酶法制備透明質酸寡糖及其透皮吸收活性研究

李慧凝，張京良，楊 艮，江曉路,,

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003；2.中國海洋大學醫(yī)藥學院，山東青島 266003；3.青島海洋生物醫(yī)藥研究院，山東青島 266007；4.山東銀河生物科技有限公司，山東濟寧 273200）

透明質酸（Hyaluronic，HA）又稱玻尿酸，是一種由N-乙?；?D-葡糖胺和D-葡萄糖醛酸雙糖重復單元通過β-1,3和β-1,4糖苷鍵構成的天然聚陰離子線性多糖[1]。HA具有獨特的結構特性和生理功能，其生物活性與其分子量密切相關[2]，不同分子量HA具有不同生物活性。高分子HA具有優(yōu)良的保濕性、潤滑性和粘彈性等生物活性[3-4]，透明質酸寡糖（分子量＜10 kDa）具有抗氧化、促進血管生成、促進傷口愈合、抗腫瘤和免疫調節(jié)等多種生物活性[5-8]，在化妝品、食品、醫(yī)藥保健領域具有顯著的應用前景。

目前，制備透明質酸寡糖的方法主要包括物理降解法、化學降解法、生物合成法和酶解法[9]，物理降解法包括超聲波、機械剪切、熱降解等，但此法生成的產物成分不均一，為后期產物分離純化增加困難[10]；化學降解法包括酸解法、堿解法和氧化降解法，化學降解法需要強酸、強堿等劇烈反應條件，容易造成糖苷鍵斷裂、基團脫落等現(xiàn)象，導致寡糖活性喪失[11]；生物合成法制備透明質酸寡糖需要嚴格的反應條件，需要多種反應酶，反應條件復雜，成本較高[12]。以透明質酸裂解酶對透明質酸進行特異性降解，克服了物理化學方法的不足，酶解法制備透明質酸寡糖由于其反應條件溫和，易于控制，產物結構均一，純度高等優(yōu)點越來越成為近年的熱點[13]，李憬昱[14]等通過酶解法制備了高純度透明質酸寡糖，但目前透明質酸裂解酶產量低，價格高昂，嚴重限制酶法制備透明質酸寡糖的研究應用及產業(yè)化。

本課題組前期篩選獲得一株高產透明質酸裂解酶的球形節(jié)桿菌，已對其發(fā)酵性能[15]和酶學性質[16]進行系統(tǒng)研究，研究表明該酶具有優(yōu)異的發(fā)酵性能和酶學特性，具備進一步開發(fā)的潛力。本研究對該透明質酸裂解酶制備透明質酸寡糖的工藝進行研究，并對制備的透明質酸寡糖的透皮吸收等性能進行評價，以期為透明質酸寡糖的開發(fā)應用提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

透明質酸（HA，分子量1500 kDa） 山東眾山生物科技有限公司；透明質酸裂解酶（10000 U/mL）青島海洋生物醫(yī)藥研究院；其他試劑如碳酸鈉、硫酸銨等均為分析純。

L5S紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；HES-24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；Thermo Nicole Is10傅里葉變換紅外光譜儀 賽默飛世爾科技公司；冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；Amazon SL離子肼電噴霧質譜 德國布魯克道爾頓公司；SK-IV數字皮膚水分檢測儀 深圳市凱爾電子廠；RYJ-6B型藥物透皮擴散試驗儀 上海黃海藥檢；AL204精密分析天平 梅特利托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 底物濃度對HA酶解的影響 在加酶量2 U/mg HA的條件下，考察濃度為0.5%、1.0%、2.0%、4.0%（w/v）的HA對酶解的影響，以232 nm的紫外吸收值為指標，確定最適底物濃度。

1.2.2 加酶量對HA酶解的影響 在底物濃度1.0%（w/v）的條件下，考察加酶量為 0.1、0.2、1.0、2.0、3.0、4.0 U/mg對HA酶解的影響，以232 nm的紫外吸收值為指標，確定最適加酶量。

1.2.3 透明質酸寡糖的制備 在底物濃度1.0%（w/v）、加酶量 3.0 U/mg HA的條件下，37 ℃反應12 h，沸水浴5 min滅酶，10000 r/min離心10 min，收集上清液，冷凍干燥得透明質酸寡糖（EO-HA），備用。

1.2.4 紅外光譜分析 參考Gao等[17]的方法利用傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）對EO-HA進行紅外掃描分析。將500 mg溴化鉀烘干至恒重，加入5 mg酶解產物，以溴化鉀粉末作空白對照，在4000～400 cm-1的波數范圍內進行掃描。

1.2.5 質譜分析 參考Silvia等[18]的方法將EO-HA溶解于蒸餾水中，設置離子源溫100 ℃，毛細管電壓3000 V，樣品錐孔電壓40 V，在質核比（m/z）5～2000 amu范圍內進行ESI-MS掃描分析。

1.2.6 吸濕性能 參考陳曉磊等[19]的方法并稍作修改測定樣品的吸濕性能。以甘油為對照，在飽和硫酸銨水溶液（相對濕度RH=81%）和飽和碳酸鈉水溶液（相對濕度RH=43%）環(huán)境中測定。

1.2.7 體表保濕性能 參考屈義等[20]的方法測定樣品的體表保濕性能。在底物濃度1%（w/v），溫度20～25 ℃，相對濕度34%～70%的條件下開展實驗。隨機挑選22～30歲年齡段的皮膚健康受試者10名，選取左前臂內側相同區(qū)域5 cm×5 cm處為受試部位（受試部位在實驗前2～3 d不能使用任何護膚品），清潔后，均勻涂抹樣品0.1 mL，用皮膚水分測試儀測定 0、10、30、60、120 min皮膚的水分含量，在同一區(qū)域內選取不同點測定3～4次，以10%的甘油作為對照。以相對保濕率來評價樣品的保濕效果，具體計算公式如下：

式中：P樣t=x：使用樣品一段時間后皮膚的含水率（%）；P空白：未涂樣品皮膚的含水率（%）。

1.2.8 透皮吸收性能 參考唐澤嚴等[1]的方法測定樣品的透皮吸收性能，測定采用改良的Franz擴散池，將小鼠皮膚固定在供給池與接受池之間，皮膚表層向上，供給池中加入1 mL 5 mg/mL樣品溶液，接收池中加入6.5 mL 0.9%的生理鹽水，設置攪拌轉速 400 r/min，溫度（32±0.5）℃，于 1、2、4、8、10、12 h取1 mL接受液，并補加等量的接受液。測定樣品中糖醛酸含量，并以此計算單位面積累計透過量，具體計算公式如下：

式中Qn：t時間樣品的單位面積累計透過量（μg/cm2）；A：透皮擴散面積（2.8 cm2）；Cn：t時間濃度測定值；Ci：t時間之前濃度測定值；V：接受池總體積（6.5 mL）；Vo：取樣體積（1 mL）；J：透皮速率常數，作Qn對t的曲線得回歸方程，斜率即為透皮速率常數。

1.3 數據處理

試驗重復3次，結果用平均值±標準差來表示；采用軟件SPSS 19.0和GraphPad Prism 8.0對數據進行數據統(tǒng)計及顯著性分析；采用Origin 9.0進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 底物濃度對HA酶解的影響

透明質酸裂解酶通過β消除機制作用于β-1,4糖苷鍵，在葡萄糖醛酸殘基C4，C5間形成不飽和雙鍵，在232 nm處有特征吸收，可以通過232 nm的紫外吸收變化監(jiān)控酶解反應進程[21]。底物濃度對酶解度的影響如圖1所示，在底物濃度為0.5%～4%范圍內，隨著底物濃度的增加，A232 nm先顯著增加（P＜0.05），當底物濃度為1%時，A232 nm達到最大，降解效果較好，后有所降低（P＜0.05）。這可能是由于隨HA濃度增加，黏度逐漸升高，限制了透明質酸酶與HA的結合，從而影響酶解效率。因此，選擇最適底物濃度為1%（w/v）。

圖1 底物濃度對HA酶解的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on HA enzymatic hydrolysis

2.2 加酶量對HA酶解的影響

加酶量是影響酶解反應的重要因素之一，適宜的加酶量有利于更快獲得目標產物，提高生產效率。加酶量對HA酶解的影響如圖2所示，在底物濃度為1%（w/v）條件下，隨著加酶量的增加，A232 nm呈先顯著增加（P＜0.05）后無顯著變化（P＞0.05）的趨勢。當加酶量增加到3 U/mg時，A232 nm快速增加，但當加酶量繼續(xù)增加到4 U/mg時，A232nm值增加趨勢變緩，表明酶與底物結合趨于飽和。綜合考慮成本、酶解效率等，選擇3 U/mg為最適加酶量。

圖2 加酶量對HA酶解的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on HA enzymatic hydrolysis

2.3 紅外光譜分析

通過紅外光譜對樣品進行分析結果如圖3所示，HA和EO-HA都具有糖類特征吸收峰，在3600～3200 cm-1出現(xiàn)O-H鍵的伸縮振動，在3420.78 cm-1處有寬吸收峰，表明其具有氫鍵[22]。2899.10 cm-1處的吸收峰是由于C-H鍵的伸縮振動，1616.68 cm-1處的吸收峰是由于乙酰氨基中C=O的伸縮振動，1411.24 cm-1處的吸收峰是由于C-O的伸縮振動，1377.70 cm-1處的吸收峰是由于C=O的對稱伸縮振動[23]，1206.41 cm-1和1042.64 cm-1處的吸收峰是由于O-H鍵的彎曲振動造成，在1150.99 cm-1處的吸收峰是由于C-O-C鍵的存在[24]。此外，在894.06 cm-1處的吸收是由于吡喃糖中C-H鍵的彎曲振動引起的[25]。此結果表明，HA和EO-HA的紅外分析基本一致，表明EO-HA在溫和條件下被透明質酸裂解酶特異性地解聚，沒有基團脫落，在一定程度上，保留了結構的完整性。

圖3 HA和EO-HA的FT-IR圖譜Fig.3 FT-IR spectrum of HA and EO-HA

2.4 質譜分析

EO-HA質譜結果如圖4所示，結果表明質譜圖中峰主要集中在378.1（[M-H]-），由于透明質酸裂解酶酶解位點為β-1,4糖苷鍵，酶解位點專一，其酶解產物結構主要是不飽和HA二糖（△DiHA）。757.2（[M-H]-）和 779.2（[M-2H+Na]-）為單電荷峰及雙電荷峰，其結構為不飽和HA四糖（o-HA4）。175.0（[M-H]-）為碎片峰，其結構為不飽和糖醛酸（△UA）。透明質酸酶在降解HA的過程中首先進行隨機內切，將HA降解為低分子量片段，然后再從頭裂解HA持續(xù)產生以△DiHA為主要降解產物的透明質酸寡糖[26]。此透明質酸裂解酶的作用模式與S.zooepidemicus的作用模式較為類似[27]。

圖4 EO-HA的質譜分析Fig.4 Negative-ion electrospray mass spectra of EO-HA

2.5 吸濕性能

HA、EO-HA及甘油的吸濕性能如圖5所示，由圖5可知，在飽和硫酸銨和飽和碳酸鈉環(huán)境下，三者吸濕率均在0～12 h迅速增加，在12 h之后增加緩慢，HA在初始階段吸濕性能優(yōu)于EO-HA，但后期兩者的吸濕性能基本一致。此結果表明HA及EOHA均具有良好的吸濕性能。

圖5 HA和EO-HA的吸濕性能分析Fig.5 Moisture abilities of HA and EO-HA

2.6 體表保濕性能

皮膚水分測試儀可根據角質層含水量的高低所引起電阻的變化，從而反應出皮膚角質層含水率的變化，這種方法是目前保濕護膚品保濕功效評價常用的方法之一，皮膚角質層含水率可以用來反映HA和EO-HA的保濕效果，角質層水分含量越高，其保濕性能越好[28]。HA、EO-HA及甘油體表保濕性能如表1所示，初始階段，EO-HA保濕性能較HA弱，且極顯著低于甘油保濕性能（P＜0.01），但隨時間延長至2 h時，EO-HA的保濕效果顯著優(yōu)于HA保濕效果（P＜0.05）。這可能是由于在初始階段HA較EO-HA黏度大，易成膜，鎖水性能好。但后期階段，EO-HA分子量小，可以順利通過40～50 nm的細胞間隙進入角質層，進行深度保濕，HA則無法通過[29]。因此，EO-HA的保濕效果較HA更優(yōu)異。而甘油作為傳統(tǒng)的保濕劑，在體表保濕效果上，表現(xiàn)出理想的保濕性能。

表1 HA和EO-HA及甘油的體表保濕效果Table 1 Moisture retention of HA, EO-HA and glycerin on the skin

2.7 透皮吸收性能

HA及EO-HA的透皮吸收曲線均趨于直線，作Qn對t的方程得到各樣品的透皮動力學方程，結果如表2所示：HA及EO-HA的累計透過量如表3所示。由表2中各樣品的動力學方程可以看出，HA及EO-HA的單位面積累計透過量隨著時間的變化呈線性增長，符合零級動力學方程。透皮吸收系數J反應透皮吸收率，酶法制備的EO-HA的透皮吸收系數最大，表現(xiàn)了較好的透皮吸收性，透皮吸收性能優(yōu)異，由表3可知，在24 h，EO-HA的累計透過量為1.113 μg/cm2，而未降解的HA的累積透過量最低，僅為0.075 μg/cm2，表明分子量越低，其透皮吸收效果越好。而透皮吸收性能越好，體表保濕性能越優(yōu)異，兩者結果一致。這可能是由于高分子HA流動性差，難以透過角質層，而經透明質酸裂解酶降解產生的EO-HA，分子量小，黏度小，可以更好地進入角質層，達到深度保濕的效果。同時，EO-HA可以增加皮膚內源性透明質酸含量，刺激膠原蛋白的生成[30]，延緩人體衰老。

表2 HA和EO-HA的透皮動力學參數Table 2 Penetration kinetic parameter of HA and EO-HA

表3 HA和EO-HA的累計透過量Table 3 Cumulative penetration amount of HA and EO-HA

3 結論

近年來，研究發(fā)現(xiàn)透明質酸及其寡糖具有多種生物功能，成為研究熱點。本實驗采用透明質酸裂解酶酶解制備透明質酸寡糖，對底物濃度及加酶量進行優(yōu)化，并利用傅里葉紅外變換光譜和質譜進行寡糖結構分析結果表明反應透明質酸裂解酶降解透明質酸的最適底物濃度為1%，最適加酶量為3.0 U/mg，紅外光譜表明酶解過程基本沒有基團脫落，保留了透明質酸的結構完整性，酶解產物EO-HA以不飽和透明質酸二糖為主，含有少量的不飽和糖醛酸和和不飽和透明質酸四糖。對EO-HA與HA的吸濕性能、體表保濕性能與透皮吸收性能進行研究，結果表明EOHA吸濕性能與HA基本一致，EO-HA在120 min時皮膚的含水率較HA提高10%左右，顯示出良好的體表保濕性能，EO-HA 24 h的累計皮膚透過量為1.133 μg/cm2，顯著（P＜0.05）高于 HA，表明 EO-HA具有優(yōu)異的透皮吸收性能。上述研究表明，EO-HA具有優(yōu)良的體表保濕與透皮吸收性能，可以發(fā)揮深度保濕，補充內源性HA，刺激膠原蛋白生產等生理功能，可以廣泛應用于化妝品、外用制劑等產品開發(fā)，在生物化工領域具有廣闊的應用前景。