沙棘葉乙酸乙酯萃取物對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠腎臟的保護(hù)作用

楊 陽(yáng)，韓智良，王潤(rùn)梅，喬越妍

（山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西大同 037009)

沙棘（拉丁學(xué)名：Hippophae rhamnoides Linn.）作為藥食同源的植物，是民間常用的做飲料和酒的原料。沙棘含有機(jī)酸、豐富的維生素、花青素等多種生物活性物質(zhì)[1-3]，具有養(yǎng)胃、清除自由基、延緩衰老、降低心腦血管疾病的發(fā)病率、提高耐缺氧能力、降低血清膽固醇、促進(jìn)傷口修復(fù)等作用[4-5]。

糖尿病性腎病是糖尿病患者的并發(fā)癥，其發(fā)生原因包括遺傳因素、長(zhǎng)期高血糖等[6]。實(shí)驗(yàn)研究了沙棘葉乙酸乙酯（ethyl acetate，EA）萃取物對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠腎臟的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用的材料見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器與公司

1.2 動(dòng)物造模及分組

5周齡SPF 級(jí)雄性C57BL/6小鼠通過(guò)高糖高脂肪飼料喂養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)3～4 周后，然后全部禁食不禁水12 h，從中隨機(jī)選取8 只腹腔注射生理鹽水作為正常組，其余小鼠腹腔注射STZ（20 mg/kg）的劑量造模。之后正常飼喂1 周后，尾部采血，空腹血糖≥9 mmol/L 為建模成功。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循山西大同大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的認(rèn)定，編號(hào)：2019001。

實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成6 組，每組8 只，分組及灌胃給藥情況如下：

低劑量給藥組（EA 0.8）：造模成功的糖尿病小鼠，灌胃0.8 mg/kg EA。

中劑量給藥組（EA 4）：造模成功的糖尿病小鼠，灌胃4 mg/kg EA。

高劑量給藥組（EA 20）：造模成功的糖尿病小鼠，灌胃20 mg/kg EA

模型對(duì)照組（STZ:diabetic mice）：造模成功的糖尿病小鼠，灌胃等量生理鹽水

正常對(duì)照組（Normal Control Group，NC）：正常飼養(yǎng)，未進(jìn)行造模的小鼠，灌胃等量生理鹽水。

陽(yáng)性對(duì)照組（Positive control group，PC）：造模成功的糖尿病小鼠，灌胃糖尿病治療藥物，300 mg/kg。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 記錄小鼠生理狀態(tài)指標(biāo)

記錄每組小鼠日常飲食、飲水量、排尿量和實(shí)驗(yàn)期間的體重，以及精神狀況、體態(tài)、死亡情況等并進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.2 空腹血糖的測(cè)定

空腹12h后通過(guò)小鼠尾尖取測(cè)定血糖。

1.3.3 生化檢測(cè)

用試劑盒檢測(cè)各組小鼠GSH、MDA、SOD 的腎氧化應(yīng)激指標(biāo)，TNF-α level 的數(shù)值，BUN、Cre、Alb 等腎功能指標(biāo)。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)與分析

通過(guò)SPSS19.0 對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。兩組資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組資料比較采用單因素方差分析，以P=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組小鼠空腹血糖數(shù)值

與NC 相比較，其他組血糖升高（P＜0.01），且相差不大。從第4 周開始，PC 與EA 組血糖逐漸降低。與STZ組相比，PC 與EA 組血糖水平較低（P＜0.05），說(shuō)明EA 有降血糖的作用，且EA 各組的血糖水平隨劑量增高降低，說(shuō)明呈劑量依賴性。見圖1。

圖1 各組小鼠血糖的變化

2.2 各組小鼠TNF-α level的數(shù)值

圖2顯示：與正常組相比，NC組的TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）；陽(yáng)性對(duì)照的TNF-α 水平降低很多，但高于正常組（P＜0.05）；EA組（20 mg/kg）較陽(yáng)性組明顯降低（P＜0.01）。

圖2 小鼠腎腫瘤壞死因子

2.3 各組小鼠BUN、Cre、Alb的腎功能指標(biāo)

表2 結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照組與與STZ 組差異性顯著，NC 組的各個(gè)指標(biāo)差異性不大。EA 組的Alb 水平介于STZ 組與PC 組之間，且隨劑量增大EA 組Alb 水平增高。EA 組的BUN 和Cre 同Alb 一樣介于STZ 與PC 組之間，但隨劑量增大EA 組BUN 和Cre 水平降低。這表明EA 可以減輕模型大鼠的腎臟損害，且呈劑量依賴性。

表2 小鼠腎功能的變化

2.4 各組小鼠GSH、MDA、SOD的腎氧化應(yīng)激指標(biāo)

由表3 可知，陽(yáng)相對(duì)照組與NC 組的各個(gè)指標(biāo)差異性不大，與STZ 組差異性顯著。而EA(4、20 mg/kg)組的GSH，SOD水平高于陽(yáng)性對(duì)照組。EA(4.20 mg/kg)組的MDA 水平低于陽(yáng)性對(duì)照組。隨劑量增大，EA 組GSH、SOD 增大MDA 減小。這表明EA 對(duì)腎氧化應(yīng)激有保護(hù)作用，且呈劑量依賴性。

表3 小鼠腎氧化應(yīng)激的變化

3 討論

各種氧化應(yīng)激指標(biāo)可以代表腎臟活性氧水平與抗氧化能力是否平衡，如果腎臟受到有害刺激，抗氧化能力不足，自由基就會(huì)產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致腎臟損傷[7]。EA 組的MDA 水平比糖尿病小鼠低，而MDA 是因?yàn)槟I臟清除自由基能力受到損傷導(dǎo)致大量自由基反應(yīng)生成的產(chǎn)物，它會(huì)使蛋白質(zhì)、核酸失去功能，引起細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)中EA 組的SOD 水平比糖尿病小鼠高。SOD 是一種能夠清除自由基的酶，與MDA 的作用相反，它會(huì)降低細(xì)胞毒性[8]。EA 組的GSH 水平比糖尿病小鼠高，GSH 能夠保護(hù)細(xì)胞不被自由基損傷與它結(jié)構(gòu)中的巰基有關(guān)，所以GSH 含量是一種檢測(cè)氧化應(yīng)激的指標(biāo)[9]。可見乙酸乙酯萃取物有改善氧化應(yīng)激的作用。

腎組織中腎小球的變化會(huì)影響腎功能，而Cre 是腎小球?yàn)V過(guò)功能的指標(biāo)之一。Cre 濃度超過(guò)正常值說(shuō)明腎小球的濾過(guò)功能損壞。BUN 和Cre 一樣，其能夠反應(yīng)腎功能變化的原因是腎濾過(guò)功能出現(xiàn)故障時(shí)它就不能從機(jī)體中排出[10]。腎小球?yàn)V過(guò)功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是濾過(guò)膜的通透性，Alb 由于電荷屏障不能通過(guò)腎小球?yàn)V膜，實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)Alb 指標(biāo)則是由于濾過(guò)膜孔徑小導(dǎo)致不能排出，但如果腎功能出現(xiàn)障礙，濾過(guò)膜不帶負(fù)電荷，會(huì)使大量蛋白流出，形成蛋白尿。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，EA 組較模型組的BUN、Cre 水平低，Alb 變高。說(shuō)明乙酸乙酯萃取物對(duì)改善腎功能有積極作用。

與腎病相關(guān)的標(biāo)志物還有炎癥因子TNF-α。炎癥因子在腎臟病中的數(shù)值明顯高于正常，并且由于它是機(jī)體炎癥與免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子，所以它的數(shù)值很重要。TNF-α 可與受體結(jié)合，各種與炎癥相關(guān)因子的表達(dá)導(dǎo)致某些機(jī)制啟動(dòng)，腎臟出現(xiàn)了大量的吞噬細(xì)胞，并產(chǎn)生大量TNF-α 加重病情[11-12]。EA 組相較于STZ 組的TNF-α 水平低，說(shuō)明乙酸乙酯萃取物有減少炎癥反應(yīng)的作用。

糖尿病腎病不像其他疾病可以根治，它只能依靠藥物來(lái)維持穩(wěn)定。此實(shí)驗(yàn)研究的是沙棘葉對(duì)并發(fā)癥腎病的治療效果，對(duì)糖尿病類藥物的發(fā)展有一定的貢獻(xiàn)。