戊糖乳桿菌DF9對副溶血弧菌群體感應的淬滅作用

上官文丹，陳 可，陳清瑩，張杏果，鐘青萍,

（1.華農(nóng)（潮州）食品研究院有限公司，廣東潮州 521000；2.廣東省食品質(zhì)量與安全重點實驗室，華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州 510642）

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種常見的食源性病原菌，能導致水產(chǎn)動物或人的細菌性感染疾病甚至是死亡。生物被膜是指細菌菌體與胞外的蛋白質(zhì)、多糖、DNA等相互粘連形成的膜樣聚集體[1]，是細菌為適應復雜多變的生存環(huán)境而進化的高效策略。副溶血弧菌普遍具有較強的生物被膜形成能力，能在海鮮、食物接觸表面以及食品加工設(shè)備表面上成膜[2]，擴大細菌對食品的污染范圍，增加對宿主的感染的機率。統(tǒng)計資料表明，副溶血弧菌引起的食物中毒位居微生物食物中毒的首位，給全球食品安全和人類健康造成潛在的威脅[3-5]。

群體感應（quorum sensing，QS）是細菌集體行為的一種現(xiàn)象，細菌通過自誘導群體感應信號分子（autoinducer，AI）來感知環(huán)境中種群密度的變化，當細菌密度達到一定閾值時，就能調(diào)控細菌中某些基因的表達，進而表現(xiàn)為一系列的行為特征，包括毒力因子分泌、生物被膜形成、孢子形成、胞外水解酶和胞外多糖（extracellular polysaccharides，EPS）產(chǎn)生等，實現(xiàn)單個細胞無法完成的群體性行為，提高細菌對不良環(huán)境的適應性，對致病菌的防治帶來嚴峻的挑戰(zhàn)[6]。QS是副溶血弧菌生活方式的一個重要特征[7]，其中LuxS/AI-2型QS調(diào)控系統(tǒng)介導細菌的致病性和抗逆性，是近年來的研究熱點。張義全[8]和蔣富鳳等[9]的研究結(jié)果表明，受QS系統(tǒng)中LuxM和LuxS分別調(diào)控的OpaR和AphA在副溶血弧菌的不同生長階段調(diào)控副溶血弧菌的毒力因子表達和生物被膜形成等生理途徑；GUO等[7]研究發(fā)現(xiàn)，副溶血性弧菌的生長、毒力及生物被膜形成受LuxM/LuxS依賴的QS系統(tǒng)所調(diào)控。

細菌的致病機制、抗性等主要生理功能依賴其QS系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和控制，而且在食品腐敗變質(zhì)過程中QS系統(tǒng)也發(fā)揮重要作用[10]，因此干擾細菌的群體感應是目前研究的熱點。QS抑制劑（quorum sensing inhibitors，QSIs）是一類能淬滅細菌QS系統(tǒng)的物質(zhì)，其可干擾致病因子等基因的表達，降低致病性，但不引起細菌產(chǎn)生耐藥性，因此QSIs有望成為控制食品腐敗變質(zhì)和減少食物中毒的有效策略。研究發(fā)現(xiàn)部分合成和天然的物質(zhì)對病原菌具有潛在的抗QS活性[11-12]。乳酸菌是公認安全的微生物，通過抑制致病菌QS是發(fā)揮它們抗菌性能的主要方式之一[13]，如清酒乳酸菌NR28能在不影響腸出血性大腸桿菌生長前提下，有效降低該菌的AI-2水平及毒力因子表達[14]，海洋源戊糖片球菌zy-B-1的乙酸乙酯提取物對單增李斯特菌AI-2型QS系統(tǒng)也表現(xiàn)良好的淬滅活性[15]，但對來源于水產(chǎn)品中的副溶血弧菌在相關(guān)方面的研究相對匱乏。因此，本文以副溶血弧菌為研究對象，探究戊糖乳桿菌DF9的乙酸乙酯提取物對其QS調(diào)控系統(tǒng)的抑制效果，為控制與副溶血弧菌相關(guān)的污染和感染，以及拓寬乳酸菌的研究和應用領(lǐng)域具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

戊糖乳桿菌DF9 由本實驗室從內(nèi)蒙古牧民自制奶豆腐中分離鑒定得到，保存于本實驗的-80 ℃冰箱；副溶血弧菌ATCC17802、哈維氏弧菌BB170均購于廣東省微生物菌種保藏中心；胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、酵母粉 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；酸水解酪蛋白、L-精氨酸 上海源葉科技有限公司；硫酸鎂、NaCl、葡萄糖 廣州化學試劑廠；蛋白胨、結(jié)晶紫 上海麥克林公司；乙酸乙酯 天津富宇化工公司；PI染料、PBS液 上海生工生物工程有限公司；FITC-ConA染料 Sigma公司。

PL602-S天平 Mettler Toledo公司；YXQ-LS-50A滅菌鍋 上海博迅公司；150A培養(yǎng)箱 金壇榮華公司；TS-200B搖床 上海天呈科技公司；5417R離心機 Eppendorf公司；Forma ClassⅡA2生物安全柜 Thermo Electron公司；SpectraMax i3x酶標儀 Molecular Devices公司；R1001-VN旋蒸儀、循環(huán)水真空泵 鄭州長城科工貿(mào)公司；BA310-T光學顯微鏡 Motic公司；EVO MA 15掃描電鏡 FEI公司；LSM 7810 DUO激光共聚焦顯微鏡 Zeiss公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng) 將戊糖乳桿菌DF9接入MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h（37 ℃）；副溶血弧菌ATCC17802接入 3% NaCl-TSB 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 12 h（37 ℃，150 r/min）；哈維氏弧菌BB170接入AB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h（30 ℃，90 r/min）。上述菌株均活化2代后使用。

1.2.2 戊糖乳桿菌DF9乙酸乙酯提取物的制備 將過夜活化培養(yǎng)的戊糖乳桿菌DF9接入MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24 h，離心（4 ℃、8000 r/min、10 min）后以0.45 μm的微孔濾膜進行過濾，得到無細胞發(fā)酵液。用等體積乙酸乙酯萃取過夜。取上層乳化層，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)有機溶劑（37 ℃、120 r/min），將濃縮液進行真空冷凍干燥，得到粉末狀提取物，將其溶于TSB或AB培養(yǎng)基中，以0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，配制成濃度為50 mg/mL工作液，將其命名為DF9-QSI，用于后續(xù)實驗中。

1.2.3 DF9-QSI作用下的副溶血弧菌和哈維氏弧菌BB170的生長 將活化培養(yǎng)的副溶血弧菌或哈維氏弧菌接入孔板內(nèi)含 DF9-QSI（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL）的 200 μL 的 3%NaCl-TSB培養(yǎng)基或AB培養(yǎng)基中，以未含DF9-QSI組作為陰性對照組。將孔板置于全自動生長曲線儀中恒溫（37或30 ℃）培養(yǎng)24 h，定期測定600 nm處OD值。

1.2.4 DF9-QSI對副溶血弧菌AI-2活性的影響 采用哈維氏弧菌BB170生物發(fā)光法[16]進行。將副溶血弧菌接種于含 DF9-QSI不同濃度（0、0.2、0.4、0.8 mg/mL）的3% NaCl-TSB培養(yǎng)基中，使菌的終濃度為 107CFU/mL，混勻后培養(yǎng) 12 h，離心、0.22 μm微孔濾膜過濾得無細胞上清液，待用。將過夜活化培養(yǎng)的哈維氏弧菌接種于AB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，將細菌重懸至OD595nm為0.8，按1:5000將該菌液與無菌新鮮AB培養(yǎng)基稀釋、混勻。再將前述所得的無細胞上清液按1:50與哈維氏弧菌的稀釋液進行混合，培養(yǎng)3 h（30 ℃、100 r/min）。避光環(huán)境中吸取200 μL菌液于不透明黑色96孔板中，利用酶標儀的化學發(fā)光模式對哈維氏弧菌的熒光強度進行定量，以未經(jīng)DF9-QSI處理的作為對照組。按公式（1）計算DF9-QSI對AI-2的抑制率：

1.2.5 DF9-QSI對副溶血弧菌動力的影響 吸取2 μL 1.2.4中含DF9-QSI的混合菌液分別接于群集、泳動及蹭行三種平板中央，以未含DF9-QSI組作為對照組，平板正置培養(yǎng)24 h（37 ℃）。觀察并測量副溶血弧菌的遷移區(qū)域大小，并按公式（2）計算抑制率：

式中：dControl表示對照組副溶血弧菌群集/泳動/蹭行的遷移直徑（mm）；dDF9-QSI表示 DF9-QSI處理組副溶血弧菌群集/泳動/蹭行的遷移直徑（mm）。

1.2.6 DF9-QSI對副溶血弧菌EPS合成量的影響將含 DF9-QSI不同濃度（0、0.2、0.4、0.8 mg/mL）的3% NaCl-TSB培養(yǎng)基1 mL加入48孔板中，孔內(nèi)接入副溶血弧菌（終濃度為107CFU/mL），并放入無菌玻片，靜置培養(yǎng)24 h（37 ℃）。以未含DF9-QSI組作為對照組。孵育后的玻片置于含0.5 mL生理鹽水的試管中，振蕩30 s，加入等體積的5%苯酚，振蕩后加入5倍體積濃H2SO4，振勻，取200 μL測定490 nm處OD值，按公式（3）計算抑制率：

式中：ODControl表示對照組的OD490 nm；ODDF9-QSI表示DF9-QSI處理組的OD490nm。

1.2.7 DF9-QSI對生物被膜生物量的影響 吸取1 mL含 DF9-QSI（0、0.2、0.4、0.8 mg/mL）的 3% NaCl-TSB培養(yǎng)基加入96孔板，每孔內(nèi)接入副溶血弧菌（終濃度為 107CFU/mL），靜置培養(yǎng) 24 h（37 ℃）。棄除孔內(nèi)上層菌液，孔板經(jīng)PBS液清洗、恒溫固定（60 ℃，30 min）、0.1% 結(jié)晶紫室溫染色（5 min）、PBS液再清洗、室溫干燥及33%冰乙酸脫色（10 min）后，測定595 nm處OD值，計算抑制率。

1.2.8 光學顯微鏡觀察 吸取1.5 mL含DF9-QSI（0.8 mg/mL）的3% NaCl-TSB培養(yǎng)基加入24孔板，每孔內(nèi)接入副溶血弧菌（終濃度為107CFU/mL），并放入無菌玻片，靜置培養(yǎng)24 h（37 ℃）。以未含DF9-QSI組作為對照組。取出的玻片經(jīng)超純水潤洗3次、0.1%結(jié)晶紫染色（5 min）、超純水再潤洗及室溫晾干后，置于光學顯微鏡的油鏡下觀察。

1.2.9 掃描電鏡觀察 上述1.2.8中孵育好的樣本片經(jīng)PBS液潤洗、2.5%戊二醛液預固定（4 ℃，24 h）、PBS液潤洗、1%鋨酸后固定（0.5 h）及PBS液再潤洗后，依次用系列濃度的乙醇（30%、50%、70%、80%、90%）脫水10 min，再以100%乙醇脫水2次，每次10 min。預處理的玻片再經(jīng)真空干燥和噴金后，置于場發(fā)射掃描電鏡（FE-SEM）下觀察。

1.2.10 激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察 上述1.2.8中孵育好的樣本片用PBS液潤洗后，加入5 μL FITC Con-A 染料染色 30 min（4 ℃），再加入 5 μL PI染料繼續(xù)染色15 min（4 ℃）。以上操作需在避光下進行。之后將樣本片置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為510 nm。以ZEN軟件對圖像進行處理。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上實驗至少進行三次，取其平均值，以SPSS 25.0軟件分析均值的顯著性差異，P＜0.05則差異具有統(tǒng)計意義。圖形采用Graphpad prism 7.0進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 DF9-QSI作用下副溶血弧菌和哈維氏弧菌BB170的生長

由圖1a可知，與對照組相比，當 DF9-QSI濃度≤0.8 mg/mL時，其在一定程度上減緩了副溶血弧菌的生長；當其≥1.0 mg/mL時，DF9-QSI明顯延遲副溶血弧菌進入對數(shù)生長期的時間，并使到達穩(wěn)定期的最終菌濃度顯著減少（P＜0.05），呈現(xiàn)濃度依賴性的抑制作用。本研究中哈維氏弧菌BB170是作為AI-2信號分子的指示菌，還應排除DF9-QSI對其生長的影響。圖1b結(jié)果顯示，哈維氏弧菌在系列濃度的DF9-QSI處理后，生長趨勢與對照組基本保持一致，表明哈維氏弧菌的生長未受到DF9-QSI的影響。為了證明DF9-QSI是通過靶向干擾副溶血弧菌QS調(diào)控系統(tǒng)而非抑制菌生長而發(fā)揮作用，選用≤0.8 mg/mL的DF9-QSI作進一步的研究。

圖1 DF9-QSI處理下副溶血弧菌（a）和哈維氏弧菌BB170（b）的生長變化Fig.1 Growth changes of V.parahaemolyticus (a) and V.harveyi BB170 (b) treated with DF9-QSI

2.2 DF9-QSI對副溶血弧菌AI-2活性的抑制

由圖2可知，添加0.2、0.4和0.8 mg/mL的DF9-QSI對副溶血弧菌AI-2活性的抑制率分別為14.45%±8.56%、50.57%±9.15%和66.16%±5.30%，表明DF9-QSI可通過抑制副溶血弧菌的AI-2活性，靶向干擾其QS系統(tǒng)，具有開發(fā)新型生物制劑以淬滅副溶血弧菌QS的潛力，但具體哪些物質(zhì)發(fā)揮群體感應淬滅作用還有待后續(xù)深入研究。PARK等[14]研究結(jié)果證明清酒乳桿菌NR28對野生型大腸桿菌ATCC43894毒力的抑制與降低其AI-2活性相關(guān)。PELYUNTHA等[17]發(fā)現(xiàn)從發(fā)酵葡萄中分離的乳酸菌能有效干擾傷寒沙門菌的AI-2活性和生物被膜形成，從而降低其毒力。

圖2 DF9-QSI對副溶血弧菌AI-2活性的抑制作用Fig.2 Inhibition effect of DF9-QSI on AI-2 activity of V.parahaemolyticus

2.3 DF9-QSI對副溶血弧菌動力的影響

生物被膜的形成是一個逐步的、動態(tài)循環(huán)的過程，其生命周期大致經(jīng)歷浮游單菌粘附表面、細胞微聚集體形成、三維狀生物被膜形成、生物被膜繼續(xù)發(fā)育成熟、菌體脫落變成浮游菌5個過程[2]。鞭毛和菌毛對細菌生物被膜生命周期的早期表面附著及蔓延有利，與細菌QS調(diào)控系統(tǒng)密切相關(guān)[18]。副溶血弧菌存在鞭毛介導的群集、泳動行為以及菌毛介導的蹭行行為，能增強細菌生物被膜形成能力[19-20]。ENOSBERLAGE等[21]將調(diào)控副溶血弧菌鞭毛運動的flgE和flgD基因敲除后，細菌在物體表面的成膜能力明顯減弱，且不產(chǎn)生成熟生物被膜。圖3顯示，DF9-QSI對副溶血弧菌的動力具有抑制作用。在群集培養(yǎng)基上，副溶血弧菌的運動范圍達（14.11±1.75）mm，以0.2、0.4和0.8 mg/mL DF9-QSI處理時，對細菌的群集抑制率分別為18.10%±7.63%、33.79%±1.53%和39.06%±0.57%。在泳動培養(yǎng)基上，對照組中的副溶血弧菌泳動性能強，遷移直徑為（89.59±0.15）mm，但僅添加0.2 mg/mL DF9-QSI使遷移直徑下降至（46.66±0.58）mm，抑制率為 47.91%±0.65%。在蹭行培養(yǎng)基中，0.8 mg/mL 的DF9-QSI幾乎抑制了副溶血弧菌的蹭行行為，抑制率高達87.44%±1.06%。上述結(jié)果表明，DF9-QSI能明顯影響副溶血弧菌鞭毛和菌毛的功能，減弱細菌在早期的轉(zhuǎn)移、黏附和成膜能力。亦有研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌源QSIs能抑制嗜水氣單胞菌[22-23]、單增李斯特菌[15]及哈維氏弧菌[24]的群集和泳動能力，且與致病菌的QS系統(tǒng)相關(guān)，這與本文所得結(jié)果相類似。

圖3 DF9-QSI對副溶血弧菌群集（a）、泳動（b）和蹭行（c）的抑制作用Fig.3 Inhibitory activities of DF9-QSI on swarming (a), swimming (b) and twitching (c) of V.parahaemolyticus

2.4 DF9-QSI對副溶血弧菌生物被膜形成及其EPS合成的抑制

群體感應影響細菌的生物被膜的形成。由圖4可知，DF9-QSI抑制副溶血弧菌生物被膜的形成，三種濃度下的抑制率分別為5.06%±7.75%、44.46%±6.91%和60.97%±8.31%。結(jié)合上述實驗結(jié)果，表明DF9-QSI能顯著抑制副溶血弧菌的QS系統(tǒng)，進而破壞細菌生物被膜的形成。

EPS具有粘性，能使細胞聚集并相互連接形成微菌落，推動生物被膜向成熟階段發(fā)展。因此，EPS在加強細菌與底物之間結(jié)合，維持生物被膜三維結(jié)構(gòu)完整性以及對抗外界環(huán)境壓力方面具有重要意義[25-26]。圖4顯示，隨著DF9-QSI濃度的增大，對副溶血弧菌EPS合成的抑制率也逐漸增大；以0.2、0.4和0.8 mg/mL的DF9-QSI處理時，對副溶血弧菌EPS合成的抑制率分別為20.25%±9.20%、41.65%±7.35%和60.39%±1.81%，表明DF9-QSI可有效阻止副溶血弧菌產(chǎn)生EPS。NITHYA等[27]報道了奇異變形桿菌和短小芽孢桿菌S6-15的培養(yǎng)提取物能降低副溶血弧菌、銅綠假單胞菌等10種病原菌的疏水性指數(shù)和EPS產(chǎn)量，此外這些提取物對致病菌成膜能力的抑制率達80%～95%。聚球藻細胞提取物對哈維氏弧菌和創(chuàng)傷弧菌的成膜能力及EPS產(chǎn)量的抑制率均在65%以上，且無抗菌活性，也能有效防止致病菌成熟生物被膜的初始附著，并破壞其結(jié)構(gòu)[28]。

圖4 DF9-QSI處理下副溶血弧菌成膜量及EPS合成量的變化Fig.4 Changes of biofilm formation and EPS synthesis of V.parahaemolyticus treated with DF9-QSI

2.5 光學顯微鏡和場發(fā)射掃描電鏡下觀察的生物被膜形貌變化

光學顯微鏡和場發(fā)射掃描電鏡可直觀觀察DF9-QSI作用下的副溶血弧菌生物被膜形貌變化，結(jié)果如圖5所示。在光學顯微鏡下，對照組中的副溶血弧菌在蓋玻片上形成片狀、厚且緊密的生物被膜，在處理組中僅能見到零碎的微菌體或單菌落，無片狀生物被膜存在。經(jīng)過相同系列的固定、洗滌等預處理后，在場發(fā)射掃描電鏡視野下仍能觀察到對照組中的副溶血弧菌菌體聚集形成三維結(jié)構(gòu)的生物被膜，處理組中僅能見到散落分布的菌體。以上顯微觀察結(jié)果表明DF9-QSI明顯降低了副溶血弧菌的成膜能力。類似地，孫夢桐等[24]利用光學顯微鏡和掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)8.0 mg/mL的乳酸乳球菌LY3-1粗提物處理后的哈維氏弧菌菌體分散分布，生物被膜結(jié)構(gòu)喪失。

圖5 光學顯微鏡（a，1000×）和 FE-SEM（b，3500×）觀察DF9-QSI處理下副溶血弧菌生物被膜結(jié)構(gòu)的變化Fig.5 Changes of biofilm structure of V.parahaemolyticus treated by DF9-QSI observed under light microscope(a, 1000×) and FE-SEM (b, 3500×)

2.6 激光共聚焦顯微鏡下觀察的生物被膜形貌變化

細菌生物被膜中EPS的分布及其空間結(jié)構(gòu)的變化可利用熒光染料結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)進行觀察[29]。圖6結(jié)果表明未處理的副溶血弧菌分布密集，菌體被大量EPS（綠色熒光）包裹和覆蓋，形成的生物被膜結(jié)構(gòu)有厚度、完整；而DF9-QSI處理后，膜中的EPS覆蓋面積顯著減少，厚度明顯降低，表明細菌形成的生物被膜完整結(jié)構(gòu)被破壞。該結(jié)果進一步說明DF9-QSI有效抑制了副溶血弧菌生物被膜的形成量及其EPS的合成。

圖6 激光共聚焦顯微鏡觀察DF9-QSI對副溶血弧菌生物被膜的影響Fig.6 Effect of DF9-QSI on the biofilm of V.parahaemolyticus observed by CLSM

3 結(jié)論

QS介導細菌的信號交流系統(tǒng)是微生物世界中常見的現(xiàn)象，然而有害菌依賴QS信號分子調(diào)控形成的生物被膜給抗菌劑（防腐劑、消毒劑、抗生素等）的有效性帶來巨大挑戰(zhàn)，是造成細菌感染、持續(xù)性污染和多重耐藥的主要原因。因此，細菌的QS和生物被膜形成是食品安全和醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域面臨的難題。與常規(guī)使用的抗菌劑相比，QSIs的優(yōu)勢是能以QS為靶標，在不殺死細菌的前提下，有效降低病原菌的致病性和抗性[30]。本文探究了亞抑菌濃度的DF9-QSI對副溶血弧菌QS系統(tǒng)相關(guān)生物表型的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，≤0.8 mg/mL的DF9-QSI基本不影響副溶血弧菌的正常生長，但能有效抑制其AI-2活性、運動（群集、泳動和蹭行）、生物被膜形成及EPS合成，且隨濃度增大，抑制作用明顯增強。光學顯微鏡、場發(fā)射掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡結(jié)果表明DF9-QSI有效抑制了副溶血弧菌生物被膜的形成。因此推測DF9-QSI可能通過降低副溶血弧菌的AI-2活性，進而減弱其生物被膜形成早期階段中浮游菌借助鞭毛、菌毛進行的表面起始粘附的能力，并抑制細菌分泌具有粘連菌體且推動生物被膜發(fā)育成熟的EPS的合成能力，最終抑制副溶血弧菌生物被膜的形成。本研究結(jié)果證實DF9-QSI具有淬滅副溶血弧菌AI-2類QS系統(tǒng)的作用，可為有效解決該菌在食品、醫(yī)療衛(wèi)生上的污染和感染等問題提供一種可行的方法，并進一步提高乳酸菌作為生物源性QSIs的應用價值。然而DF9-QSI影響細菌QS以及調(diào)控生物被膜的相關(guān)分子機理還有待深入研究。