血管緊張素1-7對鹽敏感性高血壓大鼠心臟鈉泵的影響

曹 峻，姜黔峰，周 陳，何繪姍，方明亮，谷尚武

(1.遵義醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563000；2.成都市第二人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科，四川 成都 610017；3.播州區(qū)人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563100)

鹽敏感性高血壓(SSH)是原發(fā)性高血壓的類型之一，主要是由于高鈉鹽攝入導致血壓升高[1]。研究發(fā)現(xiàn)上皮鈉離子通道(Epithelial sodium channel，ENaC)是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)的效應器，此外它還受神經(jīng)體液因子的調(diào)控，參與水鹽代謝和血壓的調(diào)節(jié)[2-4]。研究還發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，AngⅡ)可抑制自發(fā)性高血壓大鼠動脈血管平滑肌細胞膜鈉泵的活性及下調(diào)mRNA的表達[3-4]。Ang1-7是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system，RAS)中重要的活性七肽，主要由血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)水解AngⅡ得到, 生理作用主要表現(xiàn)為降血壓、抗心肌肥厚等心臟保護作用[5]，但其具體機制尚不清楚。因此本研究以神經(jīng)損傷性鹽敏感性高血壓大鼠為研究對象，探究Ang1-7對鹽敏感高血壓大鼠心肌鈉泵活性、mRNA及蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級新生雄性Wistar大鼠35只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司 [合格證號：11400700045542,動物實驗室許可證號：SCXK(京)2012-0001]。選取35只新生雄性Wistar大鼠在出生第1、2天分別行皮下注射辣椒辣素50 mg/kg建立感覺神經(jīng)損傷性鹽敏感性高血壓大鼠模型[6]。經(jīng)過哺乳期3周后予高鹽飼料(含4%NaCl)飼養(yǎng)4周。后根據(jù)不同干預將大鼠隨機分為7組，每組5只。正常對照組：予正常鹽飼料(含0.5%NaCl)飼養(yǎng)；模型組：繼續(xù)予高鹽飼料飼養(yǎng)；替米沙坦組：每日上午經(jīng)消化道給藥，替米沙坦10 mg/(kg·d)；雷米普利組：每日上午經(jīng)消化道給藥，雷米普利1 mg/(kg·d)；假手術(shù)組：Alzet微滲泵入生理鹽水，25 μg/(kg·h)；Ang1-7組：Alzet微滲泵入Ang1-7，25 μg/(kg·h)；A-779組:Alzet微滲泵入A-779，25 μg/(kg·h)；后各組繼續(xù)予4%NaCl高鹽飼料飼養(yǎng)。連續(xù)干預飼養(yǎng)4周后，麻醉取材。所有動物實驗程序均經(jīng)遵義醫(yī)科大學動物護理和使用委員會批準。

1.1.2 儀器試劑 辣椒素、Ang1-7購自美國SIGMA公司；A- 779購自瑞士Bachem公司；替米沙坦購自上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司；雷米普利購自北京賽諾菲安萬特制藥有限公司；大鼠血管緊張素Ⅱ酶聯(lián)免疫分析試劑盒、大鼠血管緊張素1-7酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自上海滬鼎生物科技有限公司；DEPC水、Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-Time PCR試劑盒、β-actin引物購于寶生物(大連)工程有限公司；Na+-K+-ATPase α1亞單位單克隆抗體購自購于abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠尾動脈血壓測量 采用Softron BP-98A大小鼠無創(chuàng)測壓儀測量鼠尾動脈收縮壓。自哺乳期結(jié)束(3周鼠齡)起每周固定時間測量鼠尾動脈收縮壓，每次測量3次取平均值。

1.2.2 酶聯(lián)免疫分析 干預結(jié)束后處死大鼠進行取材。剪取適量左心室心尖部心肌組織，清洗去除血液，勻漿取上清液，使用酶聯(lián)免疫分析測定上清液中Ang1-7和AngII含量。

1.2.3 RT-PCR實驗 提取大鼠左心室心尖部心肌組織總RNA,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物)將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。并在實時PCR反應中，使用大鼠特異性引物用于擴增和檢測基因的表達。RT-PCR反應第一步預變性95℃ 3 min，第二步變性95℃ 10 s，退火、延伸60℃ 45 s，第二步共循環(huán)40次。引物序列如下：Na+-K+-ATPaseα1-subuni：Forward primer：5’-CTGATCAGCATGGCCTATGGAC-3’,Reverse primer：5＇-ACCGTTCTCAGCCAGAATCACA-3＇。使用2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 免疫組化 取大鼠左心室心尖部組織石蠟切片，采用GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒免疫組化染色觀察Na+-K+-ATPase α1亞單位在心肌組織中的分布。結(jié)果經(jīng)使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行圖像數(shù)據(jù)分析，通過軟件計算出每張圖片上陽性顯色部位(棕褐色)的平均光密度(MOD)，將一張切片上3個視野圖像的MOD求平均值作為該切片的MOD。

2 結(jié)果

2.1 不同干預對SSH大鼠血壓的影響 未進行高鹽飲食前(3周鼠齡)，各組間血壓差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。不同鹽濃度飼料飼養(yǎng)4周后(7周鼠齡)，與模型組比較，正常對照組大鼠血壓降低(P<0.05)，且與其它高鹽飼養(yǎng)組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。當藥物干預2周(9周鼠齡)及4周(11周鼠齡)，與模型組比較，正常對照組、替米沙坦組及雷米普利組血壓明顯降低(P<0.05)，假手術(shù)組、Ang1-7組和A-779組血壓無明顯差異(P>0.05)。與干預前血壓比較，藥物干預2周(9周鼠齡)時雷米普利組、替米沙坦組及Ang1-7組血壓有所降低(P<0.05)，余各組前后血壓無明顯差異(P>0.05)；藥物干預4周(11周鼠齡)時，雷米普利組及替米沙坦組血壓下降(P<0.05)，余各組血壓前后無明顯差異(P>0.05，見表1)。

表1 不同干預對SSH大鼠血壓的影響

2.2 不同干預對SSH大鼠心室肌組織Ang1-7和AngII水平的影響 酶聯(lián)免疫分析測定結(jié)果如圖1、2。與模型組比較，正常對照、Ang1-7、A-779、替米沙坦、雷米普利組心室肌組織中Ang1-7濃度增加(P<0.05)，假手術(shù)組無明顯差異(P>0.05)。與Ang1-7組比較，假手術(shù)組及A-779組Ang1-7水平降低(P<0.05)，余各組無明顯差異。

與模型組比較，正常對照、替米沙坦、雷米普利組心室肌AngⅡ濃度降低(P<0.05)，余各組無明顯差異(P>0.05)；與Ang1-7組比較，替米沙坦組及雷米普利組含量降低(P<0.05)，余各組無明顯差異(P>0.05)。

*：與Ang1-7組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05。圖1 各組大鼠心肌組織Ang-(1-7)濃度

*：與Ang1-7組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05。圖2 各組大鼠心肌組織Ang II濃度比較

2.3 不同干預對SSH大鼠心室肌組織Na+-K+-ATPase α1亞單位mRNA表達的影響 RT-PCR檢測結(jié)果如圖3。與模型組比較，正常對照組、替米沙坦組和雷米普利組及Ang1-7組大鼠心肌組織Na+-K+-ATPase α1亞單位mRNA表達量下降(P<0.05)，A-779組及假手術(shù)組無明顯差異(P>0.05)。與Ang1-7組比較，A-779組及假手術(shù)組表達增高(P<0.05)，其它各組無明顯差異(P>0.05)。

*：與Ang1-7組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05。 圖3 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATPase α1亞單位mRNA相對表達量的比較

2.4 不同干預對SSH大鼠心肌組織Na+-K+-ATPase α1亞單位蛋白表達的影響 免疫組化結(jié)果如圖4、5。與模型組比較，正常對照、替米沙坦、雷米普利、Ang1-7組大鼠心室肌組織中Na+-K+-ATPase α1亞單位蛋白表達量降低(P<0.05)，A-779組及假手術(shù)組無明顯差異(P>0.05)。與Ang1-7組比較，A-779組及假手術(shù)組表達增高(P<0.05)，其它各組無明顯差異(P>0.05)。

A：正常對照組；B：替米沙坦組；C：雷米普利組；D：模型組；E：Ang1-7組；F：假手術(shù)組；G ：A-779組；×400。圖4 心肌組織Na+-K+ -ATP aseα1亞單位免疫組化染色結(jié)果

*：與Ang1-7組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05。圖5 心肌組織Na+-K+ -ATP aseα1亞單位免疫組化染色結(jié)果

3 討論

Na+- K+-ATP酶也稱為鈉-鉀泵，簡稱鈉泵，是由α和β兩個亞單位構(gòu)成，而α亞單位是其主要功能單位，是維持細胞鈉離子正常水平的重要轉(zhuǎn)運物質(zhì)。高血壓的發(fā)生受遺傳和環(huán)境等因素的影響，高鹽攝入是已知的環(huán)境因素之一，不同的人表現(xiàn)出對鈉敏感的不同，一些人表現(xiàn)出明顯的血壓上升，而另一些人幾乎沒有變化[7]。因高鈉鹽攝入導致血壓升高，稱為鹽敏感性高血壓，這可能與對鈉處理和排泄途徑的變異有關(guān)。而上皮鈉通道(ENaC)是遠端腎單位Na+重吸收的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運體之一，該通道在調(diào)節(jié)細胞外液容量從而在調(diào)節(jié)血壓方面起著重要作用[8]。在心肌細胞中，Na+-K+-ATP酶參與心肌細胞膜的去極化，并通過Na+/Ca2+交換間接參與細胞內(nèi)Ca2+的調(diào)控[9-10]。近期研究發(fā)現(xiàn)在不同動物模型中Na+- K+-ATP酶信號的長時間激活促進了心肌成纖維細胞的增殖及增加膠原的合成[11]。還有研究發(fā)現(xiàn)動脈血壓的鹽敏感性可能與RAS系統(tǒng)的活動有關(guān)，RAS系統(tǒng)激活與活性氧類等共同參與高血壓的形成，且鈉鹽可能進一步加強其作用[12]。Ang1-7是RAS中的重要活性肽，主要是由ACE2水解AngⅡ得到, 具有降血壓、抗心肌肥厚等心臟保護作用。有研究在小鼠和大鼠的主動脈中，注射Ang 1-7非肽類Mas激動劑和肽類Mas激動劑觀察到血管舒張作用，而加入A-779(一種Ang1-7拮抗劑)后其作用則被抑制或減弱[13]。因此我們以感覺神經(jīng)損傷性鹽敏感高血壓大鼠為研究對象，探究Ang1-7對鈉泵的影響。本研究結(jié)果顯示，在高鹽飼養(yǎng)4周時各組大鼠血壓明顯高于正常對照組，說明造模成功，符合感覺神經(jīng)損傷性鹽敏感高血壓模型特點：正常鹽飼養(yǎng)不會引起血壓升高，而高鹽會導致血壓升高。有研究在Ang1-7治療自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)中發(fā)現(xiàn)，Ang1-7可能通過降低心率從而控制血壓、改善心臟功能，這與我們研究結(jié)果相似[14]。本研究結(jié)果顯示， Ang1-7組大鼠在干預2周后血壓出現(xiàn)下降，但下降幅度較雷米普利組、替米沙坦組弱，說明Ang1-7對該鹽敏感高血壓大鼠模型具有一定降壓作用，但隨著時干預時間延長，降壓作用減弱，其可能原因為后期老鼠體重增加明顯藥物劑量不夠所致，其具體機制還有待進一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)ACE2/Ang1-7/Mas軸中，Ang1-7可激活內(nèi)皮細胞上的Mas受體誘導磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B途徑，激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶，釋放NO并舒張血管降低血壓[15-16]。而在腎臟中Ang1-7可抑制近端小管內(nèi)鈉的再吸收，從而增加腎臟水和鈉的排泄。還有研究發(fā)現(xiàn)鈉泵活性和α1亞基在一腎一狹窄高血壓大鼠中早期明顯增高，但隨后逐漸降低，后期大鼠心肌細胞鈉泵活性和α1亞基表達呈明顯抑制狀態(tài)[17]。這可能與長期高血壓以及嚴重高血壓時這種代償性的反應消失，甚至出現(xiàn)泵活性及基因與蛋白表達抑制有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在高鹽飼養(yǎng)的鹽敏感大鼠模型組較正常對照組大鼠心室肌細胞Na+- K+-ATP酶α1亞單位mRNA及蛋白的表達量明顯升高，說明高鹽會誘導鹽敏感高血壓大鼠Na+- K+-ATP酶α1亞單位的表達，其原因可能與機體為維持細胞內(nèi)高鉀、低鈉的狀態(tài)上調(diào)鈉泵表達有關(guān)；而在給予雷米普利(ACEI類)、替米沙坦(ARB類)干預后心室肌中Na+- K+-ATP酶α1亞單位mRNA及蛋白表達受到抑制，與目前Patel等[18]在肥胖癥大鼠研究中的發(fā)現(xiàn)相似， ACEI類藥物或ARB類藥物對血清中的Na+有下調(diào)作用。本研究同時發(fā)現(xiàn)Ang1-7對心室肌Na+-K+-ATP酶α1亞單位mRNA及蛋白的表達也有抑制作用，再加入拮抗劑A-779后此抑制作用減弱或逆轉(zhuǎn)，提示Ang1-7對心肌鈉泵存在直接的調(diào)節(jié)作用，但具體作用機制還有待進一步研究。

綜上所述，Ang1-7在鹽敏感高血壓的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。高鹽飲食可以誘導鹽敏感性高血壓大鼠心室肌細胞Na+-K+-ATP酶α1亞單位mRNA和蛋白表達升高，而Ang1-7干預后可抑制大鼠心室肌細胞Na+-K+-ATP酶α1亞單位mRNA和蛋白表達，說明Ang1-7對鹽敏感大鼠心室肌鈉泵存在調(diào)節(jié)作用。