多酚得率存在顯著影響（P＜0.05）。根據F值可得，各因素影響主次順序為乙醇濃度（A）＞超聲功率（C）＞超聲溫度（D）＞料液比（B）。

圖6 不同條件對提取得率的交互影響Fig.6 Interaction of different conditions on the extraction rate

表3 回歸方程系數顯著性檢驗和方差分析Table 3 Regression equation coefficient significance test and analysis of variance

優(yōu)化后得出最佳提取條件為：乙醇濃度71.45%、料液比1:40.44 g/mL、超聲功率321.07 W、超聲溫度55.55 ℃，考慮到實際操作限制，將提取條件調整為：乙醇濃度71%、料液比1:40 g/mL、超聲功率320 W、超聲溫度55 ℃，在此條件下進行驗證試驗，紅景天多酚得率可達11.45%。與理論預測值基本一致，表明本響應面試驗所得回歸模型具有較好準確性。

2.3 紅景天多酚提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

紅景天多酚對α-葡萄糖苷酶活性抑制效果如圖7所示，結果表明，紅景天多酚提取物對α-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用，且抑制能力隨紅景天多酚濃度增大而增大，具有明顯劑量依賴性，當提取物濃度達到20 mg/mL時，抑制率較之前變化不大，當紅景天多酚濃度為50 mg/mL時，對α-葡萄糖苷酶抑制率高達97.86%。本試驗以阿卡波糖為陽性對照[24]，其IC50為 3.36 mg /mL，紅景天多酚IC50（2.83 mg/mL）低于陽性對照，表明抑制效果優(yōu)于阿卡波糖。紅景天多酚具有明顯的α-葡萄糖苷酶抑制作用，且抑制能力強于阿卡波糖，抑制活性呈現(xiàn)量效關系。本研究結果與宋菲等[5]、黃曉辰等[6]對檳榔多酚、鳳凰單樅多酚研究結果較為一致，抑制活性均優(yōu)于阿卡波糖。

圖7 紅景天多酚及阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性Fig.7 Inhibitory activity of Rhodiola rosea polyphenols and acarbose on α-glucosidase

2.4 紅景天多酚對α-葡萄糖苷酶抑制動力學

紅景天多酚對α-葡萄糖苷酶抑制的酶濃度與反應初速率結果如圖8所示，酶濃度與反應速率直線具有良好線性關系，均經過原點，添加紅景天多酚提取物的直線斜率小于未加多酚提取物直線斜率，且隨提取物濃度逐漸增大，直線斜率逐漸減小，表明紅景天多酚的添加并未增加或減少酶的濃度，而是通過降低酶活性使其分解底物濃度降低。因此，可判斷紅景天多酚提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用類型屬可逆抑制[25]。趙艷等[3]對雪膽多酚的α-葡萄糖苷酶抑制作用類型進行研究，表明雪膽多酚提取液對α-葡萄糖苷酶抑制作用也屬于可逆性抑制類型。

圖8 紅景天多酚酶濃度與反應初速率圖Fig.8 Rhodiola rosea polyphenols enzyme concentration and initial reaction rate diagram

2.5 紅景天多酚對α-葡萄糖苷酶活性的可逆抑制作用類型

可逆性抑制類型可分為競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制和混合型抑制4種類型[26]?；旌闲鸵种朴职ǜ偁幣c非競爭的混合型、競爭與反競爭的混合型2種。本研究通過保持α-葡萄糖苷酶濃度一定，改變反應體系中多酚物質與PNPG的濃度，測定體系反應速率，繪出Lineweaver-Burk雙倒數曲線，如圖9。不同濃度抑制劑所繪成的直線與空白組相交于第二象限，且隨著抑制劑濃度的增大，米氏常數Km逐漸增大，最大反應速率Vmax逐漸降低，紅景天多酚濃度由1 mg/mL增加至5 mg/mL時，其Km由 1.339增加至 3.322 mmol/L，Vmax由 0.126減小至0.078 △A/min（如表4所示），屬于競爭與非競爭的混合型抑制特點[27]，因此紅景天多酚對α-葡萄糖苷酶抑制類型為競爭與非競爭的混合型抑制。田麗梅[26]等研究得出，枸杞多糖對α-葡萄糖苷酶抑制作用也屬非競爭性抑制作用。本實驗結果與檳榔多酚提取物[6]、羅漢果皂甙粗提物[28]對α-葡萄糖苷酶抑制類型相同，均屬于混合型抑制。

圖9 紅景天多酚對α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk 雙倒數圖Fig.9 Lineweaver-Burk double reciprocal graph of the inhibitory effect of Rhodiola rosea polyphenols on α-glucosidase

表4 紅景天多酚提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學參數Table 4 Inhibition kinetic parameters of Rhodiola rosea polyphenol extracts on α-glucosidase

3 結論

本文采用響應面法優(yōu)化紅景天多酚提取工藝，得出最佳工藝：乙醇濃度71%、料液比1:40 g/mL、超聲功率320 W、超聲溫度55 ℃，在此條件下得出多酚提取得率為11.45%。本研究采用超聲輔助乙醇提取法，此方法條件簡單，克服了常規(guī)方法提取時間長、操作步驟繁瑣等缺點。體外α-葡萄糖苷酶抑制實驗表明，紅景天多酚對α-葡萄糖苷酶具有明顯抑制作用，且抑制活性呈量效關系，抑制率最高可達97.86%，IC50為2.83 mg/mL，低于陽性對照阿卡波糖；酶動力學研究表明，紅景天多酚提取物對α-葡萄糖苷酶抑制作用為可逆混合型抑制類型，屬于競爭與非競爭性混合抑制。由此可見，紅景天在開發(fā)成為輔助降血糖的保健食品或藥品方面具有一定的發(fā)展前景。但是，目前本實驗研究僅限于體外抑制實驗，得出的實驗結論在活體動物實驗是否也能得到相同或者更好的驗證有待進一步研究。