響應(yīng)面法優(yōu)化辣木葉蛋白提取工藝及凝集活性研究

楊 豪，劉曉雪，蘇海冉，李凌飛，宋 爽

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，國家辣木加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，云南昆明 650201）

辣木（Moringa oleifera）也被稱為油辣木或鼓槌樹，具有明顯辛辣味[1]。我國已引進印度傳統(tǒng)辣木、印度改良辣木和非洲辣木。辣木成熟快，產(chǎn)量高，適應(yīng)性強，廣泛種植在亞洲和非洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國的海南、四川、廣東、廣西和云南等多地都有種植。辣木營養(yǎng)豐富，其葉片資源最豐富，采集最方便，發(fā)育最早，研究最多[2]。

辣木葉在一些國家被廣泛用作基本食物，并于2012年被我國衛(wèi)生部批準認定為新資源食品，辣木也被列為我國藥食兩用的植物，是具有發(fā)展前景的新資源[3]。辣木葉含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)如蛋白質(zhì)、纖維素、維生素、礦物質(zhì)等，其含有的抗營養(yǎng)成分較少，能有效地抵抗營養(yǎng)不良[4]。研究表明，辣木蛋白質(zhì)含量（鮮葉約6%，干葉約27%）是牛奶的4倍，氨基酸總量達到20.49%，并含有11種人體無法自行合成或合成速率不能滿足自身需要的必需氨基酸[5]，2009年Di等[6]完善了辣木葉常規(guī)營養(yǎng)成分測定，含量最高的三種氨基酸分別為谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸。蛋白提取最常見的方法有堿溶酸沉法、超濾法、加熱法、鹽析法等，其最傳統(tǒng)的方法為堿溶酸沉法[7]，但對于辣木葉，經(jīng)預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)堿溶酸沉法的蛋白提取需要消耗大量的酸和堿，因為辣木葉水溶液的pH較低（pH5.3～5.5），調(diào)pH的過程需要消耗大量的酸和鹽，且成本較高。超濾法一般是在常溫狀態(tài)下，通過調(diào)節(jié)泵的壓力和流量對溶液中的物質(zhì)進行選擇性分離，其具有操作簡便、能量消耗小等優(yōu)點[8]。加熱法主要為直接加熱法，即直接對浸提溶液進行加熱，蛋白受熱沉淀后通過離心可得粗蛋白，但是溫度過高會破壞蛋白結(jié)構(gòu)使其變性，蛋白活性降低的同時其得率也會有所降低。鹽析法是利用蛋白在一定濃度的鹽溶液中沉淀析出的特性來分離純化植物葉蛋白。該方法具有操作簡單、成本低且葉蛋白活性高等優(yōu)點。

凝集素（lectin）是一種從植物或者動物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白，其可逆結(jié)合專一性單糖或寡糖，能凝集紅血球[9]。研究發(fā)現(xiàn)辣木蛋白具有較強的凈化水、抗炎、抗菌、抗癌等生物活性。PRITCHARD等[10]研究發(fā)現(xiàn)辣木蛋白可以去除水中84%的濁度和88%的大腸桿菌?？档ささ萚11]研究發(fā)現(xiàn)辣木葉蛋白可以抑制金黃色葡萄球菌的活性。COELHO等[12]研究發(fā)現(xiàn)辣木凝集素對芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、銅綠假單胞菌均有殺菌作用。LUCIANA等[13]研究發(fā)現(xiàn)辣木凝集素能使B16-F10黑色素瘤細胞的活力降低并導(dǎo)致其死亡。本文以新鮮辣木葉為原料，以蛋白得率為指標，鹽析法提取蛋白，響應(yīng)面優(yōu)化辣木葉蛋白提取工藝，并研究辣木葉蛋白的凝集效價及其專一性抑制糖，旨在探索一種增加蛋白得率的方法，為云南辣木產(chǎn)業(yè)發(fā)展及辣木蛋白開發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮辣木葉 德宏天佑科技開發(fā)有限公司；牛血清蛋白 Sigma公司；硫酸銨 天津化學(xué)試劑有限公司；PBS緩沖液凍干分、ɑ-甲基-D-吡喃葡萄糖苷、麥芽糖-水合物、D-甘露糖、D（+）無水葡萄糖、D-棉子糖五水物、甲基-ɑ-D-吡喃葡萄糖苷、乳糖、甲基-β-D-吡喃半乳糖苷 北京索萊寶科技有限公司。

AR224CN型電子天平 奧豪斯儀器（常州） 有限公司；TDL-5-A型離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；FD-1A-50型真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；酶標儀 賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 辣木葉蛋白提取的工藝 稱10 g新鮮辣木葉加入PBS（磷酸緩沖鹽溶液），用榨汁機將辣木葉打碎，將辣木葉汁放進4 ℃冰箱中靜置，取出后用紗布過濾棄濾渣，將辣木葉汁在離心機中3500 r/min，離心20 min，去除殘渣留上清液，硫酸銨試劑加到上清液中攪拌均勻并靜置，在離心機中3500 r/min，離心20 min，去除上清液留沉淀，用PBS溶解沉淀，溶液裝入透析袋中，將透析袋放到裝有超純水的桶中，在磁力攪拌器作用下加快除鹽的速度，直至硫酸銨被去除干凈，在冷凍干燥機中進行冷凍干燥（-50 ℃）[14-15]。

1.2.2 單因素實驗 按照工藝流程，考察提取時間、硫酸銨飽和度、料液比三個因素對辣木葉蛋白得率的影響，確定最佳工藝的因素水平。

1.2.2.1 提取時間對辣木葉蛋白得率的影響 在硫酸銨飽和度為70%，料液比為1:8 g/mL的提取條件下，考察不同提取時間（2、4、6、8、10 h）對辣木葉蛋白得率的影響。

1.2.2.2 硫酸銨飽和度對辣木葉蛋白得率的影響在提取時間為8 h，料液比為1:8 g/mL的提取條件下，考察不同硫酸銨飽和度（50%、60%、70%、80%、90%）對辣木葉蛋白得率的影響。

1.2.2.3 料液比對辣木葉蛋白得率的影響 在提取時間為8 h，硫酸銨飽和度為70%的提取條件下，考察不同料液比（1:2、1:4、1:6、1:8、1:10 g/mL）對辣木葉蛋白得率的影響。

1.2.3 辣木葉蛋白提取工藝響應(yīng)面試驗設(shè)計 根據(jù)單因素實驗所確定的各因素對辣木葉蛋白得率的影響，利用響應(yīng)面Box Behnken試驗設(shè)計，選擇提取時間、硫酸銨飽和度、料液比3個因素，各取3個水平進行試驗設(shè)計，以辣木葉蛋白得率為響應(yīng)值，并對結(jié)果進行合理分析并認證，以確定辣木葉蛋白提取的最佳工藝。響應(yīng)面分析因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素及水平設(shè)計Table 1 Response surface factors and levels

1.2.4 辣木葉蛋白含量的測定 參照代佳和等[16]和黃秋偉等[17]的方法并稍作修改，用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，以牛血清蛋白作為標準蛋白，在波長595 nm處測吸光值，制作標準曲線，回歸方程為y=1.8291x-0.01，R2=0.997，其中y為蛋白濃度，x為吸光值。以溶液中蛋白得率作為參考依據(jù)確定各工藝的最佳條件。

式中：C為標準曲線算出的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL；V為辣木葉提取液的體積，mL；N為辣木葉提取液稀釋倍數(shù)；M為新鮮辣木葉的質(zhì)量，g。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE SDS-PAGE：參照聞崇煒等[18]、施婭楠等[19]的方法：第一個程序50 V，30 min；第二個程序 120 V，70 min。

考馬斯亮藍染色：將膠取下，放入固定液中，在搖床上搖晃使其固定30 min左右，倒入適量的考馬斯亮藍染液，并避光過夜染色，回收考馬斯亮藍染液，倒入干凈的脫色液，直至膠的背景干凈，用UP水浸泡，置于凝膠快速成像儀進行拍照。

1.2.6 辣木蛋白凝集活性的測定 取96孔V型血凝板，用移液槍依次向各孔中加入50 μL PBS，第一個孔加入50 μL 1 mg/mL辣木葉蛋白提取液，進行吸打4～5次，混合均勻后，從第一孔吸出50 μL，移至第二個孔中再次吹打4～5次，混合后再吸出50 μL，移至第三孔，以此類推作倍比稀釋（每排的最后一個孔不加，用作空白對照），然后向每個孔中加入50 μL 4%的兔紅細胞懸液[20]，并將V型血凝板放在微型振蕩器上振蕩1 min使充分混勻，在室溫放置2 h后肉眼觀察血凝結(jié)果，用2n（n為孔的位數(shù)）表示[21]。

1.2.7 辣木葉蛋白糖抑制/結(jié)合特異性 將八種糖配制成0.5 mol/L的糖溶液，用移液槍吸取50 μL糖溶液在96孔“V”型血凝板第一個孔中，第二到第九個孔加入相同劑量，pH含量為7.4，用PBS等倍稀釋糖溶液，第十個孔用PBS做對照。每孔中都加50 μL的辣木葉蛋白，混勻后，并將V型血凝板放在微型振蕩器上振蕩1 min使充分混勻，室溫靜置30 min，再加入50 μL的4%兔紅細胞懸液，室溫靜置2 h后，檢測凝血活力。實驗中用到糖的種類分別是：ɑ-甲基-D-吡喃葡萄糖苷、麥芽糖-水合物、D-甘露糖、D（+）無水葡萄糖、D-棉子糖五水物、甲基-ɑ-D-吡喃葡萄糖苷、乳糖、甲基-β-D-吡喃半乳糖苷[22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Design-Expert 8.0.6進行響應(yīng)面設(shè)計，實驗結(jié)果用 GranphPad Prism5軟件進行統(tǒng)計分析并作圖。其中P＜0.05說明差異顯著，P＜0.01說明差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 提取時間對辣木葉蛋白得率的影響 在硫酸銨飽和度為70%，料液比為1:8 g/mL的條件下，提取時間對辣木葉蛋白得率的影響如圖1所示。辣木葉蛋白的得率隨著提取時間的增加而增加；當時間增加到8 h時，蛋白得率隨之降低，可能是因為隨著時間的延長細胞內(nèi)的蛋白降解酶也隨之溶出，這些蛋白降解酶降解了部分溶出的蛋白，從而降低了蛋白的得率[23]。提取時間在8 h時，辣木葉蛋白提取效果最好，得率為10.08 mg/g，是提取時間2 h的蛋白得率的0.55倍。因此，確定提取辣木葉蛋白的最佳時間為8 h。

圖1 提取時間對辣木葉蛋白得率的影響Fig.1 Effects of extraction time on the yield of Moringa oleifera leaf protein

2.1.2 硫酸銨飽和度對辣木葉蛋白得率的影響 在提取時間為8 h，料液比為1:8 g/mL的條件下，硫酸銨飽和度對辣木葉蛋白得率的影響如圖2所示。當硫酸銨飽和度從50%增加到70%時，辣木葉蛋白的得率從6.66 mg/g增加到12.09 mg/g。然而繼續(xù)增大硫酸銨的飽和度至90%時，辣木葉蛋白得率比70%顯著（P＜0.05）降低了0.67倍，這可能是蛋白質(zhì)在高濃度鹽溶液環(huán)境下發(fā)生了鹽析，從而降低了辣木葉蛋白得率[24]。因此，確定提取辣木葉蛋白的最佳硫酸銨飽和度為70%。

圖2 硫酸銨飽和度對辣木葉蛋白得率的影響Fig.2 Effect of ammonium sulfate saturation on yield of Moringa oleifera leaf protein

2.1.3 料液比對辣木葉蛋白得率的影響 在提取時間為8 h，硫酸銨飽和度為70%的條件下，料液比對辣木葉蛋白得率的影響如圖3所示。當液料比從1:2 g/mL增大到1:6 g/mL時，辣木葉蛋白得率從7.42 mg/g增加到12.54 mg/g，蛋白得率快速提高可能是由于溶劑的適量增加使得辣木也在溶劑中的接觸面積與分散度增大，擴散作用增強[25]。隨著料液比的增加辣木葉蛋白得率卻降低，說明當可溶性蛋白濃度達最大值后，料液比的增加反而會使蛋白質(zhì)濃度降低[26]，因此確定提取辣木葉蛋白的最佳料液比為1:6 g/mL。

圖3 料液比對辣木葉蛋白得率的影響Fig.3 Effects of material-to-liquid ratio on the yield of Moringa oleifera leaf protein

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化辣木葉蛋白提取的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果 在單因素實驗基礎(chǔ)上，根據(jù)3因素3水平進行二次中心組合試驗設(shè)計，測定17組實驗的蛋白得率，結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

2.2.2 模型建立及顯著性檢驗 利用Design-Expert 8.06軟件對表3進行回歸擬合，得到的提取時間、硫酸銨飽和度、料液比3個因素的二次方程模型為：

蛋白得率（mg/g）=13.14-1.68A+0.15B+0.021C-0.57AB-2.72AC+0.39BC-2.19A2-3.04B2-1.93C2

回歸模型模型方差分析結(jié)果見表3。

采用方差分析對辣木葉蛋白得率進行顯著性檢驗分析。由表3、表4可知：模型F=44.69、P＜0.01，說明該模型是極顯著的；失擬項型P=0.4543＞0.05，模型失擬不顯著，說明實驗誤差主要來源于隨機誤差，未知因素對實驗結(jié)果影響較小。模型的決定系數(shù)R2=0.9829，調(diào)整系數(shù)R2（adj）=0.9609，說明模型能解釋96.09%響應(yīng)值的變化，信噪比（Adeq Precision=19.611）大于4，因而擬合度和可信度較好[27]，可用模型對辣木葉蛋白得率進行分析和預(yù)測。CV值（Y的變異系數(shù)）表示實驗準確度，CV值越小，試驗的可靠性越高，本實驗的CV值為5.98%，說明試驗可靠性較高，具有一定實踐指導(dǎo)意義。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Regression model variance analysis table

2.2.3 響應(yīng)面分析結(jié)果 圖4是通過二次回歸模型擬合的各因素之間交互作用的響應(yīng)面分析圖。當響應(yīng)面圖的曲面越陡峭，兩兩因素的交互作用就越明顯，相反，當響應(yīng)面圖的曲面越平緩，兩兩因素的交互作用就越不顯著。當?shù)雀呔€呈圓形時表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形或馬鞍形時則表示兩因素交互作用顯著[28]。由圖5可知，各圖均開口向下，凸形曲面，都存在極值。交互項AB、BC對響應(yīng)值影響不顯著（P＞0.05），AC 對響應(yīng)值影響（P＜0.01）極顯著。由圖5a可知，提取時間對辣木葉蛋白得率的影響大于硫酸銨飽和度；由圖5b可知，提取時間對辣木葉蛋白得率的影響大于料液比；由圖5c可知，硫酸銨飽和度對辣木葉蛋白得率的影響大于料液比；由圖5可知，等高線形狀趨近于橢圓形，說明兩兩因素交互作用明顯。因此，各因素影響辣木葉蛋白得率的影響依次為A（提取時間）＞B（硫酸銨飽和度）＞C（料液比），其結(jié)果與方差分析結(jié)果相同，證明了該模型可靠性高。

圖4 各兩因素交互影響蛋白得率的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface diagram of the interaction of two factors affecting protein yield

2.2.4 最佳工藝條件的確定及驗證試驗 通過回歸模型優(yōu)化得出的辣木葉蛋白得率的最佳工藝條件分別是提取時間6.55 h，硫酸銨飽和度71.27%，料液比1:9.06。為驗證該模型的預(yù)測是否準確，并考慮實際操作過程中的方便性，對實驗條件稍作調(diào)整，確定的最佳工藝條件為提取時間7 h、硫酸銨飽和度71%、料液比1:9，試驗測得辣木葉蛋白得率為13.49 mg/g，與預(yù)測結(jié)果13.76 mg/g基本相符，說明運用響應(yīng)面優(yōu)化得到的模型參數(shù)準確可靠，具有實際應(yīng)用價值。

2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE

辣木葉蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜見圖5，由圖5可知，辣木葉蛋白的分子量主要集中在100～55 kDa（a）、35～25 kDa（b）、25～15 kDa（c）以及10 kDa（d）四個區(qū)域。

圖5 蛋白標品和辣木葉蛋白電泳圖Fig.5 Protein standard and Moringa oleifera leaf protein electrophoresis diagram

2.4 辣木葉蛋白凝集活性的測定

辣木葉蛋白凝集活性與兔紅細胞凝集素效應(yīng)的比較見圖6和表4，結(jié)果表明，辣木粗提蛋白可凝集兔血紅細胞，并得出辣木葉蛋白的凝集效價為28。趙則海等[29]用氯化鈉提取四棱豆葉的蛋白并發(fā)現(xiàn)其凝血效價為25。從玉婷等[30]用生理鹽水提取六種海藻蛋白，發(fā)現(xiàn)角叉菜凝血效價為20，松節(jié)藻凝血效價為20，海帶凝血效價為213，裙帶菜凝血效價為25，條斑紫菜凝血效價為24，萱藻凝血效價為22。

表4 兔紅細胞凝集素效應(yīng)的比較Table 4 Comparison of rabbit hemagglutinin effects

圖6 兔紅細胞凝集素效應(yīng)圖Fig.6 Effect of rabbit hemagglutinin

2.5 辣木葉蛋白的糖抑制/結(jié)合特異性

8種糖對辣木葉蛋白的抑制作用見表5，ɑ-甲基-D-吡喃葡萄糖苷的凝血效價為22，麥芽糖-水合物的凝血效價為 22，D-甘露糖的凝血效價為 23，D（+）無水葡萄糖的凝血效價為20，D-棉子糖五水物的凝血效價為24，甲基-ɑ-D-吡喃葡萄糖苷的凝血效價為23，乳糖的凝血效價為22，甲基-β-D-吡喃半乳糖苷的凝血效價為24。在半抗原抑制的反應(yīng)狀態(tài)下，抑制效果最優(yōu)的糖稱為凝集素的專一性糖。經(jīng)過實驗得出，D（+）無水葡萄糖是辣木葉蛋白凝集素專一性抑制糖，可以較好地抑制兔紅細胞和辣木葉蛋白凝集反應(yīng)，ɑ-甲基-D-吡喃葡萄糖苷、乳糖、麥芽糖-水合物對凝血反應(yīng)也有部分抑制作用。

表5 辣木葉蛋白糖抑制/結(jié)合特異性Table 5 Moringa leaf protein sugar inhibition/binding specificity

3 結(jié)論

本實驗以新鮮辣木葉為原料，在單因素實驗基礎(chǔ)上，結(jié)合響應(yīng)面法建立鹽析法制備辣木葉蛋白工藝的回歸模型，所得到的模型顯著，回歸方程擬合度較好。并通過對回歸方程的分析解決多變量問題，尋找最佳提取工藝，經(jīng)分析各因素對辣木葉蛋白得率的影響順序為：提取時間＞硫酸銨飽和度＞料液比，確定的最佳工藝條件為提取時間7 h、硫酸銨飽和度71%、料液比1:9，在此條件下辣木葉蛋白得率為13.49 mg/g，與預(yù)測結(jié)果13.76 mg/g基本相符。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，可知辣木葉蛋白的分子量主要集中在 100～55、35～25、25～15以及 10 kDa四個區(qū)域。辣木葉蛋白的凝集效價為28，D（+）無水葡萄糖是辣木凝集素專一性抑制糖，可以較好地抑制兔紅細胞和辣木葉蛋白凝集反應(yīng)。本試驗通過鹽析法一定程度上提高了蛋白得率，但與粗蛋白總量相比還有很大的開發(fā)空間，采用新技術(shù)提高辣木葉中蛋白得率有待進一步研究。