蛋白質(zhì)熱處理對綠豆蛋白-高?；Y(jié)冷膠乳液凝膠性質(zhì)的影響

娜音圖，劉少偉，楊清馨，韓莉君

（華東理工大學(xué)食品科學(xué)與工程系，生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

綠豆蛋白有著多種生理功能，并且與大豆蛋白有相似的理化特性[1]，這是綠豆蛋白被廣泛利用的原因[2]。然而在我國，綠豆蛋白作為副產(chǎn)物一般被丟棄，未得到充分利用[3]。在國外，對于綠豆蛋白的研究主要集中于綠豆蛋白的提取、生物活性研究及食品加工[4-6]。早在十多年前，動植物來源的蛋白質(zhì)就被研究者認(rèn)為是天然的乳化劑[7]，同時其凝膠性也是重要的功能特性之一。由于缺乏理想的功能特性，眾多豆類蛋白制品用途十分有限[8]，與大豆蛋白相比，綠豆蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性差[6]，并且其凝膠性也鮮有報導(dǎo)。

乳液凝膠是經(jīng)過了凝膠化的乳液，除用于減脂食品的脂肪替代物外，乳液凝膠還可以制備具有新質(zhì)構(gòu)屬性的新食品[9]，許多蛋白質(zhì)-多糖體系被用于制備乳液凝膠，且蛋白-多糖相互作用對復(fù)雜食品配方的很多方面有重要影響：如可以影響食品的整體性及界面特性[10]。當(dāng)多糖吸附于界面時，蛋白質(zhì)包覆的油滴界面層的機(jī)械強(qiáng)度、空間排斥增大，有助于提高乳液穩(wěn)定性[9]。高酰基結(jié)冷膠是由伊樂藻屬鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas elodea）產(chǎn)生的多糖，作為天然陰離子微生物胞外多糖，其本身即具有優(yōu)秀的乳化性[11]，可用于生產(chǎn)食品的乳液填充凝膠[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)利用綠豆蛋白-高?；Y(jié)冷膠共同制備乳液，陰離子多糖與蛋白質(zhì)的陽離子側(cè)結(jié)合，形成陰離子“蛋白質(zhì)-多糖”可溶絡(luò)合聚集物[13]，進(jìn)而得到乳化性、凝膠性優(yōu)于單一的綠豆蛋白所形成的乳液。乳液為形成凝膠，通常要改變整個體系的環(huán)境，例如添加交聯(lián)劑[14]：谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶介導(dǎo)的分子交聯(lián)對于提高蛋白質(zhì)的交聯(lián)率、改善食品級蛋白凝膠的功能性具有協(xié)同作用[15]。目前，水相下的熱處理仍然是食品加工中最常用的技術(shù)[16]。蛋白質(zhì)在熱處理過程中會經(jīng)歷不同程度的變性，這很大程度上決定了其凝膠性能。目前國內(nèi)外的相關(guān)研究主要集中于凝膠制備時的熱處理條件及凝膠前預(yù)熱處理對凝膠性能的影響[17-18]。

為進(jìn)一步闡述綠豆蛋白變性程度對其形成的凝膠性質(zhì)影響，本實(shí)驗(yàn)將對在不同熱處理溫度及時間下綠豆蛋白-高酰基結(jié)冷膠乳液凝膠的硬度、色差、持水性、形成蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的分子間作用力、凝膠二級結(jié)構(gòu)及微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定，從而說明綠豆蛋白熱變性程度與其凝膠性的關(guān)系，為綠豆蛋白的加工提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠豆蛋白 西安朗德生物科技有限公司提供；高酰基結(jié)冷膠 鄲城財鑫糖業(yè)有限責(zé)任公司提供；食用油 益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司提供；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（120U/g） 山東隆科酶制劑有限公司提供；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸 上海雙向西巴斯科技發(fā)展有限公司；硫酸銅、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）、2-巰基乙醇、尿素上海泰坦科技股份有限公司；十二烷基硫酸鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；溴化鉀 阿拉丁試劑（上海）有限公司；所有用水 均為去離子水；以上試劑除注明外 均為分析純。

CP213電子分析天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海秋佐科學(xué)儀器有限公司；DL-5-B低速大容量多管離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；FJ200-T高速均質(zhì)乳化機(jī) 韜越上海機(jī)械科技有限公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable MicroSystems公司；手持色差計 昆山拓普泰克公司；UV-2000紫外分光光度計、FTIR5700傅里葉紅外紅外光譜儀 尤尼柯（上海）儀器有限公司；便攜式pH計 奧豪斯儀器（上海）有限公司；Scientz Z-10N真空冷凍干燥機(jī)鄭州科達(dá)機(jī)械儀器設(shè)備有限公司；Leica EM ACE200低真空鍍膜機(jī) 德國徠卡公司；S-3400N冷凍掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液制備 綠豆蛋白粉末在磁力攪拌的條件下，于去離子水中分散2 h，之后置于4 ℃條件下過夜，保證蛋白質(zhì)水化充分，制備成為18%（w/v）（以蛋白質(zhì)含量計）的蛋白質(zhì)溶液。將蛋白質(zhì)溶液置于恒溫加熱磁力攪拌器上，在 40、55、70、85、100 ℃ 加熱，加熱時間設(shè)置為 15、30、45、60、120 min。

將高?；Y(jié)冷膠分散于去離子水中，同樣置于4 ℃條件下過夜，使粉末充分水化，制備成為1%（w/v）的溶液。將90%（w/w）的蛋白質(zhì)水溶液和10%（w/w）的高?；Y(jié)冷膠溶液在渦旋振蕩器上混合均勻，制得綠豆蛋白-高?；Y(jié)冷膠溶液。

1.2.2 乳液制備 取1.2.1中制備好的綠豆蛋白-高?；Y(jié)冷膠溶液與玉米油混合，在高速均質(zhì)乳化機(jī)下以10000 r/min，2 min的條件下制備90%（w/w）綠豆蛋白-高?；Y(jié)冷膠和10 %（w/w）玉米油乳液。

1.2.3 凝膠制備 取1.2.2中制備好的乳液20 mL于50 mL離心管中，每克蛋白質(zhì)添加25 U谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶作為蛋白質(zhì)的交聯(lián)劑。置于50 ℃水浴槽中孵育30 min后立即置于95 ℃水浴槽中將酶滅活。

1.2.4 凝膠硬度分析 凝膠的質(zhì)構(gòu)分析參考Xu等[19]的方法并略作修改：將凝膠用小刀切割成為1.5 cm×2.5 cm（厚度×直徑）的圓柱體。采用P/36R型號探頭，設(shè)置測試條件為：測前速度為2.0 mm/s，測試速度為1.0 mm/s，測試后速度為2.0 mm/s，測試壓縮比為50%。

1.2.5 凝膠持水性分析 凝膠的持水性分析參考Zhang等[20]的方法并略作修改：首先將離心管稱重，將凝膠樣品稱重后置于該已知重量的離心管中，在離心機(jī)中以5000 r/min的條件下，離心20 min。離心結(jié)束后將游離出的水倒出，剩余的游離水用濾紙條吸干。將離心后失水的凝膠進(jìn)行稱重，凝膠的持水性按照下式計算：

式中，W1為離心管重量，W2為離心失水前凝膠的重量+離心管重量，W3為離心失水后凝膠的重量+離心管重量，單位以g計。

1.2.6 凝膠色度分析 凝膠的色度分析參考Ningtyas等[21]的方法并略有修改：采用手持式色度儀測定凝膠樣品的色度，以L*、a*、b*測量的形式表示凝膠樣品的色度。其中，L*值代表凝膠的亮度，a*值代表凝膠紅色的色調(diào)到綠色的色調(diào)，b*值代表凝膠黃色的色調(diào)到藍(lán)色的色調(diào)[22]。

1.2.7 凝膠溶解度分析 凝膠溶解度分析參考Xu等[19]的研究方法并略作修改：分別配制下述5種不同的溶液各150 mL：A：去離子水；B：pH9.0的緩沖液（Tris 0.086 mol/L、甘氨酸 0.09 mol/L、Na2EDTA 4 mmol/L）；C：B溶液+十二烷基硫酸鈉20 g/L；D：C 溶液+尿素 8 mol/L；E：D 溶液+2-巰基乙醇1%。

將凝膠分割后，各取1 g凝膠樣品，分別加入至上述溶液5 mL中。在高速均質(zhì)乳化機(jī)中，將凝膠充分破碎分散后，置于4 ℃環(huán)境下反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，置于高速離心機(jī)中，以10000 r/min的條件離心10 min，采用雙縮脲法測定離心后中層清液中的蛋白質(zhì)濃度。

蛋白質(zhì)在各溶液中溶解度代表凝膠形成所需要的相互作用力：溶劑B和A之間的溶解度差異為靜電相互作用；溶劑C和B之間的溶解度差異為疏水相互作用；溶劑D和C之間的溶解度差異為氫鍵；溶劑E和D之間的溶解度差異為二硫鍵。

1.2.8 凝膠FTIR分析 凝膠的FTIR分析參考Xiao等[23]的研究方法并略作修改：使用FTIR 5700傅里葉紅外光譜儀測量凝膠的FTIR光譜。將制備好的凝膠凍干后研磨為粉末后過120目篩。取每個樣品粉末2 mg，與溴化鉀按質(zhì)量比為1:100研磨后壓制成薄片，進(jìn)行掃描，分辨率為4 cm-1，掃描波數(shù)為4000～400 cm-1，掃描次數(shù)為64次。參考秦新生[24]的方法對圖譜進(jìn)行分析。

1.2.9 凝膠微觀結(jié)構(gòu)分析 凝膠微觀結(jié)構(gòu)分析參考Shen等[25]的方法并略作修改：將凝膠制備完成后在4 ℃條件下保藏24 h后凍干，在掃描電鏡下進(jìn)行觀察。將凍干后的凝膠使用導(dǎo)電膠固定在載物臺上，用噴金儀給凍干凝膠噴金，并用掃描電子顯微鏡觀察SEM圖像。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26以及Origin 2019分析軟件進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)均重復(fù)三次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”進(jìn)行表示。采用ANOVA對數(shù)據(jù)的差異顯著性進(jìn)行分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理對凝膠硬度的影響

質(zhì)構(gòu)是蛋白質(zhì)凝膠一項非常重要的指標(biāo)[26]，其中硬度是凝膠的重要特征。從乳液變?yōu)槟z分為兩個步驟，需要蛋白質(zhì)在溶液狀態(tài)下通過熱處理展開分子，經(jīng)過去折疊，將基團(tuán)暴露，此時油滴吸附于疏水的基團(tuán)上[27]。蛋白質(zhì)親水的基團(tuán)進(jìn)行聚集、交聯(lián)。硬度如表1所示。由表1可知，在任意一個熱處理溫度下，隨著熱處理時間延長，蛋白質(zhì)乳液凝膠的凝膠硬度均呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，但是凝膠的最大凝膠硬度則并未出現(xiàn)在同一時間。在40 ℃時，凝膠硬度最大值出現(xiàn)在熱處理時間45 min下，為1225.52±13.19 N；同樣的，當(dāng)熱處理溫度為100 ℃時，凝膠硬度最大值也在熱處理時間45 min時出現(xiàn)，為1095.97±15.64 N。熱處理溫度為55、70、85 ℃時，凝膠硬度最大值出現(xiàn)在熱處理時間30 min時，并且在85 ℃時達(dá)到凝膠硬度最大值1403.91±12.05 N。在同一熱處理時間下，當(dāng)熱處理溫度升高，凝膠硬度逐漸增大，例如在15 min，85 ℃時達(dá)到最大值1229.44±11.74 N，繼續(xù)提高溫度至100 ℃，其硬度下降至878.15±14.11 N。推測當(dāng)對蛋白質(zhì)進(jìn)行加熱，隨溫度的提高或時間的延長，蛋白質(zhì)分子的肽鏈展開，基團(tuán)（帶電基團(tuán)、疏水基團(tuán)、氮、氧、羰基和羧基的硫、氧）的暴露有利于鍵（主要是疏水鍵、氫鍵）的形成。而過度的熱處理，反而會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性嚴(yán)重而相互絮凝[28]。從表1中可知在熱處理條件為85 ℃、30 min時，乳液凝膠的硬度達(dá)到峰值，說明蛋白質(zhì)形成了較為完整的凝膠網(wǎng)絡(luò)[29]。

表1 不同蛋白質(zhì)熱處理溫度和時間下的凝膠硬度Table 1 Gel strength of proteins at different heat treatment temperatures and times

2.2 熱處理對凝膠持水性的影響

蛋白質(zhì)乳液凝膠的持水性可以間接反映凝膠結(jié)構(gòu)的粗糙程度[30]。綠豆蛋白-高?；Y(jié)冷膠的乳液凝膠的持水性是由于蛋白質(zhì)之間相互作用，即共價鍵或非共價鍵通過控制凝膠內(nèi)部的孔隙和毛細(xì)管的水傳質(zhì)決定的[31]。如圖1所示，隨著加熱時間的延長，及加熱溫度的提高，凝膠的持水性總體都呈現(xiàn)出先升高隨后降低的趨勢。由于凝膠的持水性可以反映凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)強(qiáng)弱，推測在較低的加熱溫度、較短的加熱時間內(nèi)，蛋白質(zhì)的變性程度較低，分子的解折疊程度低，暴露出較少的巰基、疏水基團(tuán)等，因此形成的網(wǎng)絡(luò)并不致密。當(dāng)加熱溫度升高，加熱時間延長，蛋白質(zhì)分子解折疊程度提高，能夠形成凝膠網(wǎng)絡(luò)的蛋白質(zhì)分子逐漸增多，也暴露出了更多有利于凝膠形成的基團(tuán)，此時不僅凝膠的強(qiáng)度提高，其網(wǎng)絡(luò)也越加致密，因此持水性提高。但是加熱溫度太高，時間過長，基團(tuán)發(fā)生氧化，反而對凝膠的形成起到不利影響。從圖1上還可以分析出，綠豆蛋白-高?；Y(jié)冷膠的乳液凝膠持水性均可達(dá)到90%以上，這是由于制備凝膠需要較高的固體含量，這樣就使得凝膠網(wǎng)絡(luò)可以結(jié)合較多的水分，在離心的過程中難以除去，因此凝膠的持水性整體較高，這與Zhang等[20]的實(shí)驗(yàn)結(jié)論是一致的。

圖1 凝膠持水性Fig.1 Water holding capacity of gels

2.3 凝膠色度分析

蛋白質(zhì)的加熱溫度會對蛋白質(zhì)樣品的L*值有影響，且Kelleher等[32]表示這種影響是極顯著的。由表2可知，在所有加熱溫度下，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的加熱時間延長至 120 min時，其L*有顯著性下降（P＜0.05）。在熱處理溫度為70、85、100 ℃時，凝膠的a*值隨著熱處理溫度的提高而顯著增大（P＜0.05），且熱處理溫度越高，a*值越大。而在40、55 ℃時，加熱時間從15 min 延長至 120 min，a*值的變化并不顯著（P＞0.05）。凝膠的b*值在低溫條件下（40、55、70 ℃）的變化不明顯，在85、100 ℃時隨時間的延長顯著增大（P＜0.05）。同樣的，在同一加熱溫度下，凝膠的L*值降低，如在85 ℃ 時，由-6.29±0.02 降低至-7.14±0.04，a*值升高，如在 85 ℃ 時，由 0.23±0.01 升高至 0.84±0.08；b*由9.84±0.07增大至10.70±0.07。這表明，在熱處理過程中，凝膠的亮度減小，紅度值增大，黃度值也增大。亮度值的減小，是由于在加熱的過程當(dāng)中，蛋白質(zhì)與材料中未除去的糖類之間發(fā)生美拉德反應(yīng)，褐變引起整體亮度的下降。a*值的升高說明，體系的褐變使得凝膠整體的顏色向紅色靠近。熱處理溫度過高、熱處理時間過長，會降低凝膠亮度，并使凝膠紅度過高，導(dǎo)致凝膠顏色劣變，而色度可以影響消費(fèi)者對食品的喜好，因此對蛋白質(zhì)的熱處理不應(yīng)溫度過高或時間過長。

表2 不同蛋白質(zhì)熱處理溫度和時間下的凝膠色度Table 2 Gel color of proteins at different heat treatment temperatures and times

2.4 凝膠溶解度分析

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶主要作用于蛋白質(zhì)分子中及分子間的谷氨酰胺與賴氨酸殘基之間形成異肽鍵，從而導(dǎo)致分子形成共價交聯(lián)形成高聚物[33]，此時酶的共價交聯(lián)并不能夠被溶劑所溶解。在1.2.7中所用的溶劑可以選擇性地將凝膠樣品中的共價鍵或非共價鍵進(jìn)行破壞，從而將由這些鍵連接的蛋白質(zhì)從凝膠網(wǎng)絡(luò)中釋放出來，即可以將蛋白質(zhì)凝膠進(jìn)行溶解。隨后通過將溶液離心，形成溶解了蛋白質(zhì)的上清液及不能溶解于此種溶劑中的凝膠樣品下層固體。因此蛋白質(zhì)在各溶劑中的溶解度可以間接反映出形成凝膠的分子間作用力。

如圖2所示，形成綠豆蛋白-高酰基結(jié)冷膠乳液凝膠的作用力主要為疏水鍵及氫鍵，靜電力（主要是蛋白質(zhì)與多糖分子之間存在）和二硫鍵的量雖然少，但也參與了凝膠的形成，這與Jiang等[34]、Shand等[35]的研究結(jié)論是一致的。這是由于綠豆蛋白成分大多數(shù)為球蛋白[5]，主要由貯存球蛋白vicillin（8S）、豆球蛋白（11S）和堿性7S構(gòu)成，且大部分為8S球蛋白（90%），11S（8%）及較少的 7S（3%）[4]。11S 則富含二硫鍵，而8S球蛋白由于缺少半胱氨酸，不含二硫鍵，故從數(shù)據(jù)上看，二硫鍵形成凝膠的作用并不如疏水鍵及氫鍵明顯。

圖2 不同蛋白質(zhì)熱處理溫度和時間下的凝膠蛋白質(zhì)溶解度Fig.2 Protein solubility of gels at different heat treatment temperatures and times

將不同加熱時間及不同加熱溫度處理的蛋白質(zhì)凝膠分析結(jié)果進(jìn)行對比可知：在所有溫度下，當(dāng)熱處理時間較短（15 min），蛋白質(zhì)分子未完全展開，成鍵位點(diǎn)暴露較少，交聯(lián)度低下。以40 ℃為例，疏水鍵及氫鍵含量分別為 8.87±0.20和 2.32±0.02 mg/g；而經(jīng)過長時間（＞30 min）的熱處理，形成凝膠的鍵呈現(xiàn)出減少的趨勢，其疏水鍵及氫鍵含量分別由最大值10.24±0.19 mg/g、2.84±0.16 mg/g 減少至 9.03±0.16 mg/g、2.11±0.05 mg/g。這是由于延長熱處理時間時，雖然分子的解折疊劇烈，但是過長時間的熱處理以及過高溫度的熱處理，反而會導(dǎo)致基團(tuán)（疏水鏈段）被破壞，反而不利于分子間鍵的形成。在熱處理時間相同時，以30 min為例：經(jīng)過熱處理后，形成蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵高溫組高于低溫組處理的蛋白質(zhì)，如熱處理溫度為85 ℃，疏水鍵為10.87±0.02 mg/g，氫鍵為4.03±0.02 mg/g；而在40 ℃，二者值分別為10.24±0.16和2.45±0.01 mg/g。在同一熱處理時間，不同的熱處理溫度下，分子間作用力存在差異，這是由于蛋白質(zhì)原料中各組分的變性溫度的差異導(dǎo)致[1]。對蛋白質(zhì)進(jìn)行熱處理，蛋白質(zhì)分子發(fā)生一定程度上的變性：隨著熱處理溫度逐漸升高，促使基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)發(fā)生實(shí)質(zhì)變性，內(nèi)部的疏水性基團(tuán)逐漸暴露，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)之間的相互作用，并增加了蛋白質(zhì)之間的氫鍵數(shù)量。與此同時，蛋白質(zhì)的表面電荷會導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生靜電排斥，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生解折疊，增強(qiáng)蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)[36]。而當(dāng)溫度加熱至100 ℃時，蛋白質(zhì)出現(xiàn)聚集效應(yīng)，且會導(dǎo)致基團(tuán)破壞，不利于鍵的形成。

2.5 凝膠FTIR分析

采用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）研究綠豆蛋白-高?；Y(jié)冷膠乳液凝膠的二級結(jié)構(gòu)，說明熱處理蛋白質(zhì)對凝膠的二級結(jié)構(gòu)的影響。蛋白質(zhì)的主鏈振動被稱為酰胺I、Ⅱ及III三個不同能量區(qū)域的酰胺振動[37]。酰胺 I區(qū)（1600～1700 cm-1，C=O）與氫鍵的相互作用力密切相關(guān)，此區(qū)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化相當(dāng)敏感。但是，在酰胺I區(qū)，蛋白質(zhì)的α-螺旋與無規(guī)則卷曲有頻率重疊，將二者區(qū)分是困難的。而在酰胺III區(qū)，這樣的問題就可以消除。在這一區(qū)域，無水分干擾，且對于不同的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，此區(qū)域可以更好地將α-螺旋與無規(guī)則卷曲進(jìn)行區(qū)分。有研究顯示[37]，在 1260～1310、1230～1260 cm-1處分別發(fā)現(xiàn)了α-螺旋與無規(guī)則卷曲的光譜特征。

因此本實(shí)驗(yàn)選取 1220～1330 cm-1[38]、1600～1700 cm-1，將酰胺I、酰胺III帶進(jìn)行基線校正，平滑后去卷積化，二階導(dǎo)數(shù)擬合后根據(jù)峰面積計算二級結(jié)構(gòu)比率，分別分析β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、α-螺旋與無規(guī)則卷曲在熱處理過程中的變化。圖3是選取熱處理15 min（對其余熱處理溫度下的FTIR結(jié)果具有代表性）時不同熱處理溫度下的凝膠FTIR圖，從圖上可以看出，所有的樣品都表現(xiàn)出相似的紅外光譜模式。

圖3 不同蛋白質(zhì)熱處理溫度和時間下的凝膠的傅里葉紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectrum of gels at different heat treatment temperatures and times

蛋白質(zhì)加熱可以造成蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的重組[39]，因此表3在各溫度、時間下，二級結(jié)構(gòu)含量顯示出差異：β-折疊在熱處理的過程當(dāng)中，在40至70 ℃，隨熱處理時間的延長而呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢。其含量下降表明，蛋白質(zhì)分子受熱變性，當(dāng)其變性的分子出現(xiàn)重組時，含量又隨之上升[36]。而隨后下降的趨勢則是由于蛋白質(zhì)在熱處理時，β-折疊暴露，隨后氫鍵受熱，斷開，因此其含量又隨之下降[40]。而提高熱處理溫度至85、100 ℃時，其含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。這可能是由于在較高的溫度下，蛋白質(zhì)更傾向于聚集而非展開，后續(xù)含量減少，其結(jié)構(gòu)變得更加無序。對于β-轉(zhuǎn)角，其含量呈現(xiàn)出與β-折疊相反的趨勢。這是由于，包裹在分子內(nèi)部的β-折疊會轉(zhuǎn)化為β-轉(zhuǎn)角，這與楊嵐等[40]的研究結(jié)論是一致的。對于α-螺旋，當(dāng)熱處理溫度處于40 ℃時，其含量隨熱處理時間的延長而略有升高，當(dāng)熱處理溫度升高至55和70 ℃時，其含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，這樣的趨勢是由于β-折疊受熱斷開氫鍵，轉(zhuǎn)化為β-轉(zhuǎn)角及α-螺旋。熱處理溫度提升至85 ℃時，其含量又略有減少，這是由于蛋白質(zhì)繼續(xù)發(fā)生了熱變性所致[36]。而當(dāng)熱處理溫度提升至100 ℃時，其變化則不明顯。而無規(guī)則卷曲則與α-螺旋的變化呈現(xiàn)出相反的趨勢：其先減少后增多的變化趨勢，與Wang等[41]的研究結(jié)論一致。而在熱處理溫度逐漸提升的過程中，二級結(jié)構(gòu)變化趨勢并未呈現(xiàn)出連續(xù)的上升或下降，則可能是由于凝膠所用的蛋白質(zhì)濃度較高，阻礙了熱處理的效果，可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)形成較多的聚集體。這些聚集體會導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)的含量被擾亂[41]。

表3 不同蛋白質(zhì)熱處理溫度和時間下的凝膠蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量Table 3 Relative content of the protein secondary structures of gels at different heat treatment temperatures and times

2.6 凝膠微觀結(jié)構(gòu)分析

將同一熱處理時間（15 min的熱處理時間對于其余熱處理時間均具有代表性）下的不同熱處理溫度的凝膠微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比，圖4的A～E依次為40、55、70、85及100 ℃。掃描電鏡圖片中的孔隙是凝膠中的水孔。樣品截面的裂痕為凍干樣品切割時造成的裂紋。如圖：在85 ℃（圖4D）熱處理強(qiáng)度下的凝膠表面幾乎無微孔，截面連續(xù)性好且光滑。而相較于持水性較差的熱處理條件為40 ℃（圖4A）、100 ℃（圖4E）下制備的凝膠，明顯可以看出，持水性較差的凝膠表面微孔明顯增多，且孔隙較大。這是由于在100 ℃處理的條件下，過高的溫度使微粒容積逐步減小，使得蛋白質(zhì)分子之間的接觸面積下降[42]。而在40 ℃時，暴露的基團(tuán)較少而導(dǎo)致蛋白質(zhì)交聯(lián)度小，此時形成的凝膠較為松散，孔隙因此較多。這樣的凝膠持水性差。當(dāng)對蛋白質(zhì)的熱處理強(qiáng)度持續(xù)提高，蛋白質(zhì)之間的連接逐漸增強(qiáng)。而對于85 ℃的熱處理強(qiáng)度下的凝膠，其結(jié)構(gòu)較為致密，對抗外部壓力的抵抗力也大，同時通過毛細(xì)管效應(yīng)可以捕獲更多的水分[43]。

圖4 不同蛋白質(zhì)熱處理溫度和時間下的凝膠微觀結(jié)構(gòu)Fig.4 Microstructures of gels at different heat treatment temperatures and times

3 結(jié)論

作為常見的加工方式，熱處理可以導(dǎo)致綠豆蛋白發(fā)生變性，從而影響其凝膠性能。數(shù)據(jù)顯示：隨熱處理溫度提高，凝膠的持水性、硬度升高，在85 ℃達(dá)到最大值，其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)也最為致密。繼續(xù)提高熱處理溫度，凝膠持水性、硬度下降，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變松散。凝膠的亮度值隨熱處理溫度的升高降低，紅度值升高。而隨著熱處理時間延長，其硬度、持水性、微觀結(jié)構(gòu)也呈現(xiàn)出相同的趨勢：硬度、持水性在30 min達(dá)到最大值。凝膠的溶解度及紅外光譜表明，熱處理會導(dǎo)致蛋白質(zhì)基團(tuán)暴露及蛋白質(zhì)聚集，凝膠的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，過高的熱處理溫度及過長的熱處理時間會導(dǎo)致凝膠劣變。本實(shí)驗(yàn)說明，對綠豆蛋白質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)條件的熱處理，可以起到改善綠豆蛋白-高?；Y(jié)冷膠乳液谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶誘導(dǎo)凝膠性能的作用。