海帶巖藻聚糖的無乙醇提取工藝研究

陳艷紅，董玉婷，啜鵬杰，陳石喬昕，姜澤東,3,4, ，朱艷冰,3,4，倪 輝,3,4，鄧尚貴，李清彪,3,4

（1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建廈門 361021；2.華僑大學(xué)實(shí)驗(yàn)室與設(shè)備管理處，福建泉州 362021；3.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361021；4.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建廈門 361021；5.浙江興業(yè)集團(tuán)，浙江舟山 316014）

海帶（Laminaria japonica）是一種大型的可食用褐藻，營養(yǎng)豐富、口感良好，素有“長壽菜”和“海上之蔬”的美譽(yù)。多糖是海帶中最主要的生物活性成分之一，主要分為三種：褐藻膠、褐藻淀粉、巖藻聚糖[1-2]。巖藻聚糖（Fucoidan），又稱褐藻多糖硫酸酯、褐藻糖膠等，是一種細(xì)胞間質(zhì)多糖[3]。國內(nèi)外學(xué)者已對(duì)巖藻聚糖進(jìn)行了深入研究，闡明了其基本結(jié)構(gòu)特征和生物活性。巖藻聚糖的多糖骨架主要由巖藻糖（Fucose）和硫酸基團(tuán)構(gòu)成，此外還含有半乳糖、甘露糖、木糖等[4]。隨著巖藻聚糖的有益生物活性及其機(jī)理不斷被闡釋，包括抗凝血、抗腫瘤、抗氧化、抑菌、抗病毒、調(diào)控腸道菌群和抗過敏等[5-10]，其在生物醫(yī)藥和食品領(lǐng)域的開發(fā)利用也受到越來越多的關(guān)注。目前，巖藻聚糖被歐盟批準(zhǔn)為新食品原料，也獲得了美國食藥局（FDA）的 GRAS認(rèn)證；在亞太地區(qū)，日本一直占據(jù)巖藻聚糖研究和產(chǎn)品開發(fā)的主要地位，廣泛運(yùn)作于功能食品、醫(yī)藥品、營養(yǎng)補(bǔ)充品以及普通食品領(lǐng)域。

巖藻聚糖的制備工藝中最常用的是熱水浸提-乙醇沉淀法，還有酸浸提和堿浸提等提取方法[5]。近年來，超臨界萃取、酶輔助提取、微波或超聲輔助提取等方法被廣泛應(yīng)用于海藻多糖的制備工藝的研究和應(yīng)用[6]。目前，這些方法中酸/堿浸提、酶輔助提取、微波或超聲輔助提取等往往會(huì)破壞天然多糖的結(jié)構(gòu)[5]。熱水浸提-乙醇沉淀法工藝相對(duì)簡單，對(duì)設(shè)備和場地的要求不高，并且可最大限度保留多糖的天然結(jié)構(gòu)，適用于規(guī)?；a(chǎn)[5]。另外，上述各種方法所制備的多糖提取液都需要經(jīng)過乙醇分級(jí)沉淀才能獲得巖藻聚糖。乙醇分級(jí)沉淀是利用褐藻酸、昆布多糖和巖藻聚糖在不同濃度乙醇中溶解性的差異對(duì)巖藻聚糖進(jìn)行提純的方法[1]；通過50%～70%的乙醇沉淀，可以從海帶提取上清液中制備獲得初級(jí)純化的巖藻聚糖[7]。因此，在目前的巖藻聚糖的制備工藝流程中均需要使用大量的乙醇。例如，陳東慧等[5]報(bào)道的熱水浸提法制備巖藻聚糖工藝，制備1 g初級(jí)多糖制品需要使用95%的乙醇約3.2 L。乙醇的大量儲(chǔ)備和使用給巖藻聚糖生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重的安全隱患和巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。基于此，本研究擬利用巖藻聚糖中巖藻糖和硫酸基團(tuán)的含量及其有益生物活性為指標(biāo)，針對(duì)傳統(tǒng)的巖藻聚糖的熱水浸提-乙醇沉淀制備工藝進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，旨在獲得高品質(zhì)和生物活性巖藻聚糖的無乙醇沉淀提取工藝，豐富海藻多糖提取加工和高值利用的理論基礎(chǔ)，為巖藻聚糖安全、高效地規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海帶L.japonica采集于福建漳州東山島海帶養(yǎng)殖海域，晾干備用；標(biāo)準(zhǔn)單糖：L-巖藻糖（L-Fuc）美國 Sigma 公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）阿拉丁試劑（上海）有限公司；蛋白胨、LB培養(yǎng)基廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；酵母粉 生工生物工程（上海）股份有限公司；褐藻膠裂解酶10000 U/g 西格瑪奧德里奇（上海）有限公司；其它試劑均為分析純產(chǎn)品。

HH-4型恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；5810R型冷凍高速離心機(jī) 德國 Eppendorf公司；FE20 型pH計(jì) 梅特勒-托利多稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司；BioTek Cytation-5細(xì)胞成像多功能檢測系統(tǒng)美國伯騰儀器有限公司；ZHWY-2102/ZWY-200D型雙層全溫度培養(yǎng)搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；1360 Infinity超高壓高效液相色譜儀（配有可變波長紫外檢測器和Inert Sustain RC18色譜柱）中國安捷倫科技有限公司；iS50 FT-IR紅外光譜儀中國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 巖藻聚糖的制備工藝 巖藻聚糖的制備采用了三種工藝，分別是熱水浸提-乙醇沉淀法、熱水浸提-酸沉法、熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法。

熱水浸提-乙醇沉淀法[8]： 將海帶清洗干凈放入烘箱干燥后粉碎過篩（60目），加入混合液（乙醇:三氯甲烷:水= 4:2:1）進(jìn)行預(yù)處理，于 4 000 r·min-1離心10 min得到沉淀將其烘干，加入熱水浸提，浸提結(jié)束后離心取上清液，在上清液中加入60%乙醇沉淀巖藻聚糖粗多糖，于4 000 r·min-1離心15min得到沉淀，用純水清洗沉淀再加入0.5 mol/L NaCl清洗去除褐藻膠，繼續(xù)離心得到沉淀，用95%～100%乙醇清洗沉淀后干燥獲得巖藻聚糖（樣品1）。

熱水浸提-酸沉淀法：參照文獻(xiàn)[8]所報(bào)道的方法，去除最終乙醇分級(jí)沉淀巖藻聚糖步驟。方法如下：將海帶清洗干凈放入烘箱干燥后粉碎過篩（60目），加入熱水浸提，浸提結(jié)束后于4 000 r·min-1離心10 min 取上清液加入鹽酸將pH調(diào)制1.4后高速離心（10000 r·min-1, 10 min），離心分離褐藻膠，取上清液調(diào)節(jié)pH至中性，將上清液放入透析袋中透析，透析結(jié)束后冷凍干燥獲得巖藻聚糖（樣品2）。

熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法：參照文獻(xiàn)[8]，將海帶清洗干凈放入烘箱干燥后粉碎過篩（60目），加入熱水浸提，浸提結(jié)束后于4 000 r·min-1離心10 min取上清液加入鹽酸將pH調(diào)制1.4后離心分離褐藻膠（10000 r·min-1，10 min），取上清液調(diào)節(jié) pH 至中性后加入褐藻膠裂解酶（5 U/mL）50 ℃處理3 h（去除褐藻膠），酶解結(jié)束后放入水浴鍋中高溫滅酶，將上清液放入透析袋中透析，透析結(jié)束后冷凍干燥獲得巖藻聚糖（樣品 3）。

巖藻聚糖得率按以下公式計(jì)算：

巖藻聚糖得率（%）=巖藻聚糖質(zhì)量/海帶粉質(zhì)量×100

1.2.2 總糖含量的測定 巖藻聚糖中總糖含量采用苯酚-硫酸法進(jìn)行測定[9]。巖藻聚糖烘干至恒重，配制10 mL濃度為1 mg/mL的多糖溶液。向1 mL樣品溶液和各標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入1 mL苯酚溶液（6%），搖勻后，加入濃硫酸5 mL后迅速混勻，冷卻至室溫，在490 nm 波長下測定吸光度值。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)x，以吸光度值為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為：y=0.0365x+0.0951（R2=0.9997），據(jù)此計(jì)算樣品中總糖含量。

1.2.3 巖藻糖含量的測定 采用柱前PMP衍生法[10]衍生單糖標(biāo)準(zhǔn)品（L-Fuc）和多糖的水解產(chǎn)物，通過高效液相色譜（HPLC）法[10]對(duì)樣品中單糖巖藻糖組分進(jìn)行定量分析。將4 mg/mL多糖溶液（或不同濃度單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液）與等體積的4 mol/L 三氟乙酸（TFA）溶液混勻后，100 ℃沸水浴4 h。冷卻至室溫后，加入1600 μL甲醇，進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，重復(fù)三次去除TFA。旋蒸后的樣品用800 μL蒸餾水溶解。向水解樣品中加入0.6 mol/L的等體積NaOH溶液混勻，加入1.6 mL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液并混勻，70 ℃水浴100 min。冷卻至室溫后，加入1.6 mL 0.3 mol/L的HCl溶液中和，混勻后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。向樣品中加入800 μL的蒸餾水和800 μL的三氯甲烷，渦旋振蕩后離心去除有機(jī)相；上述步驟重復(fù)三次以充分去除溶液中未反應(yīng)的PMP。獲得的水相經(jīng)過0.22 μm微孔膜過濾后，進(jìn)行HPLC分析。

HPLC分析條件如下：液相柱，Inert Sustain RC18色譜柱（4.6 mm I.D.×75 mm）；柱溫，30 ℃；流速，1.0 mL/min；進(jìn)樣體積，50 μL；紫外檢測器波長，250 nm；洗脫液，0.2 mol/L PBS-乙腈溶液（乙腈為17%，pH=8.9）。

以單糖標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)x，峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y=4280.1x-60.238（R2=0.9993），據(jù)此測定樣品中各單糖組分的含量。

1.2.4 硫酸基團(tuán)含量的測定 巖藻聚糖中硫酸基團(tuán)的含量采用氯化鋇-明膠比濁法測定[11]。準(zhǔn)確稱取明膠0.5 g溶解于50 mL蒸餾水中，4 ℃過夜后加入0.5 g氯化鋇，靜置2 h獲得明膠-氯化鋇溶液，過0.45 μm濾膜備用。多糖在1 mol/L HCl溶液中105 ℃水解4 h，隨后加入1 mL明膠-氯化鋇溶液，充分搖勻后，在波長500 nm處測定吸光值。使用K2SO4作為標(biāo)準(zhǔn)品，以濃度為橫坐標(biāo)x，吸光值為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y=0.0011x+0.1218（R2=0.9991），據(jù)此測定樣品中硫酸基團(tuán)（）質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.5 蛋白質(zhì)含量的測定 巖藻聚糖中蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定[12]。將1 mL濃度為0.1 mg/mL的巖藻聚糖溶液與考馬斯亮藍(lán)溶液以1:4的比例混勻，室溫放置10 min，在波長為595 nm處測定吸光值。使用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品，以BSA濃度為橫坐標(biāo)x，吸光度值為縱坐標(biāo)y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程為 y=0.0004x+0.1097（R2=0.9991），據(jù)此計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.2.6 糖醛酸含量的測定 巖藻聚糖中糖醛酸含量采用硫酸-咔唑法測定[13]。在冰浴條件下，向1 mL濃度為1 mg/mL的巖藻聚糖溶液中加入5 mL的四硼酸鈉-硫酸溶液，待溫度降至室溫后，再加入0.15%的咔唑-乙醇溶液，搖勻。沸水浴20 min后，冷卻至室溫，在波長為523 nm處測定吸光值。使用D-葡萄糖醛酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，以D-葡萄糖醛酸濃度為橫坐標(biāo)x，吸光度值為縱坐標(biāo)y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為 y=0.3333x+4E-16（R2=1.000），據(jù)此計(jì)算樣品中糖醛酸含量。

1.2.7 傅立葉紅外光譜分析 將巖藻聚糖樣品烘干至恒重，分別稱取1.5 mg與KBr混合，研磨均勻后壓成半透明薄片，置于iS50 FT-IR紅外光譜儀中，在4000～400 cm-1波長處進(jìn)行檢測，記錄紅外光譜圖。

1.2.8.1 抗氧化活性分析 巖藻聚糖的抗氧化活性采用還原力、OH 自由基（OH·）、ABTS+自由基（ABTS+·）以及DPPH自由基的清除能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。

采用鐵氰化鉀還原法[14]測定巖藻聚糖的還原力。取0.30 mL不同濃度的巖藻聚糖溶液，分別加入0.35 mL的磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.6）和0.35 mL的 K3Fe（CN）6溶液（1%，w/v），混勻后，50 ℃ 水浴20 min。冷卻至室溫后，加入0.35 mL的三氯乙酸溶液（10%，w/v）和 0.15 mL 的 FeCl3溶液（0.1%，w/v），混勻。在波長為700 nm處測定吸光值A(chǔ)1。對(duì)照組為蒸餾水代替樣品測得的吸光值為A0。按照公式（1）計(jì)算巖藻聚糖的還原力，如下：

參照WANG等[15]所述的方法測定OH·清除能力。分別在離心管中按順序加入0.1 mL不同濃度的巖藻聚糖溶液、0.1 mL的水楊酸乙醇溶液（9 mmol/L）、0.1 mL的 FeSO4溶液（9 mmol/L）、0.1mL的 H2O2（8.8 mol/L）和0.6 mL去離子水，混勻，于37 ℃水浴反應(yīng)10 min。在波長為510 nm處測定吸光值A(chǔ)1。對(duì)照組為蒸餾水代替樣品測得的吸光值為A0。按照公式（2）計(jì)算巖藻聚糖對(duì)OH·清除率，并計(jì)算出巖藻聚糖的半數(shù)清除率（IC50）。計(jì)算公式如下：

參照YANG等[16]所述方法測定 ABTS+·清除能力。分別取0.1 mL的不同濃度巖藻聚糖溶液與1 mL的ABTS工作液混合后，在734 nm處測定吸光值A(chǔ)1。對(duì)照組為蒸餾水代替樣品測得的吸光值為A0。按照公式（3）計(jì)算巖藻聚糖對(duì)ABTS+·清除率，并計(jì)算出巖藻聚糖的半數(shù)清除率（IC50）。計(jì)算公式如下：

參照LV等[17]所述方法測定DPPH自由基清除能力。分別取0.8 mL不同濃度的巖藻聚糖溶液和0.8 mL的DPPH乙醇溶液（0.1 mmol/L），混勻，室溫下避光保存0.5 h，在波長517nm處測定吸光值A(chǔ)1，對(duì)照組為蒸餾水代替多糖樣品測得的吸光值為A0，計(jì)算多糖樣品的DPPH自由基清除率，計(jì)算公式（4）如下：

1.2.8.2 抑菌活性分析 巖藻聚糖對(duì)大腸桿菌的抑菌活性采用比濁法[18]測定。不同濃度的巖藻聚糖溶液經(jīng)0.22 μm濾頭過濾除菌，備用。取4 mL不同濃度的巖藻聚糖溶液與4 mL的LB培養(yǎng)基混合，巖藻聚糖的終濃度分別為 0、2、4、6、8、10 mg/mL。取20 μL細(xì)菌懸液，接種到含多糖的LB培養(yǎng)基中，混勻，在37 ℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)速為180 r/min。最終在波長600 nm處測定細(xì)菌懸液的吸光值A(chǔ)1。以無菌水替代多糖樣品為陰性對(duì)照組測得吸光值A(chǔ)0，陽性對(duì)照組為以卡那霉素替代多糖樣品。按照公式（5）計(jì)算巖藻聚糖對(duì)大腸桿菌的抑制活性，如下：

1.2.9 基于響應(yīng)面法優(yōu)化熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助提取巖藻聚糖工藝 熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法提取得到的巖藻聚糖的品質(zhì)（巖藻糖和硫酸基團(tuán)含量高）和生物活性較好。因此，基于單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Benhnken 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[19]，以提取過程中的關(guān)鍵因素為響應(yīng)值設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，利用Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法提取巖藻聚糖的工藝過程進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.9.1 單因素實(shí)驗(yàn) 以提取溫度、提取時(shí)間、液料比為因素，以巖藻聚糖得率為考察指標(biāo)，考察3個(gè)因素對(duì)巖藻聚糖得率的影響。

由于共享經(jīng)濟(jì)屬于新事物，正處于快速發(fā)展階段，相關(guān)政府尚未出臺(tái)相應(yīng)的法律法規(guī)，對(duì)其發(fā)展的監(jiān)管仍存在許多灰色地帶?，F(xiàn)階段，仍有投機(jī)分子利用這些漏洞，破壞市場秩序而相關(guān)部門也因無法可依，不能及時(shí)處理一些違法現(xiàn)象，導(dǎo)致共享經(jīng)濟(jì)發(fā)展存在小范圍惡性循環(huán)。

提取溫度對(duì)巖藻聚糖提取率的影響：固定液料比（40:1 mL/g）和浸提時(shí)間（2.0 h），考察浸提溫度在70、80、90及100 ℃條件下對(duì)巖藻聚糖提取率的影響。

提取時(shí)間對(duì)巖藻聚糖提取率的影響：固定液料比（40:1 mL/g）和浸提溫度（90℃），考察浸提時(shí)間在1.0、2.0、3.0及4 h條件下對(duì)巖藻聚糖提取率的影響。

液料比對(duì)巖藻聚糖提取率的影響：固定浸提溫度（90 ℃）和浸提時(shí)間（2.0 h），考察液料比（mg/L）在30:1、35:1、40:1及45:1條件下對(duì)巖藻聚糖得率的影響。

1.2.9.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design Expert 8.0.6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，其因素與水平設(shè)計(jì)見表1。實(shí)驗(yàn)因素及水平如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test

1.3 數(shù)據(jù)處理

為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和數(shù)據(jù)的可靠性，上述每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)并重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Office 2016、SPSS 19.0和 Design-Expert 8.0.6進(jìn)行處理分析，P＜0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同制備工藝對(duì)巖藻聚糖得率的影響

基于文獻(xiàn)所報(bào)道的熱水浸提-乙醇沉淀法最佳工藝條件制備獲得的巖藻聚糖樣品1的得率為5.87%±0.23%；熱水浸提-酸沉法制備獲得的巖藻聚糖樣品2得率為9.65%±0.11%；在熱水浸提-酸沉法得到樣品2的基礎(chǔ)上，采用褐藻膠裂解酶處理，對(duì)樣品進(jìn)一步進(jìn)行純化（熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法），所得巖藻聚糖得率為6.67%±0.46%。在這三種制備方法中，熱水浸提-乙醇沉淀法利用乙醇分級(jí)沉淀，分別得到巖藻聚糖和褐藻膠，而熱水浸提-酸沉法和熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法均是利用褐藻膠不溶于稀酸溶液的特性，沉淀得到褐藻膠；熱水浸提-乙醇沉淀法制備巖藻聚糖的副產(chǎn)物褐藻膠得率為6.88%±0.15%，熱水浸提-酸沉淀法和熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法褐藻膠得率為10.14%±0.07%。結(jié)果表明，熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法制備巖藻聚糖得率高于傳統(tǒng)的熱水浸提-乙醇沉淀法，通過酸沉法得到褐藻膠得率明顯高于醇沉法得到褐藻膠得率。

2.2 不同制備工藝對(duì)巖藻聚糖化學(xué)組成的影響

針對(duì)不同工藝制備的巖藻聚糖的化學(xué)組成包括總糖、單糖巖藻糖、硫酸基團(tuán)、蛋白質(zhì)和糖醛酸含量進(jìn)行分析，測定結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，3種樣品中，樣品3通過熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法制備的巖藻聚糖樣品總糖含量（圖1A）最高，為68.22%±1.31%，顯著（P＜0.05）高于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SC/T 3404-2012）要求的50%；如圖1B所示，樣品3單糖巖藻糖含量（41.10%±0.87%）也高于樣品 1（32.10%±0.31%）和樣品2（36.70%±0.28%），并且顯著高于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SC/T 3404-2012）要求的15%；同樣地，熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法制備的巖藻聚糖樣品的硫酸基團(tuán)含量（24.90%±0.15%）相比通過工藝一和工藝二制備的巖藻聚糖樣品的硫酸基團(tuán)含量（21.10%±0.14%和22.10%±0.09%）顯著（P＜0.05）提高（圖1C），符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SC/T 3404-2012）要求的15%；另一方面，樣品3的蛋白質(zhì)含量和糖醛酸含量均低于樣品1和樣品2，分別降低至6.50%±0.04%和3.80%±0.01%，表示熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法更有利于蛋白質(zhì)和糖醛酸的脫除。結(jié)果表明，不同制備工藝的巖藻聚糖樣品化學(xué)組成含量差異顯著（P＜0.05），熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法制備的巖藻聚糖樣品品質(zhì)（巖藻糖和硫酸基團(tuán)含量高）相對(duì)優(yōu)于熱水浸提-乙醇沉淀法和熱水浸提-酸沉法。

圖1 不同工藝制備巖藻聚糖的化學(xué)組成Fig.1 Chemical composition of fucoidan prepared by different processes

2.3 不同制備工藝對(duì)巖藻聚糖結(jié)構(gòu)特征的影響

巖藻聚糖樣品1、樣品2、樣品3的紅外光譜圖如圖2所示。由圖2可知，不同工藝制備的3個(gè)樣品均在3500～3300 cm-1處出現(xiàn)紅外特征吸收峰，這是糖類物質(zhì)共有的O-H的伸縮振動(dòng)信號(hào)；2900 cm-1處的吸收峰為C-H伸縮振動(dòng)的信號(hào)；在1650和1400 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰是C=O的伸縮振動(dòng)引起的[7,20]。在1260 cm-1處的吸收峰為S=O的吸收峰，同時(shí)，3個(gè)多糖樣品在1260 cm-1處均有較強(qiáng)的吸收峰，表明其均含有硫酸基團(tuán)[21]。位于1150 cm-1和1080 cm-1處吸收峰分別為C-O-C和C-OH的特征峰[22-23]。以上結(jié)果表明，不同工藝制備的3種多糖樣品的具有相似的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)特征。

圖2 三種巖藻聚糖樣品的紅外光譜圖譜Fig.2 FT-IR spectroscopy infrared spectra of three fucoidan samples

2.4 不同制備工藝對(duì)巖藻聚糖抗氧化活性和抑菌活性的影響

不同制備工藝對(duì)巖藻聚糖抗氧化活性的影響如圖3所示。結(jié)果表明，在多糖濃度為0～10 mg/mL范圍內(nèi)，3種巖藻聚糖的還原力隨著多糖質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，相同濃度條件下多糖對(duì)Fe3+的還原力大小依次為樣品3＞樣品2＞樣品1（圖3A）；在0～10 mg/mL的測試濃度范圍內(nèi)，巖藻聚糖對(duì)OH自由基、ABTS+自由基和DPPH自由基的清除能力均隨著多糖的質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)；樣品1、樣品2、樣品3對(duì)OH自由基的半數(shù)清除濃度（IC50）分別為8.99、6.45、4.72 mg/mL（圖3B），對(duì)ABTS+自由基的半數(shù)清除濃度（IC50）分別為 7.90、5.24、3.61 mg/mL，對(duì) DPPH自由基的半數(shù)清除濃度（IC50）分別為5.22、2.61、1.25 mg/mL（圖3C～7D）。研究表明，巖藻聚糖的抗氧化活性受多糖的提取方法和分子量、糖苷鍵類型、硫酸基團(tuán)含量及位置等結(jié)構(gòu)因素的影響[24]。WANG等[25]研究了海帶中低分子量巖藻聚糖的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)硫酸基團(tuán)含量與抗氧化能力之間呈正相關(guān)性，本研究結(jié)果與上述報(bào)道一致。另外，謝瑾等[26]發(fā)現(xiàn)用胰酶和木瓜蛋白酶酶解巖藻聚糖可顯著酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，是由于酶自身催化活性及酶解位點(diǎn)不同，使得水解后的多糖分子量大小和分子結(jié)構(gòu)存在差異，因此表現(xiàn)出不同的抗氧化能力。樣品3表現(xiàn)出較強(qiáng)抗氧化活性的確切原因還需要進(jìn)一步研究。

圖3 巖藻聚糖抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activity of fucoidan

巖藻聚糖對(duì)大腸桿菌的抑制效果如圖4所示。在所測試濃度（0～10 mg/mL）范圍內(nèi)，巖藻聚糖樣品1、樣品2、樣品3對(duì)大腸桿菌的抑制能力隨著多糖的質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，其抑菌活性與多糖的濃度呈正相關(guān)。相同質(zhì)量濃度條件下三種不同制備工藝制備的巖藻聚糖的抑菌活性強(qiáng)弱依次為樣品3＞樣品2＞樣品1，表明相比傳統(tǒng)的熱水浸提-乙醇沉淀法，熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法制備的巖藻聚糖的抑菌活性最佳。研究表明，巖藻聚糖的抑菌活性不僅取決于多糖的分子量以及硫酸基團(tuán)含量，還主要受到多糖中單糖的構(gòu)成和比例及其分子構(gòu)象等多重因素的影響[25]。本研究中，通過工藝三制備的巖藻聚糖其巖藻糖和硫酸基團(tuán)的含量顯著高于通過工藝二和工藝一制備的巖藻聚糖，并且樣品1、樣品2和樣品3的抑菌活性隨著所含的巖藻糖和硫酸基團(tuán)的含量增多而增強(qiáng)，推測通過工藝三制備的巖藻聚糖具有較好的抑菌活性歸因于其含有較高含量的巖藻糖和硫酸基團(tuán)。

圖4 巖藻聚糖對(duì)大腸桿菌的抑制作用Fig.4 Inhibition of fucoidans on Escherichia coli

2.5 熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法提取巖藻聚糖工藝優(yōu)化

2.5.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 固定液料比（40:1 mL/g）和浸提時(shí)間（2.0 h），考察浸提溫度對(duì)巖藻聚糖提取得率的影響。隨著浸提溫度的上升，巖藻聚糖得率逐漸升高；當(dāng)溫度為90 ℃時(shí)，其得率達(dá)到最大；溫度繼續(xù)升高，其得率呈現(xiàn)急劇下降的趨勢（圖5A）。這是因?yàn)橐欢ǚ秶鷥?nèi)提高浸提溫度會(huì)加速海藻組織軟化膨脹，促進(jìn)組織內(nèi)分子運(yùn)動(dòng)，加速多糖的擴(kuò)散，提高浸提效果[27]；當(dāng)浸提溫度過高，則導(dǎo)致多糖的結(jié)構(gòu)破壞和降解損失，從而致使巖藻聚糖得率降低[28]。因此，選取90 ℃為最適浸提溫度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

固定液料比（40:1 mL/g）和浸提溫度（90 ℃），考察浸提時(shí)間對(duì)巖藻聚糖提取得率的影響。在上述最適提取溫度條件下，浸提時(shí)間為1.0～2.0 h 時(shí)，隨時(shí)間延長巖藻聚糖提取得率呈上升趨勢，2.0 h 時(shí)達(dá)到最大提取得率；浸提時(shí)間超過2.0 h 后，多糖得率隨時(shí)間增長逐漸下降（圖5B）。這是因?yàn)?0 ℃條件下，浸提時(shí)間過長也會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)，使多糖被降解，從而導(dǎo)致巖藻聚糖得率降低[29]。另外，浸提時(shí)間的延長還會(huì)使生產(chǎn)能耗增大。因此，選取2.0 h為浸提酶解時(shí)間進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

將浸提溫度和時(shí)間分別設(shè)置為上述最適條件（90 ℃和2.0 h），考察液料比對(duì)巖藻聚糖提取得率的影響。結(jié)果如圖5C所示，液料比在30:1 ～ 40:1 mL/g時(shí)，巖藻聚糖的提取得率隨液料比增大逐漸升高。研究表明增加多糖提取溶劑中水的比例可有效降低多糖溶液的黏度，從而提高提取體系中多糖溶質(zhì)的濃度差，在一定程度上提高傳質(zhì)推動(dòng)力，可有效促進(jìn)多糖分子的傳質(zhì)擴(kuò)散[30]。因此，在本實(shí)驗(yàn)中隨著浸提體系的液料比逐漸增大，巖藻聚糖得率逐漸升高。當(dāng)液料比高于40:1 mL/g 時(shí)，巖藻聚糖得率無顯著提高，因?yàn)楹Ｔ逯写蟛糠侄嗵且驯唤岢鰜?，因此增大提取溶劑中水的比例也不?huì)導(dǎo)致多糖得率顯著提升[30]。另一方面，液料比過高會(huì)增加多糖生產(chǎn)制備過程中的水耗和加熱能耗，增大產(chǎn)品的生產(chǎn)成本。因此，選取40:1 mL/g為最優(yōu)液料比進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖5 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Single factor experimental results

2.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 采用Design-Exper 8.0.6 軟件對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行回歸分析，得到響應(yīng)值與實(shí)驗(yàn)因素三元二次回歸方程：

Y=-225.24050+4.03141X1+2.07975X2+2.46483X3-0.0065X1X2-0.006665X1X3-0.019500X2X3-0.020776X12-0.16838X22-0.021805X32

用Design-Expert 8.0.6 軟件分析模型的可信度，模型的決定系數(shù)R2=0.9961,R2Adj=0.9912,R2接近于1，表明模型對(duì)響應(yīng)值的預(yù)測準(zhǔn)確，可將模型應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)的分析與預(yù)測。

2.5.3 二次模型的方差分析結(jié)果 根據(jù)表1因素水平的選取和表2 的結(jié)果，用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行方差分析，該模型和模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示。實(shí)驗(yàn)獲得的模型為高度顯著水平（P＜0.0001），失擬項(xiàng)P=0.057，表明模型的純誤差不顯著。一次項(xiàng)中浸提溫度（X1）、浸提時(shí)間（X2）和料液比（X3）對(duì)巖藻聚糖得率影響均顯著（P＜0.05）；其中X1和X3對(duì)巖藻聚糖的提取得率影響達(dá)極顯著水平（P＜0.01），X3對(duì)其得率影響最大。二次項(xiàng)中 X1和X3對(duì)巖藻聚糖得率影響極顯著（P＜0.01）；交互項(xiàng)中X1X3對(duì)巖藻聚糖得率影響極顯著（P＜0.01），而X1和 X2、X2和 X3之間交互影響不顯著（P＞0.05）。綜上，研究表明三因素中對(duì)巖藻聚糖得率影響水平大小依次為液料比＞溫度＞時(shí)間，其中液料比為極顯著水平，溫度（℃）和液料比的交互作用也達(dá)到了極顯著水平。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken test

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) for regression model

2.5.4 響應(yīng)面因素間的交互作用分析 進(jìn)一步評(píng)價(jià)提取過程中關(guān)鍵影響因素的交互作用對(duì)巖藻聚糖提取得率的影響，分別繪制了各因素交互作用影響的響應(yīng)曲面和等高線，如圖6所示。圖6A是浸提時(shí)間與浸提溫度的交互作用對(duì)巖藻聚糖得率的影響，響應(yīng)面發(fā)生了彎曲，表明浸提時(shí)間與浸提溫度對(duì)巖藻聚糖得率的影響不是簡單的線性關(guān)系，浸提溫度對(duì)巖藻聚糖得率的影響大于浸提時(shí)間的影響，兩個(gè)因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響不顯著。同樣，圖6B中響應(yīng)面也發(fā)生了彎曲，表明料液比和浸提時(shí)間與巖藻聚糖得率也不是簡單的線性關(guān)系，進(jìn)一步優(yōu)化得到液料比對(duì)巖藻聚糖得率的影響大于浸提時(shí)間的影響，同時(shí)兩個(gè)因素的交互作用不顯著。從圖6C可以看出液料比與浸提溫度之間的交互作用顯著，以上結(jié)果與表3 回歸方程方差分析結(jié)果一致。

圖6 各因素交互作用對(duì)提取率影響的等高線和響應(yīng)面圖Fig.6 Contour and response surface maps of the interaction of various factors on the extraction rate

2.5.5 響應(yīng)面模型的驗(yàn)證 應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化，基于Design-Expert 8.0.6 軟件分析得到熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法提取巖藻聚糖的最佳工藝條件為：浸提溫度為94.78 ℃、浸提時(shí)間為1.96 h、液料比為41.13 mL/g，在此參數(shù)下巖藻聚糖得率最高為9.34%。根據(jù)實(shí)際操作條件，將優(yōu)化后的浸提溫度調(diào)整為90 ℃，浸提時(shí)間為2.0 h，液料比為40 mL/g，進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，獲得巖藻聚糖提取率為9.65%±0.11%，與預(yù)測值的相對(duì)誤差為2.32%，相對(duì)誤差值較小，表明回歸模型與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合，回歸方程能準(zhǔn)確地反映浸提溫度、時(shí)間以及液料比對(duì)巖藻聚糖提取得率的影響，模型具有可行性。

3 結(jié)論

通過對(duì)三種方法提取得到的巖藻聚糖進(jìn)行的一系列研究表明，熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法所制得的樣品3具有最佳的品質(zhì)以及最好的生理活性。樣品3的得率為6.67%±0.46%，總糖含量為68.22%±1.31%，巖藻糖含量為41.10%±0.87%，硫酸基團(tuán)含量為24.90%±0.15%，蛋白質(zhì)含量為6.50%±0.04%，糖醛酸含量為3.80%±0.01%，得到副產(chǎn)物褐藻膠得率為10.14%±0.07%?？寡趸?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三種樣品的抗氧化活性強(qiáng)弱依次為樣品3＞樣品2＞樣品1。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三種樣品抑制大腸桿菌的活性強(qiáng)弱依次為樣品3＞樣品2＞樣品1，進(jìn)一步說明熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法提取巖藻聚糖可以作為一種有效替代熱水浸提-乙醇沉淀法提取巖藻聚糖的良好工藝。本研究進(jìn)一步利用響應(yīng)面法對(duì)熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法提取巖藻聚糖工藝中關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，獲得了巖藻聚糖最佳工藝參數(shù)，浸提溫度為90 ℃，浸提時(shí)間為2.0 h，液料比為40:1 mL/g，巖藻聚糖得率達(dá)到9.65%±0.11%。本研究中熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法的巖藻聚糖提取得率及其所制備的巖藻聚糖的生物活性顯著高于熱水浸提-乙醇沉淀法、熱水浸提-酸沉淀法制備的巖藻聚糖，熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法有望在今后成為一種有效替代熱水浸提-乙醇沉淀法提取巖藻聚糖的良好工藝，該工藝提高巖藻多糖提取率和品質(zhì)的同時(shí)消除了乙醇帶來的安全隱患。