三葉青原花青素純化工藝及抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

何志貴，徐祥林，崔瑩瑩，伍 蘭，周曉雨，黃宗昉，杜密英

（桂林旅游學院休閑與健康學院，廣西桂林 541006）

三葉青（Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg）又名三葉崖爬藤、蛇附子、金線吊葫蘆等，為葡萄科崖爬藤屬植物[1]，在廣西廣泛種植。原花青素（Proanthocyanidins，PC）是一類由多羥基黃烷-3-醇結構單元縮合而成的多酚類化合物[2-3]，具有抗氧化[4]、保護心血管系統(tǒng)[5]、預防動脈粥樣硬化[6]、預防老年癡呆[7]等藥理活性功能。

原花青素的提取純化工藝一直是影響其質量優(yōu)劣的關鍵工藝。目前，常見的原花青素提取方法有：水提法[8]、有機溶劑提取法[9]、微波提取法[10]、高壓提取法[11]、萃取法[12]等，這幾種提取方法各有優(yōu)劣，為了提高提取效率，通常會聯(lián)合使用幾種提取方法，但提取后的原花青素為粗提物，內部含有大量的多糖、蛋白質等雜質[13-15]。如若不采取適當?shù)姆椒ㄟM行分離純化，原花青素則易分解、粘稠、吸潮，影響其生物活性[16-17]。常用于原花青素純化的工藝包括膜分離法、紙層析法、高效液相色譜法、離子交換法等，這幾種方法雖然純化效率高，可純化成本也較高，不適宜實際加工生產(chǎn)。大孔吸附樹脂具有吸附純化工藝簡單、純化效率高、生產(chǎn)成本低廉等優(yōu)點，廣泛應用于黃酮類、多酚類和色素等植物化學物質的純化。趙文娟等[18]通過101型樹脂對黑枸杞原花青素進行分離純化，純化后的原花青素含量是原來的2.17倍。褚仕超等[19]通過AB-8型樹脂對蠶豆中原花青素進行純化，純化后的原花青素含量高達94.33%。滕飛等[20]通過DM130 型樹脂純化黑果腺肋花楸原花青素，所得原花青素的純度為78.4%。但大孔樹脂純化三葉青原花青素還未見報道。

為探索三葉青中原花青素的純化工藝及其活性，采用大孔吸附樹脂法純化三葉青原花青素，以不同類型樹脂吸附量和解吸附率為指標，篩選最佳樹脂類型，并對三葉青粗提物和純化后的純度、體外抗氧化活性以及葡萄糖苷酶抑制活性進行綜合測定，以期為三葉青原花青素的深入研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三葉青 采自廣西天峨縣菠結鄉(xiāng)常里村，經(jīng)西北農(nóng)林科技大學生命科學學院、中藥指紋圖譜與天然產(chǎn)物國家地方聯(lián)合工程研究中心董娟娥教授鑒定為葡萄科崖爬藤屬植物三葉青（T.hemsleyanum）的干燥塊根。樣品用去離子水洗凈，45 ℃烘干，將樣品粉碎后過 60目篩；D-101、X-5、AB-8、HPD-100、HPD-300型大孔吸附樹脂 安徽三星樹脂科技有限公司；α-葡萄糖苷酶、DPPH、ABTS、對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷PNPG、L-抗壞血酸、阿卡波糖 美國Sigma-Aldrich公司；葡萄籽原花青素 標準品，純度≥98.5%，南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司；其余試劑 均為國產(chǎn)分析純；水 去離子水。

FW-100D高速萬能粉碎機 天津鑫博得儀器有限公司；UV-1700紫外-可見分光光度計 日本株式會社島津制作所；1510全波長多功能酶標儀 賽默飛世爾科技有限公司；SB25-12DTDN型超聲波清洗機 寧波新芝；N-1300D-W旋轉蒸發(fā)儀 東京理化器械株式會社；BSA224電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原花青素粗提物制備及含量測定 采用體積分數(shù)為50%乙醇溶液結合超聲波輔助法提取原花青素：超聲功率100 W，超聲溫度為40 ℃，超聲時間為5 min，料液比為1:20，浸提溫度為40 ℃，浸提時間為20 min，提取后5000 r/min離心5 min，取上清液，旋蒸濃縮，凍干。并根據(jù)下列方法計算原花青素含量。

用香草醛－鹽酸法測定原花青素的含量，參照本課題組建立的方法[21]，配制工作液（1 g/100 mL香草醛-甲醛溶液與1 mol/L鹽酸-甲醇溶液，體積比1:1），稱取原花青素標準品，以甲醇為溶劑，在容量瓶中制備 0.0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0 μg/mL 的標準溶液，在不同濃度的標準液中分別加入10 mL工作液，充分搖勻，置于室溫下30 min顯色，用甲醇作空白對照，在500 nm波長處測定溶液吸光值，對三葉青原花青素含量進行初步定量分析。繪制吸光值（Y）與原花青素標準品質量濃度（X）的標準曲線，得標準曲線方程為：Y=1.6771X-0.0002（R2=0.9925）

1.2.2 大孔吸附樹脂型號的篩選

1.2.2.1 大孔吸附樹脂處理 參照文獻[22]對D101、X-5、HPD-100、HPD-300、AB-8型大孔吸附樹脂進行處理。所有樹脂首先在無水乙醇中處理24 h，然后用去離子水洗滌以完全去除乙醇，在5% （m/m）的氫氧化鈉中浸泡6 h，用去離子水洗滌直到濾液pH=7，在5% （v/v）的鹽酸中浸泡6 h，然后依次用去離子水洗滌直到濾液pH=7。最后，所有的樹脂在60 ℃干燥。以不同類型樹脂的飽和吸附量、解吸附量、解吸附率為主要指標，篩選出最優(yōu)的樹脂類型。

1.2.2.2 吸附量測定 參照文獻[23]精密稱取上述經(jīng)處理的大孔吸附樹脂各2 g，置于250 mL的具塞三角瓶中，分別加入質量濃度為6 mg/mL的三葉青粗提物溶液定容至100 mL密封后置于搖床中，25 ℃轉速60 r/min搖24 h，測定吸附后溶液原花青素質量濃度R0，按照式（1）計算大孔樹脂對原花青素的飽和吸附量。

1.2.2.3 解吸附量測定 稱取吸附飽和后的預處理樹脂各1 g，置于250 mL錐形瓶中，加入體積分數(shù)為70%的乙醇溶液100 mL充分搖勻，過濾并測定解吸附后的原花青素質量濃度R1，按照式（2）計算大孔樹脂對原花青素的解吸附量。

1.2.3 動態(tài)吸附實驗 濕法裝柱（15 cm×1.3 cm），平衡，然后將含有原花青素為 6 mg/mL的三葉青粗提物以1、2、3、4、5 BV/h的流速分別進行上樣吸附，流出液以1 BV為單位，持續(xù)收集24份，用酶標儀測定每份流出液中三葉青原花青素質量濃度。當含有三葉青原花青素的流出液質量濃度是上樣質量濃度的10%時視為泄露點。此時停止加樣，以此確定上樣質量濃度和流速。

1.2.4 洗脫流速及洗脫劑用量考察 依據(jù)1.2.3中確定的上樣流速和上樣質量濃度，制備5份吸附飽和的樹脂柱，去離子水充分平衡，70% 濃度乙醇作洗脫溶劑，設5個梯度流速分別進行洗脫，持續(xù)收集25份流出液（0.1 BV/份），分別檢測每一份流出液中三葉青原花青素的質量濃度，通過繪制的洗脫曲線圖來確定洗脫劑用量和洗脫流速。

1.2.5 洗脫劑濃度考察 參照1.2.4確定的洗脫劑用量和洗脫流速，按照1 BV/h的流速依次用50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液對飽和樹脂進行充分洗脫，并收集洗脫液，檢測5種不同體積分數(shù)的乙醇洗脫劑對三葉青原花青素洗脫能力的影響。

1.2.6 三葉青原花青素粗提物純化 經(jīng)預處理的AB-8型樹脂分3份進行濕法裝柱，并以去離子水平衡。首先，將三葉青提取物溶液（原花青素質量濃度為6.00 mg/mL），以流速2 BV/h上樣10 BV，完全飽和吸附后，除去雜質。然后以1 BV/h流速分別用50%、70%、90%的體積分數(shù)乙醇進行解吸附，并收集洗脫液，旋蒸濃縮凍干，得到不同純度的三葉青原花青素純化物。

1.2.7 DPPH自由基清除活性測定 將1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）配成 100 μmol/L 的工作液100 mL。3種三葉青純化物、粗提物分別配成0、20、40、60、80、100、120 μg/mL 的溶液。以 L-抗壞血酸作陽性對照，參照文獻[24]進行測定并計算DPPH自由基清除率，樣品及L-抗壞血酸清除DPPH自由基的能力以對DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度（Half maximal inhibitory concentration，IC50）表示。

式中：A0為空白樣品，Ai為各樣品。

1.2.8 ABTS+自由基的清除活性測定 以ABTS（7 mmol/L）母液與 K2S2O8（2.6 mmol/L）的溶液按1:1的體積比混合，避光條件下靜置過夜，使用前用無水乙醇稀釋成工作液，要求其在734 nm波長下的吸光度為0.70±0.2。將3種三葉青純化物、粗提物分別配成 0、20、40、60、80、100、120 μg/mL 的溶液。以L-抗壞血酸作陽性對照，參照文獻[24]測定并計算ABTS+自由基清除率，樣品及L-抗壞血酸清除ABTS+自由基的能力以對ABTS+自由基的半數(shù)抑制濃度（IC50）表示。

式中：A0為空白樣品，Ai為各樣品。

1.2.9α-葡萄糖苷酶抑制活性測定 三葉青粗提物及3種不同梯度純化物用10 %二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）進行注溶，配成 0、2、4、6、8、10、12 μg/mL的溶液。以阿卡波糖作為陽性對照，參照文獻[23]測定并計算α-葡萄糖苷酶的抑制率，抑制活性以對α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度（IC50）表示。

式中：ΔA0為空白樣品的增量，ΔAi為樣品的增量，A0為空白樣品。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均以三份重復進行，結果以三份平行測量的均數(shù)±標準差表示。使用SPSS 22.0軟件得到半數(shù)抑制率IC50值并進行單因素方差分析，Excel 2010進行統(tǒng)計分析與整理。相關性分析采用 Pearson相關，P＜0.05表示具有顯著性。

2 結果與分析

2.1 大孔吸附樹脂的篩選

考察AB-8、HPD-100、X-5、HPD-300以及D101共5種樹脂對三葉青原花青素的吸附及解吸附能力。如表1所示，五種樹脂均表現(xiàn)出較強的吸附能力，從統(tǒng)計學上分析吸附量來看，AB-8和HPD-100最好，分別可達到 132.61和137.68 mg/g；從解吸附率試驗結果來看，樹脂AB-8與樹脂D101的解吸附率顯著優(yōu)于其他類型樹脂（P＜0.05），分析認為原花青素分子中的苯環(huán)易與樹脂形成疏水作用，而比面積較小的樹脂AB-8與D101較易洗脫[25]。因此，基于吸附和解吸附的能力，綜合考慮選用AB-8型大孔吸附樹脂純化三葉青原花青素[26-27]。

表1 大孔吸附樹脂對三葉青原花青素的吸附及解吸附能力Table 1 Adsorption and desorption capacity of macroporous resins for proanthocyanidins from T.hemsleyanum

2.2 上樣量及上樣流速對AB-8型吸附樹脂純化三葉青原花青素的影響

上樣流速對樹脂吸附效果的影響如圖1所示。原花青素上樣質量濃度為6.0 mg/mL 時，在1～5 BV/h流速范圍內，上樣流速越快，AB-8型號樹脂吸附能力越受影響，泄漏點越早出現(xiàn)。通過圖1可知，在3 BV/h后流出花青素質量濃度逐漸升高，吸附效果較差，分析認為在流速加快的情況下，三葉青原花青素不能完全被AB-8型樹脂吸附，易造成溶液浪費；相反，流動速率過慢，生產(chǎn)效率就會受到嚴重影響。綜合時間成本及純化效率考慮，三葉青原花青素純化最佳上樣質量濃度為6.0 mg/mL，最佳上樣流速2 BV/h、最佳上樣體積11 BV。與雞血藤、密蒙花最佳流速是2 BV/h，上樣體積為分別為10、20 BV[23,28]相近。

圖1 上樣流速對樹脂動態(tài)吸附原花青素的影響Fig.1 Effect of loading velocity on dynamic adsorption of proanthocyanidins by resin

2.3 洗脫流速及洗脫劑用量對AB-8型吸附樹脂純化三葉青原花青素的影響

以三葉青原花青素吸附量和解吸附率為考察指標。如圖2所示，在0.5～1.5 BV/h三個梯度低流速洗脫時，峰面積大，解吸附率高；相反在2.0和2.5 BV/h高流速洗脫時，峰形降低，解吸附率較差，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。這種情況下有可能洗脫流速到達一定的數(shù)值時，洗脫溶劑與AB-8型樹脂觸及的時間過短，解吸附不充分，從而導致解吸附效率降低。當洗脫劑用量在2.0 BV之后時，流出液中原花青素含量非常低，因此，選擇洗脫劑用量以2.0 BV、洗脫流速以1.5 BV/h為最佳。

圖2 洗脫流速及洗脫劑用量對AB-8樹脂純化原花青素的影響Fig.2 Effects of elution velocity and volume on procyanidins purification by AB-8 resin

2.4 乙醇體積分數(shù)對AB-8樹脂純化三葉青原花青素的影響

據(jù)文獻報道，原花青素中的多羥基結構與吸附樹脂充分結合后形成氫鍵作用，易被含水的有機溶劑洗脫，因此，植物中原花青素提取純化通常用乙醇進行洗脫[29]。選用乙醇對AB-8樹脂中吸附的三葉青原花青素進行洗脫。如表2所示，在5個不同梯度范圍內，隨著乙醇濃度的增加，AB-8型樹脂對三葉青原花青素的解吸附量和解吸附率呈現(xiàn)先增后減的趨勢。當乙醇體積分數(shù)增大到70%時解吸附量和解吸附率達到最高，這可能與三葉青原花青素的極性有關[23]。研究表明，70%的乙醇對三葉青原花青素表現(xiàn)出較好的提取效果，因此，優(yōu)選70%乙醇作為最佳洗脫溶劑。

表2 乙醇濃度對AB-8型樹脂解吸附能力的影響Table 2 Effects of ethanol concentration on AB-8 resin desorption capability

2.5 乙醇洗脫體積分數(shù)對原花青素純度及生物活性影響

在選用不同體積分數(shù)的乙醇洗脫劑時，優(yōu)選對三葉青原花青素解吸附能力強、對雜質解吸附能力弱的洗脫劑，從而提升三葉青原花青素純度。用50%、70%、90%等不同體積分數(shù)的乙醇對吸附在AB-8樹脂上的原花青素進行洗脫。利用1.2.1節(jié)所述方法對各樣品原花青素純度進行分析，結果如表3，三葉青粗提物中的原花青素純度為44.77%±0.88%，與李彥等[23]研究相近，且V70樣品中的原花青素純度達到97.31%±0.96%，約為粗提取物的2.2倍，在所有樣品中最高（P＜0.05）。50%和90%體積分數(shù)乙醇溶解雜質的能力強于70%的乙醇，造成V50和V90純化物中含有一定量的雜質，純度分別為82.43%±0.67%和87.04%±1.03%，表明70%體積分數(shù)酒精較適宜洗脫，并提高了對DPPH自由基、ABTS+自由基及α-葡萄糖苷酶的清除能力。其中V70對DPPH自由基、ABTS+自由基清除率的IC50分別為71.59與37.97 μg/mL，顯著低于其他試驗組及陽性對照組（P＜0.05）。

表3 不同樣品原花青素純度及生物活性Table 3 Purities and biological activities of proanthocyanidin from different samples

2.5.1 DPPH自由基清除活性 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）是一種穩(wěn)定的自由基，分子結構簡單，已大量用于天然產(chǎn)物體外抗氧化活性評價[30]。本文主要研究三葉青原花青素不同質量濃度下對DPPH自由基的清除活性，以此評價AB-8型樹脂的純化工藝效果。圖3可知，在0～100 μg/mL的質量濃度區(qū)間內，隨樣品濃度增加，DPPH抗氧化活性增強，呈濃度依賴性（P＜0.05）。當濃度大于 100 μg/mL 時，DPPH自由基清除能力逐漸趨于平緩（P＞0.05）。相同濃度條件下，對DPPH自由基的清除活性依次為：V70＞V50＞V90＞L-抗壞血酸＞CE，V50 與 V90 相近，V70抗氧化活性約為L-抗壞血酸的1.37 倍，約為CE的1.27 倍，由2.5節(jié)可知V70樣品中的原花青素純度約為粗提取物的2.2 倍，表明經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂純化再經(jīng)70%乙醇洗脫后的三葉青原花青素，抗氧化活性得到進一步提升，也再次印證了70%體積分數(shù)乙醇較適宜洗脫。據(jù)文獻報道，經(jīng)AB-8樹脂純化的黑果枸杞、白刺果中的原花青素抗氧化活性明顯強于L-抗壞血酸[31-32]，經(jīng)X-5大孔樹脂純化得到的雞血藤、蒙密花原花青素抗氧化活性明顯強于L-抗壞血酸[23,28]。綜上，采用AB-8型樹脂純化的三葉青原花青素（OPC）抗氧化活性與上述文獻報道基本一致，較純化前抗氧化活性顯著增強。

圖3 不同質量濃度樣品對DPPH自由基的清除率Fig.3 DPPH radicals scavenging rate of samples with different concentrations

2.5.2 ABTS+自由基清除活性 ABTS+自由基脫色試驗是一種用于評價生物樣品抗氧化活性的常用方法，具有操作便捷且良好的重復性等優(yōu)點。由圖4可知，L-抗壞血酸、原花青素粗提物、V50、V70、V90對ABTS+自由基都有明顯的清除作用，經(jīng)純化與洗脫后，原花青素的抗氧化能力得到明顯的提高。隨著樣品質量濃度的增加，ABTS+自由基的清除率也逐漸的增加（P＜0.05），當樣品質量濃度高于100 μg/mL，ABTS+自由基清除率逐漸接近于 100%（P＜0.05）。這與DPPH自由基清除率的變化趨勢一致，說明原花青素濃度越大，抗氧化能力越強。同一濃度條件下，V70 對 ABTS+自由基的清除活性最高（P＜0.05），比L-抗壞血酸的效果略好，比原花青素粗提物、V50與V90作用效果具有顯著的差異（P＜0.05）；而V50與V90作用效果較為接近。但在相同濃度條件下，原花青素對ABTS+自由基清除率整體上比其對DPPH自由基的清除率高，兩者清除率相差明顯，說明三葉青原花青素能夠更好地清除ABTS+自由基。

圖4 不同質量濃度樣品對ABTS+自由基的清除率Fig.4 ABTS+ radicals scavenging rate of samples with different concentrations

2.5.3α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase）抑制活性 臨床上常見的α-葡萄糖苷酶抑制劑阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶具有很強的抑制作用，降低多糖分解為葡萄糖的速率，延緩碳水化合物的消化和吸收，減低餐后血糖水平，減少糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，是少數(shù)可干預糖耐量受損的口服降糖藥之一[33]。法國海岸松（Pinus pinaster）樹皮中碧蘿芷低聚原花青素、雞血藤中的原花青素可有效抑制α-葡萄糖苷酶[23,34]。因此，研究不同質量濃度下，不同純度三葉青原花青素對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。由圖5可知，隨著三葉青原花青素質量濃度不斷增加，對α-葡萄糖苷酶的抑制活性不斷增強（P＜0.05）。V70 在 12 μg/mL 時抑制率最高，達到了89.05%；從圖6中可以看出阿卡波糖（陽性對照）對α-葡萄糖苷酶的抑制活性也是隨質量濃度增加而增強，在2800 μg/mL時達到最大抑制率為83.76%，因此，三葉青原花青素及三葉青粗提物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性均高于阿卡波糖。

圖5 不同質量濃度樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.5 α-glucosidase inhibitory rate of samples with different concentrations

圖6 不同質量濃度阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.6 α-Glucosidase inhibitory rate of acarbose with different concentrations

不同質量濃度樣品對α-葡萄糖苷酶半抑制濃度（IC50）評價對α-葡萄糖苷酶抑制活性結果如表3所示：阿卡波糖的 IC50（陽性對照） 為：572.01 μg/mL、V50的 IC50為：4.64 μg/mL、V70 的 IC50為：3.84 μg/mL、V90的 IC50為：5.56 μg/mL，抑制活性的順序依次為：V70＞V50＞V90＞CE，其中，三葉青粗提物（CE）的抑制活性為對照組的41.57倍；而純化后的樣品V70與對照相比，抑制活性提高了148.96倍。通過上述結果，可以明確說明三葉青粗提物自身對α-葡萄糖苷酶的IC50抑制活性較強，而通過AB-8樹脂純化后，抑制活性提升為粗提物3倍以上。

2.6 抗氧化活性與α-葡萄糖苷酶抑制活性之間的相關性

不同純度的三葉青原花青素與DPPH自由基的清除活性、ABTS+自由基的清除活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性之間的相關性分析表明（表4）：三葉青原花青素的純度與DPPH自由基清除活性、ABTS+自由基的清除活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性均具有極顯著正相關性（P＜0.01），各活性指標間也具有極顯著正相關性（P＜0.01），表明三葉青原花青素對其抗氧化活性有明顯作用，與上述結果一致。

表4 三葉青原花青素純度與抗氧化指標的相關性Table 4 Correlation between the purity of the T.hemsleyanum Gilg proanthocyanidins and antioxidative activities

3 結論

選用了 D-101、X-5、AB-8、HPD-100、HPD-300共5種不同極性的大孔吸附樹脂純化三葉青原花青素。純化工藝的最優(yōu)條件為：選用AB-8型樹脂用于三葉青原花青素純化，上樣質量濃度為6.00 mg/mL，上樣流速2 BV/h、上樣體積11 BV，洗脫流速1.5 BV/h，洗脫劑用量2 BV，70%乙醇體積分數(shù)進行洗脫。在此條件下，三葉青中原花青素含量由44.77%上升到97.31%。

對三葉青原花青素純化前后的DPPH和ABTS+自由基清除活性以及α-葡萄糖苷酶抑制能力進行了考察。結果表明：三葉青粗提物經(jīng)70%乙醇純化后的原花青素（V70）純度最高，約為粗提取物的2.2倍。V70對DPPH自由基、ABTS自由基清除率的IC50分別為 71.59 μg/mL 與 37.97 μg/mL，顯著低于其他試驗組及陽性對照組（P＜0.05），V70 對α-葡萄糖苷酶的IC50為3.84 μg/mL，與對照相比，抑制活性提高了148.96 倍。通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，原花青素純度與自由基清除率及α-葡萄糖苷酶抑制活性呈顯著正相關，更加印證了三葉青中的原花青素具有抗氧化活性以及α-葡萄糖苷酶抑制活性。但原花青素是否為三葉青抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶的主要活性成分需進一步研究。本研究可為三葉青原花青素開發(fā)藥品、功能性食品、食品添加劑等相關領域提供理論研究基礎，促進三葉青資源的可持續(xù)開發(fā)利用。