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    光譜法研究赤蘚紅和溶菌酶的相互作用

    2022-03-17 10:35:00張彥青劉娜張麗付鳳艷張彥陳靈智王曉紅
    中國(guó)調(diào)味品 2022年3期
    關(guān)鍵詞:溶菌酶作用力殘基

    張彥青,劉娜,張麗,付鳳艷,張彥,陳靈智,王曉紅

    (衡水學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)系,河北 衡水 053000)

    赤蘚紅(erythrosine,簡(jiǎn)稱(chēng)ETS)是一種人工合成色素,因外觀(guān)鮮艷、人工成本低、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn),故常被用于食品及調(diào)味品的加工與生產(chǎn),以提高其感官性。但有數(shù)據(jù)表明,赤蘚紅色素被大量攝入人體后會(huì)危害人體健康[1-2],聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織規(guī)定,人均日允許攝取量不能超過(guò)1.25 mg/kg[3]。溶菌酶(lysozyme,簡(jiǎn)稱(chēng)LYSO)是一種堿性蛋白,由129個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成,包含6個(gè)色氨酸(Trp)殘基和3個(gè)酪氨酸(Tyr)殘基。而食用色素赤蘚紅經(jīng)食用后,會(huì)與人體中蛋白質(zhì)結(jié)合,將影響LYSO的結(jié)構(gòu)和性能。近年來(lái),趙剛等[4]研究了赤蘚紅與牛血清白蛋白的相互作用機(jī)制及金屬離子Cu2+和Zn2+對(duì)其的影響。湯小玉等[5]利用同步熒光光譜法對(duì)日落黃與人血清蛋白的相互作用機(jī)制進(jìn)行了研究。王新等[6]采用熒光發(fā)射光譜與紫外-可見(jiàn)分光光度法等多重光譜技術(shù)在模擬條件下研究燦爛甲酚藍(lán)與人血清白蛋白的結(jié)合對(duì)構(gòu)象的影響。本文通過(guò)光譜法和分子對(duì)接技術(shù)研究了ETS與 LYSO之間的作用機(jī)制,獲得了結(jié)合參數(shù)和熱力學(xué)參數(shù),為食用合成色素在食品和調(diào)味品科學(xué)方面的應(yīng)用提供了一些有價(jià)值的信息。因此,研究色素對(duì)生物大分子的作用機(jī)制,從分子水平上闡明其效應(yīng),有助于評(píng)價(jià)人工合成色素在食品及調(diào)味品行業(yè)的安全性[7]。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器

    F-7000熒光儀 日本日立公司;HWSY11-K恒溫水浴鍋 北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司;SZ-93純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠(chǎng)。

    1.2 試劑

    LYSO濃度配成2.0×10-5mol/L的溶液,純度≥99%;ETS濃度配成1.0×10-4mol/L的溶液;為維持生理?xiàng)l件下的離子強(qiáng)度,在pH為7.40的Tris-HCl緩沖溶液中添加濃度0.15 mol/L 的NaCl溶液;實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。儲(chǔ)備液的保存條件:277 K,避光保存。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 熒光猝滅法

    在一定溫度(294,304,308 K)下向10.0 mL比色管中按順序加入1.0 mL Tris-HCl緩沖溶液、1.0 mL 2.0×10-5mol/L LYSO溶液和不同體積的濃度為1.0×10-4mol/L的ETS溶液后定容,搖勻并恒溫30 min。在激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí),掃描ETS-LYSO體系的熒光光譜圖。

    1.3.2 三維熒光光譜法

    在294 K溫度下,取10 mL的比色管2支,均加入1.0 mL 2.0×10-5mol/L的LYSO溶液,加入1.0 mL pH為7.4的Tris-HCl緩沖溶液,向2支比色管中分別加入0,1.0 mL 1.0×10-4mol/L的ETS溶液后定容,2支比色管同時(shí)置于294 K溫度梯度下30 min,掃描三維熒光光譜。

    1.3.3 分子對(duì)接

    通過(guò)搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白晶體結(jié)構(gòu),溶菌酶PDB代碼為132L,對(duì)溶菌酶的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行處理,刪除多余的水分子并進(jìn)行分子力學(xué)優(yōu)化,作為分子對(duì)接的受體。獲取化合物ETS的分子結(jié)構(gòu),加氫處理,并采用MOPAC程序[8]優(yōu)化結(jié)構(gòu),計(jì)算PM3原子電荷。最后,采用AutoDock Tools 1.5.6[9]分別處理ETS和LYSO的結(jié)構(gòu),然后對(duì)接模擬實(shí)驗(yàn)利用AutoDock 4.2.6軟件處理,得到作用體系的最佳結(jié)合構(gòu)象[10]。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 ETS-LYSO體系的熒光猝滅光譜

    激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí),固定LYSO的濃度,改變ETS的濃度,ETS與LYSO作用的熒光光譜圖見(jiàn)圖1。

    圖1 ETS-LYSO的熒光發(fā)射光譜(T=294 K)Fig.1 The fluorescence emission spectra of ETS-LYSO system (T=294 K)

    由圖1可知,隨著ETS濃度的增加,LYSO在343 nm處呈現(xiàn)有規(guī)律的降低,可見(jiàn)ETS對(duì)LYSO有熒光猝滅的作用并生成了穩(wěn)定的復(fù)合物。

    通過(guò)Stern-Volmer[11]方程,猝滅常數(shù)Ksv、猝滅速率常數(shù)Kq與溫度的相關(guān)性判斷作用機(jī)制:

    F0/F=1+Kqτ0[L]=1+Ksv[L]。

    (1)

    式中:F0、F分別為未加入ETS前和加入ETS后測(cè)出的熒光強(qiáng)度;τ0為分子熒光平均壽命,約為10-8s;[L]為加入ETS的濃度。根據(jù)[L]與F0/F的數(shù)據(jù)分別為橫、縱坐標(biāo)作圖得到3個(gè)溫度下的3條直線(xiàn),直線(xiàn)斜率為Ksv,得到數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 不同溫度下ETS-LYSO體系的猝滅反應(yīng)參數(shù)Table 1 The quenching reactive parameters of ETS-LYSO system at different temperatures

    由表1可知,3個(gè)溫度下的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r1均大于0.99,說(shuō)明3個(gè)溫度下的直線(xiàn)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系,即ETS-LYSO體系相互作用是單一猝滅;3個(gè)溫度下的Kq值均大于2×1010L/(mol·s)(最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)),并且ETS-LYSO體系的Kq和Ksv值均隨著溫度的升高而降低,因此可確定ETS與LYSO體系的猝滅方式為靜態(tài)猝滅[12]。

    用靜態(tài)猝滅公式lg[(F0-F)/F]=n·lg[L]+lgKa(2),處理計(jì)算ETS與LYSO體系的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n,數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。由表1可得n值約為1,說(shuō)明ETS在與LYSO結(jié)合時(shí)只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)[13],即ETS-LYSO體系形成了1∶1的復(fù)合物;Ka值隨著溫度的上升而趨向減小,即該體系的結(jié)合能力降低,且都在104數(shù)量級(jí),即該體系的結(jié)合能力降低,再一次說(shuō)明ETS與LYSO相互作用方式為靜態(tài)猝滅。

    2.2 ETS-LYSO 體系的作用力類(lèi)型

    根據(jù)Van't Hoff方程,公式RlnK=ΔS-ΔH/T(3),ΔG=-RTlnK=ΔH-TΔS(4),通過(guò)計(jì)算得到ETS與LYSO體系的熱力學(xué)參數(shù),結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2 不同溫度下ETS-LYSO體系的熱力學(xué)參數(shù)

    由表2可知,ΔG<0表明該體系的作用是自發(fā)進(jìn)行的;ΔH<0表明體系復(fù)合物的形成過(guò)程是放熱反應(yīng),作用過(guò)程存在氫鍵[14];色素分子與蛋白分子之間存在疏水作用力的論據(jù)[15]是ΔS>0,由此推斷ETS與LYSO之間作用有氫鍵和疏水作用力存在。

    有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)ΔH<0、ΔS>0時(shí),認(rèn)為體系間主要作用力類(lèi)型為靜電作用力[16],因此試驗(yàn)了離子強(qiáng)度因素對(duì)體系相互作用的影響。即ETS和LYSO的濃度為定值,改變NaCl的濃度,以NaCl的濃度CNaCl、F/F0為橫、縱坐標(biāo)作圖,見(jiàn)圖2。

    圖2 ETS-LYSO體系熒光強(qiáng)度隨NaCl濃度的變化(T=294 K)Fig.2 The changes in fluorescence intensity of ETS-LYSO system with NaCl concentration (T=294 K)

    由圖2可知,NaCl的濃度增大時(shí),F(xiàn)/F0的值幾乎沒(méi)有發(fā)生變化,證明離子強(qiáng)度的因素對(duì)ETS與LYSO的結(jié)合無(wú)影響,可推斷出ETS-LYSO體系在相互作用過(guò)程中的靜電作用力不是主要作用力[17],再一次說(shuō)明該體系的結(jié)合主要靠氫鍵和疏水作用力。

    2.3 ETS-LYSO體系的三維熒光光譜圖

    試驗(yàn)考察了LYSO加入ETS前后的三維熒光光譜圖,見(jiàn)圖3。

    (a)LYSO

    由圖3可知,(a)圖為未加入ETS前LYSO在發(fā)射波長(zhǎng)343 nm處的熒光強(qiáng)度,明顯高于(b)圖加入ETS后的熒光強(qiáng)度,即加入ETS后,LYSO的熒光強(qiáng)度明顯降低,說(shuō)明ETS對(duì)LYSO發(fā)生熒光猝滅且程度較大,兩者產(chǎn)生了相互作用。

    2.4 分子對(duì)接

    通過(guò)分子對(duì)接模擬了ETS與LYSO作用的結(jié)合模型,結(jié)果顯示:結(jié)合體系的最低結(jié)合能ΔG0為-23.19 kJ/mol和通過(guò)實(shí)驗(yàn)計(jì)算得到ΔG=-29.20 kJ/mol之間存在一定誤差,原因可能是ETS與LYSO模擬對(duì)接過(guò)程中排除了溶劑或除氨基酸殘基Trp、Tyr之外的受體的剛性[18]。分子對(duì)接的能量數(shù)據(jù)見(jiàn)表3,其中靜電能(ΔE3)在分子間相互作用中能占據(jù)的比例很小,因此再一次說(shuō)明結(jié)合體系間主要作用力類(lèi)型不是靜電作用。

    表3 ETS-LYSO體系的對(duì)接能量Table 3 The docking energy of ETS-LYSO system kJ/mol

    ETS與LYSO的最佳結(jié)合模式見(jiàn)圖4中(a),ETS與溶菌酶的二維相互作用見(jiàn)圖4中(b),顯示了ETS結(jié)構(gòu)中的羧基和羰基分別與Arg112和Trg63形成了氫鍵相互作用,結(jié)果表明ETS與LYSO的結(jié)合有氫鍵參與。ETS在LYSO中的結(jié)合位置見(jiàn)圖4中(c),圖4中(d)進(jìn)一步顯示結(jié)合位置周?chē)陌被釟埢瑥慕Y(jié)果來(lái)看,ETS還可以與周?chē)氖杷园被?Trp62、Ala107、Trp108和Val109)形成疏水作用,增強(qiáng)了分子與分子間的親和力。根據(jù)ETS與溶菌酶的結(jié)合模式可以發(fā)現(xiàn),氫鍵和疏水作用是二者分子識(shí)別的關(guān)鍵作用力。Trp62、Trp63和Trp108等氨基酸殘基在ETS結(jié)合位點(diǎn)附近,可以一定程度上改變?nèi)芫钢猩彼岣浇h(huán)境的極性,進(jìn)而導(dǎo)致溶菌酶的熒光猝滅,與熒光實(shí)驗(yàn)所得結(jié)論一致。Asp52殘基和Glu35殘基是LYSO的催化位點(diǎn),由圖4中(d)可以觀(guān)察到結(jié)合位置在催化位點(diǎn)附近,表明ETS與LYSO的結(jié)合會(huì)影響LYSO的催化位點(diǎn)附近氨基酸殘基的微環(huán)境,從而對(duì)LYSO催化活性產(chǎn)生影響。

    圖4 ETS與LYSO的結(jié)合模式圖Fig.4 The binding pattern diagrams of ETS and LYSO

    2.5 ETS-LYSO體系的結(jié)合率

    為了更深入研究食用色素與蛋白質(zhì)體系的結(jié)合作用,進(jìn)而通過(guò)理論計(jì)算體系的色素結(jié)合率和蛋白結(jié)合率,可以簡(jiǎn)單預(yù)測(cè)食用色素進(jìn)入人體與蛋白質(zhì)結(jié)合后,對(duì)蛋白質(zhì)自身的性能及對(duì)人體健康的影響。ETS-LYSO體系的結(jié)合率(W)公式如下[19]:

    (5)

    式中:Q為ETS的總濃度,B為L(zhǎng)YSO的總濃度。

    蛋白結(jié)合率為:

    (6)

    在溫度294,304,308 K下,實(shí)驗(yàn)所用LYSO濃度為2.0×10-6mol/L,ETS的濃度在4.0×10-7~10×10-6mol/L范圍內(nèi),利用表1的Ka值并結(jié)合公式(5)和(6),計(jì)算不同溫度下ETS-LYSO體系的蛋白結(jié)合率W(B)分別為57.95%~93.02%(294 K)、40.25%~82.5%(304 K)、13.6%~45.35%(308 K),蛋白游離率分別為42.05%~6.98%(294 K)、59.75%~17.5%(304 K)、86.4%~54.65%(308 K)。ETS-LYSO體系的色素結(jié)合率W(Q)為57.95%~18.6%(294 K)、40.25%~16.5%(304 K)、13.6%~9.07%(308 K),色素游離率為42.05%~81.4%(294 K)、59.75%~83.5%(304 K)、86.4%~90.93%(308 K)。以接近人體溫度的308 K為例,可以看出在ETS-LYSO體系中隨著ETS濃度的增大,色素結(jié)合率隨之減少,而游離色素含量增加但變化程度不大。這是由于ETS濃度較高時(shí),LYSO與ETS結(jié)合沒(méi)有足夠的結(jié)合位點(diǎn),所以游離色素濃度幾乎不受結(jié)合作用的影響。

    結(jié)合率研究的結(jié)果顯示在實(shí)驗(yàn)條件下,游離的ETS濃度含量變化較小,說(shuō)明攝入體內(nèi)的ETS受到ETS與LYSO結(jié)合作用的影響很小,但是游離的LYSO含量會(huì)隨著結(jié)合作用顯著降低,同時(shí)結(jié)合分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)的結(jié)論可知ETS與LYSO結(jié)合之后會(huì)對(duì)酶活性產(chǎn)生影響,因此可推測(cè)人們攝入ETS之后,會(huì)對(duì)LYSO的抗炎殺菌功能產(chǎn)生一定影響。因此,在ETS的實(shí)際應(yīng)用中要嚴(yán)格控制攝入劑量,ETS在食品中的合理食用提供了理論指導(dǎo)。

    3 結(jié)論

    本文采用光譜法和分子模擬對(duì)接研究了ETS與LYSO之間的相互作用,建立了ETS與LYSO的結(jié)合率模型。該方法探究了ETS與LYSO體系的結(jié)合率,并且利用結(jié)合率模型對(duì)LYSO本身抗炎殺菌功能提出了簡(jiǎn)單的預(yù)測(cè),在某些結(jié)合參數(shù)上可能會(huì)有誤差,但是該方法簡(jiǎn)便快速,適用范圍較廣,為研究食用合成色素類(lèi)小分子物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)分子的性能及人體健康的影響提供了一條新的思路和在食品及調(diào)味品中的合理應(yīng)用提供了理論指導(dǎo)[20]。

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