pH和離子強度對甘蔗渣納米纖維Pickering乳液穩(wěn)定性的影響

沈小倩，張 夢，周 偉 ，李如一，何俊燕，李積華，吳邦昊

（1.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖北武漢 430072；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東湛江 524001；3.海南省果蔬貯藏與加工重點實驗室，廣東湛江 524001；4.上海交通大學生命科學技術學院，上海 200240）

甘蔗是我國南方主要的糖料作物，甘蔗渣是甘蔗榨糖之后的副產(chǎn)物，多被廢棄，甘蔗渣中含有48%左右的纖維素，利用困難，造成資源的浪費和環(huán)境的負擔[1-4]。

目前纖維素的利用以制備生物乙醇、飼料、纖維素板材、水凝膠為主[5]，但研究發(fā)現(xiàn)通過纖維素水解得到的纖維素納米晶（CNCs）是制備皮克林（Pickering）乳液的良好壁材[6]。Pickering乳液是指利用較小尺寸粒子（納米級或微米級顆粒）本身特性就能起到穩(wěn)定乳液的一種新興載體技術[7]。一些食品級的固體粒子麥醇溶蛋白、淀粉納米晶體、固體脂質(zhì)顆粒以及纖維素納米晶粒子等已被證明可用來穩(wěn)定Pickering乳液[8]。其中，CNCs粒子由于其可再生性、可持續(xù)性、生物可降解性和生物相容性，以及低碳排放和低密度等優(yōu)良特性，成為當下很多研究工作者感興趣的對象[9]。現(xiàn)已經(jīng)有很多科研人員利用農(nóng)林廢料制備出 CNCs，比如山竹果皮[10]、白果殼[11]、銀杏葉[12]等，這些CNCs能夠穩(wěn)定Pickering乳液，但是目前有關甘蔗渣制備CNCs用于穩(wěn)定Pickering乳液的研究較少，而甘蔗渣CNCs具有較高的長徑比、較好的力學強度、良好的穩(wěn)定性以及其來源豐富等特點，有望成為Pickering乳液穩(wěn)定劑[13]。

CNCs之所以能用于穩(wěn)定Pickering乳液主要在于它良好的兩親性和獨特的納米尺寸，使其能不可逆地吸附于油-水界面，并將油相包裹形成致密的單層或多層界面結構，同時結合空間位阻以阻止相鄰油滴間的碰撞和聚集來穩(wěn)定乳液[14]。但是，很多因素（如pH、離子強度等）會影響粒子在油-水的吸附行為。本研究以甘蔗渣CNCs用來制備Pickering乳液，考察其pH和鹽離子的穩(wěn)定性，探討其作為固體粒子在Pickering乳液中的應用潛力，這對甘蔗渣的綜合利用具有一定的指導意義。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

甘蔗渣 榨汁后得到渣，源于廣東省豐收糖業(yè)發(fā)展有限公司；大豆油 食品級，金龍魚益海嘉里食品營銷有限公司；氫氧化鈉、亞氯酸鈉、乙酸、無水乙醇 均為分析純，西隴科學股份有限公司。

ATS/AMF-5型微射流高壓均質(zhì)機 安托思納米技術（蘇州）有限公司；Zetasizer Pro納米粒度及ZETA電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；T18高速剪切機 美國IKA公司；傅里葉紅外光譜儀（FTIR） 美國Nicolet 公司；上海雷磁pH計 江蘇迅迪儀器科技有限公司；X-ray 衍射儀（X-ray） 德國布魯克 AXS 有限公司；JEM-1000透射電鏡 日本電子株式會社；Leica DMI6000B倒置顯微鏡 德國Leica公司；Thermofisher/MARS哈克流變儀 美國TA公司。

1.2 甘蔗渣纖維素的提取

參考Hu等[15]的方法對甘蔗渣進行提純處理。將潮濕的甘蔗渣在50℃烘箱中過夜，再將其粉碎，粉碎好的甘蔗渣和7.5%亞氯酸鈉按照料液比1:12（w/v）的比例混合，用冰醋酸將pH調(diào)節(jié)到3.9，在75 ℃水浴條件下攪拌加熱2h，隨后用濾網(wǎng)過濾除去亞氯酸鈉溶液，用去離子水洗滌至中性，置于50 ℃烘箱中干燥過夜，再與同體積10%氫氧化鈉混合，在室溫攪拌10 h，過濾收集濾渣，用去離子水洗滌至中性，95%乙醇洗脫，50 ℃烘干后粉碎。

1.3 甘蔗渣CNCs的制備

參考 Mandal等[16]的方法并稍作修改。用64%的硫酸水解甘蔗渣纖維素，料液比1:20，水解溫度45 ℃，水解時間30 min，反應結束后添加10倍的去離子水來終止水解，稀釋后的懸浮液靜置24 h，棄去上清液，下層懸浮液用離心方式洗滌（12000 r/min，20 min），直至懸浮液pH3～4，后5000 r/min離心20 min，收集上清液，呈淡藍色膠體狀，該膠體即為甘蔗渣纖維素納米晶（CNCs），在4 ℃透析，直到中性，并凍干后備用。

1.4 CNC結構性質(zhì)表征

1.4.1 CNCs形態(tài)觀察 參考李霞[17]的方法，用透射電鏡（TEM）觀察CNCs的形態(tài)，顆粒懸浮液稀釋至0.1%，隨后用移液槍吸取20 μL置于潔凈的銅網(wǎng)上，靜置2 min，并用濾紙移除多余的懸浮液，吸取2 μL醋酸雙氧鈾（1%）進行染色，2 min后用濾紙移除多余的染色劑。染色后的樣品置于40 ℃下干燥后使用TEM進行觀察，操作電壓為200 kV。CNCs的長度和寬度均使用軟件Nano Measurer 進行統(tǒng)計測定。

1.4.2 傅里葉紅外（FTIR）和 X 射線衍射（X-ray）測量 FTIR 和 X-ray 用于觀察CNCs 的化學基團和結晶度的差異。參考范柳萍等[11]的方法將干燥的CNCs 顆粒粉末和溴化鉀進行壓片。FTIR 的掃描波長范圍 4000～400 cm-1。X-ray 測量的 2θ 范圍 3°到 50°（1°/min）。纖維素結晶度根據(jù)公式（1）計算：

1.4.3 顆粒粒徑和電位測定 按照Yang等[12]的方法，CNCs顆粒稀釋100倍，粒徑和Zeta電位是用Zetasizer Pro納米粒度及ZETA電位分析儀測量。

1.5 Pickering乳液的制備和性質(zhì)分析

1.5.1 Pickering乳液的制備 按照Kasiri等[18]的方法制備乳液。將0.4%（w/v）CNCs顆粒懸浮液的pH調(diào)為5、7、9、11（固定離子強度為0）或離子強度為10、50、75、100 mmol/L（固定 pH 為 11），按油水比3:7的比例進行混合，制備乳液。用T18高速剪切機以12000 r/min的速率處理混合體系，2 min后得到粗乳液，隨后用ATS/AMF-5型微射流高壓均質(zhì)機進一步處理粗乳液（30 MPa，2次）得到Pickering乳液。

1.5.2 乳液的粒徑和電位 參考Thunnalin等[10]的方法，乳液的粒徑尺寸和粒徑分布采用Zetasizer Pro納米粒度及ZETA電位分析儀進行測定。大豆油的折射率為 1.49。乳液樣品用去離子水進行分散，每個樣品測量 3次。

1.5.3 乳液微觀結構 按照Yang等[12]的方法，用Leica DMI6000B倒置顯微鏡對乳液微觀結構進行觀察。乳液用去離子水稀釋10倍，隨后吸取 20 μL的樣品，仔細滴在載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片進行觀察。

1.5.4 乳液流變特性 按照李霞[17]方法，用Thermofisher/MARS哈克流變儀評估了乳劑的流變特性，取新鮮乳劑（5 mL）放入盤中，等待設定溫度達到25 °C。當剪切速率從0.01 s-1增加到20 s-1時，記錄表觀黏度。

1.5.5 乳析指數(shù) 參考Huang等[19]的方法，通過監(jiān)測乳液層高度在30 d時的變化來評估乳析指數(shù)（CI）。CI使用以下公式計算：CI（%）= Hs/ Ht×100

其中Hs是乳液下層清液的高度（cm），Ht是乳液的總高度（cm）。

1.6 數(shù)據(jù)處理

各組實驗重復3次，采用統(tǒng)計學分析軟件SPSS18.0 進行差異顯著性分析（P＜0.05），Origin 9.1軟件進行作圖處理。

2 結果與分析

2.1 CNCs的結構表征

CNCs的形態(tài)和尺寸如圖1所示，在64wt% H2SO4，料液比為1:15，時間為30 min，溫度45 ℃的水解條件下，得到的CNCs顆粒長度在120 nm左右，直徑約為10 nm，長徑比為12，形態(tài)為短棒狀。此外，圖中的CNCs顆粒分布不均勻，有聚集現(xiàn)象，這是由于纖維素分子中分布著大量的活性羥基基團，使得其分子內(nèi)和分子間易形成強大的范德華力和氫鍵作用力，致使CNCs顆粒之間易發(fā)生聚集，金克霞[20]在研究毛竹纖維素時有類似的發(fā)現(xiàn)。

圖1 CNCs顆粒形態(tài)Fig.1 Morphology of CNCs

CNCs和纖維素的FTIR圖譜如圖2所示，在3346和1639 cm-1處有寬吸收峰，分別羥基的拉伸振動和彎曲振動，在2905 cm-1處的吸收峰是由于C-H的伸縮振動，在1639 cm-1處的吸收峰是由于C=C的伸縮，同時與吸附的水有關。1429 cm-1處的吸收峰可能是因為C-O-C的伸縮模式，在614 cm-1處向外彎曲的吸收峰，是纖維素的特征峰[21]。這個結果表明了通過酸水解制備得到CNCs仍保持天然纖維素的基本化學結構。

圖2 CNCs和纖維素的FITR圖譜Fig.2 FTIR spectra of CNCs and cellulose

CNCs和纖維素的XRD圖如圖3所示，CNCs和纖維素的特征衍射峰的位置位于 2θ=14.64°、16.43°、22.71°、34.2°，分別對應（）、（110）、（020）和（004）晶面。以上角度都屬于Ⅰ型纖維素，并且是典型的纖維素晶體構型[22]，但與纖維素相比，CNCs的衍射峰強度比纖維素高兩倍左右，表明在水解過程中除去了非晶組分，這可能是在非晶區(qū)域中部分糖苷鍵斷裂造成的，纖維素和CNCs的結晶度分別為32%和70%，CNCs結晶度高，因為酸水解破壞了較細的微晶區(qū)域和無序的相，使得微晶尺寸更加均一[23]，Garvey等[23]在研究中也報道了類似的纖維素晶體構型。

圖3 CNCs和纖維素的XRDFig.3 XRD of CNCs and cellulose

由甘蔗渣提取的CNCs顆粒在不同pH條件下的粒徑和電位如圖4A所示。CNCs顆粒粒徑隨著pH的增加而顯著減?。≒＜0.05）。在pH7條件時，粒徑為950 nm，與TEM結果差異較大，是因為CNCs顆粒非常容易聚集。隨著pH從5增加到11，Zeta電位的絕對值增加了12 mV，這可能是因為用硫酸水解時，一部分殘留的磺酸基團隨機分布在CNCs顆粒表面，使其表面帶負電荷而在分子間形成靜電斥力，但由于pH的增加，在堿性條件下去質(zhì)子化[24]，使得Zeta電位的絕對值增加。

圖4 不同pH和離子強度條件下CNCs顆粒的粒徑和電位Fig.4 Particle size and zeta potential of the CNCs suspensions of different pH and different ionic strengths

由甘蔗渣提取的CNCs顆粒在不同離子強度條件下的粒徑和電位如圖4B所示。CNCs顆粒粒徑隨著離子強度的增加而顯著增加（P＜0.05），粒徑從660 nm增加到1200 nm。與此同時，離子強度由0 mmol/L增加到100 mmol/L，Zeta電位的絕對值減少了8 mV，這可能是CNCs表面的負電荷與 Na+發(fā)生靜電吸附作用，使得Zeta電位的絕對值降低，且靜電斥力減小，促使納米顆粒發(fā)生聚集。李霞[17]也在鹽對油棕櫚納米纖維素顆粒懸浮液的影響中報道了，提高鹽濃度會使得Zeta電位的絕對值降低。

2.2 CNCs穩(wěn)定的Pickering乳液特性

2.2.1 粒徑和電位分析 粒徑和電位是乳液最重要的指標，是影響乳液穩(wěn)定性的主要原因，并且不同大小的粒徑和電位的乳液具有不同的應用價值。

在不同的pH條件下，CNCs-Pickering乳液的粒徑和電位的分布如圖5A所示，乳液的粒徑隨著pH的增大而顯著減小（P＜0.05），從5507 nm減小到650 nm。Zeta電位的絕對值隨著pH的增大而顯著增大（P＜0.05），從 23.38 mV 增加到 40.65 mV，這與CNCs顆粒自身電位隨pH的變化是一致的，可能是由于液滴表面吸附的CNCs在堿性條件下去質(zhì)子化所致，Thunnalin等[10]在山竹果皮制備纖維素中也報道了在較高的pH 條件下，乳液Zeta電位的絕對值會增加。

圖5 不同pH和離子強度條件下由CNCs穩(wěn)定的Pickering乳液的粒徑和電位Fig.5 Different pH and different ionic strengths are determined by the particle size and zeta potential of Pickering emulsion stabilized CNCs

在不同離子強度條件下，CNCs-Pickering乳液的粒徑和電位的分布如圖5B所示，乳液的粒徑隨著離子強度的增加而顯著增大（P＜0.05），從 920 nm增加到3720 nm。Zeta電位的絕對值隨著離子強度的增加而顯著減?。≒＜0.05），減小了10 mV，這是因為NaCl對其的靜電屏蔽作用，NaCl屏蔽了CNCs粒子的表面電荷，減弱了CNCs粒子與CNCs粒子之間和CNCs粒子與水之間的相互作用，促進了CNCs粒子與油的相互作用，使得粒徑發(fā)生聚集而增大。何康慧[25]在用竹筍水不溶性膳食纖維制備乳液中也報道了離子強度增強會使得粒徑增大，Zeta電位的絕對值會減小。

2.2.2 乳液形態(tài)觀察 圖6A是不同pH條件下的CNCs-Pickering乳液的微觀結構。在pH5、pH7、pH9時，液滴的大小不一，并且可以觀察到液滴間發(fā)生聚集形成一個大液滴，說明乳液在此條件下穩(wěn)定性相對較差，但在pH11時，液滴相對較為均一，呈現(xiàn)小液滴狀，這可能是在高pH時，液滴的凈電荷量相對較多，因此液滴間的靜電斥力較大，阻止了液滴融合變大[26]，說明乳液粒徑分布應較為均勻，而且穩(wěn)定性相對較好。

圖6B是不同離子強度條件下的CNCs-Pickering乳液的微觀結構。在10 mmol/L時，乳液呈現(xiàn)小液滴狀態(tài)，液滴間的空間位阻阻止了液滴聚集變大，但液滴的大小會隨著離子強度的增加而逐漸變大，而此時靜電屏蔽能力逐漸增強[27]，靜電斥力減弱，因此在100 mmol/L時，乳液液滴間發(fā)生了明顯聚集，甚至破乳，出現(xiàn)了大油滴。

圖6 不同pH和離子強度條件下由CNCs穩(wěn)定的Pickering乳液的微觀結構Fig.6 Stable microstructure of the CNCs -Pickering emulsion with different pH and different ion strengths

2.2.3 流變特性 圖7A是不同pH條件下的CNCs-Pickering乳液的表觀黏度曲線圖。乳液均表現(xiàn)出剪切變稀，這可能是因為在高速剪切下，乳液中的絮凝被慢慢破壞。當剪切速率＜10 s-1，乳液在pH11時表觀黏度最高，當剪切速率＞10 s-1，乳液在pH5時黏度最大。這可能是因為在剪切速率較小時，高pH的乳液液滴間的靜電斥力較大，但隨著剪切速率的增大，液滴間的靜電斥力被破壞，而在低pH時形成的大的液滴群會抵抗剪切速率，使得在剪切速率＞10 s-1時，pH5的乳液的表觀黏度最大[28]。但總體來看，在不同pH條件下的乳液黏度都較小，乳液流動性較強，相似的結果在銀杏納米纖維素中也有報道[7]。

圖7B是不同離子強度條件下的CNCs-Pickering乳液的表觀黏度曲線圖。乳液的黏度隨著鹽濃度的增加而增加，在離子強度為100 mmol/L時，乳液黏度最高；在離子強度為10 mmol/L時，乳液黏度最低。Huang等[19]也報道，在一定范圍內(nèi)增加鹽濃度可以提高Pickering乳液的表觀黏度。這可能是因為NaCl屏蔽的靜電屏蔽作用，使得CNCs粒子內(nèi)的疏水相互作用增大，CNCs粒子在油水界面上的吸附量增加[29]，Pickering乳液會產(chǎn)生弱絮凝現(xiàn)象，因此乳液黏度增加[30]。

圖7 不同pH和離子強度條件下由CNCs穩(wěn)定的Pickering乳液的表觀黏度.Fig.7 Rheological properties of CNCs-Pickering emulsions with different pH and different ion strengths

2.2.4 乳液的乳析指數(shù) CI值表示一段時間內(nèi)，互不相溶的兩種液體，其中一相以液滴狀分散于另一相的能力。CNCs-Pickering乳液在不同pH的CI和外觀形態(tài)如圖8A和圖8a所示。在pH5時，乳液分層速度最快，在第5 d達到頂峰；在pH11的條件下，乳液分層相對較慢，在第7 d時達到峰值，且CI值明顯低于在pH5、pH7、pH9條件下的CI值。另外pH11時的乳液下清層比較渾濁，其他三個乳液下清層相對澄清透明。這可能是因為在較低pH時，形成了較大的液滴群，并且液滴聚集，使得乳液在最開始時分層現(xiàn)象最為明顯。乳液隨著pH的增大CI值會逐漸減小并會延遲分層，翟希川在研究細菌纖維素中也發(fā)現(xiàn)增大pH 會延緩乳液的分層現(xiàn)象[26]。

CNCs-Pickering乳液在不同離子強度下的CI和外觀形態(tài)如圖8B和圖8b所示。在NaCl濃度為100 mmol/L時，乳液在1 d內(nèi)就會分層，在第6 d達到頂峰。而在低NaCl條件下，乳液會在1 d分層，在第7 d達到峰值。100 mmol/L乳液的CI值高于低鹽濃度的CI值，表明在100 mmol/L的條件下有最少的乳化層，這可能是因為在高鹽濃度的條件下，NaCl會對纖維素粒子有較高的靜電屏蔽作用，在這種作用下，液滴聚集，水、油會有較快的分層的速度。但NaCl濃度較低時，油水界面會形成網(wǎng)狀結構，減緩乳液的分層速度。這與Yang等[12]在研究銀杏納米纖維素中的發(fā)現(xiàn)是相似的。

圖8 在不同pH和離子強度條件下由CNCs穩(wěn)定的Pickering乳液的乳析指數(shù)和外觀形態(tài)Fig.8 Creaming index and appearance morphology of the Pickering emulsion stabilized by CNCs at different pH and different ion strengths

3 結論

本文研究了以甘蔗渣CNCs作為Pickering乳液的穩(wěn)定劑，探究pH和離子強度對乳液的形成和穩(wěn)定性的影響。結果表明，通過水解后得到的CNCs仍然保持Ⅰ型纖維素構型，有較高的結晶度，CNCs-Pickering乳液在pH11和10 mmol/L時有最低的乳析指數(shù)、較小的粒徑、較高的Zeta電位絕對值，良好的微觀結構和較好的流變性能。揭示了甘蔗渣CNCs在不同pH和離子強度下的乳化性能，這對甘蔗渣副產(chǎn)物作為潛在乳化劑在食品、化妝品或醫(yī)藥領域中的應用具有重要意義。