Ac2-26對(duì)體外循環(huán)血清致大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

曹雪麗，徐繼洋，羅俊麗，郭宇含，張 紅

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 貴州省麻醉與器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨貴州省普通高等學(xué)校腦科學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099; 2.貴州省司法警察醫(yī)院 麻醉科，貴州 貴陽(yáng) 550004)

體外循環(huán)(Cardiopulmonary bypass，CPB)肺損傷是心臟手術(shù)常見(jiàn)的術(shù)后并發(fā)癥之一，可發(fā)展為急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)，甚至急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)，其死亡率高達(dá)40%[1]。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(Alveolar type Ⅱ epithelial cell，AECⅡ)是肺泡上皮細(xì)胞的重要組成部分，主要功能是合成和分泌肺泡表面活性劑，降低肺泡表面張力以防止肺泡萎陷，對(duì)肺的氣體交換及屏障功能起著關(guān)鍵的作用。有研究發(fā)現(xiàn)[2]，在大鼠CPB肺損傷模型中，電鏡觀(guān)察到AECⅡ的嗜鋨板層小體減少，線(xiàn)粒體水腫。因此，減輕AECⅡ損傷對(duì)尋找CPB肺保護(hù)措施有重要意義。

膜聯(lián)蛋白A 1 (Annexin-A1，ANXA1)作為一種糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)的鈣和磷脂結(jié)合蛋白，是重要的內(nèi)源性抗炎因子[3]，Ac2-26是一種Annexin-A1 N端模擬小分子多肽，具有與ANXA1相似的生物學(xué)功能[4]。本實(shí)驗(yàn)擬用人體CPB血清建立大鼠原代AECⅡ損傷模型，加入Ac2-26共培養(yǎng)后，觀(guān)察對(duì)大鼠AECⅡ的影響，為臨床尋找有效的CPB肺保護(hù)措施提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性野生型SD大鼠，8～12周齡，體重250～300 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供(許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004)。

1.2 藥品、試劑和儀器 Ac2-26(美國(guó)，MedChemExpress公司)；Ⅰ型膠原酶(德國(guó)，Sigma-Aldrich公司)；胰蛋白酶、免疫球蛋白抗原、脫氧核糖核酸酶Ⅰ、DAPI染色液(北京索萊寶科技有限公司)；DMEM/F-12 培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)，Gibco公司)；Gallios流式細(xì)胞儀(美國(guó)，Beckman Coulter公司)；3111型細(xì)胞孵育培養(yǎng)箱(美國(guó)，Thermo公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)，ThermoFisher公司)；倒置熒光顯微鏡(日本，OLYMPUS公司)；X-500型高壓蒸汽滅菌器(日本，TOMY公司)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠AECⅡ的原代培養(yǎng) 用戊巴比妥麻醉大鼠并注射肝素防止肺內(nèi)血栓形成；麻醉起效后處死大鼠，浸泡于75%酒精溶液5 min；無(wú)菌條件下分離出肺及氣管；消化酶消化肺組織13 min，終止消化，將肺組織剪成約1 mm3的組織塊；120 r/min振蕩5 min；細(xì)胞篩過(guò)濾，1 200 r/min離心5 min；裂解紅細(xì)胞后，1 150 r/min離心5 min；棄上清，培養(yǎng)基重懸后置于IgG包被的培養(yǎng)皿中；孵育1 h后，吸取上清液以1 000 r/min離心5 min；棄培養(yǎng)基收集沉淀，加入完全培養(yǎng)基，置于含5.0%CO2的37.0℃細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)。

1.3.2 大鼠AECⅡ的鑒定 免疫熒光法鑒定：提取原代AECⅡ懸液接種于事先已放置細(xì)胞爬片的6孔板中，24 h換液；培養(yǎng)至36 h，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)爬片50%時(shí)，去除培養(yǎng)基，PBS搖床清洗3次，每次5 min；4%甲醛固定15 min，PBS 搖床清洗3次，每次5 min；5%BSA封閉1 h；每張爬片滴200 μL SP-C一抗(1∶250)置于濕盒內(nèi)于4℃冰箱過(guò)夜；PBS清洗3次，每次5 min；每張爬片滴200 μL 稀釋好的二抗(1∶500)室溫孵育2 h(避光)；PBS清洗3次，每次5 min；DAPI細(xì)胞核染色，避光孵育10 min；PBS清洗3次，每次5 min；每張爬片滴25 μL抗熒光淬滅封片劑(含DAPI)封片；最后置于熒光顯微鏡下觀(guān)察并采集圖像。

電鏡鑒定：將培養(yǎng)72 h后的貼壁細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗1次；0.25%胰酶消化，等體積培養(yǎng)基終止消化；1 000 r/min，離心5 min；棄上清，加入電鏡固定液，4℃固定過(guò)夜；PBS清洗3次，每次5 min；乙醇梯度脫水、樹(shù)脂浸透包埋并聚合；切片染色觀(guān)察。

1.3.3 成人體外循環(huán)術(shù)后血清制備 選取16名風(fēng)濕性心臟病手術(shù)患者，年齡(49.63±3.85)歲，手術(shù)時(shí)長(zhǎng)(4.20±0.38)h，在體外循環(huán)停機(jī)后無(wú)菌采血，室溫下靜置1 h，4℃過(guò)夜；4℃，3 000 g，離心10 min，提取上清即為血清；56℃下滅活補(bǔ)體活性，-80℃保存?zhèn)溆?。采血符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(倫理審查編號(hào)：KLLY-2019-117)。

1.3.4 體外循環(huán)血清濃度的篩選 將CPB術(shù)后血清與DMEM/F12培養(yǎng)基按2.5%、5%、7.5%、10%、20%的比例配置，分別加入培養(yǎng)72 h的大鼠AECⅡ中進(jìn)行共培養(yǎng)，取共培養(yǎng)12 h的細(xì)胞及細(xì)胞上清液，用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)活力和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，以此來(lái)篩選出最佳細(xì)胞損傷模型的建模濃度。結(jié)果顯示：隨著CPB后血清濃度的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)活力逐漸降低、而凋亡率增加，7.5%、10%、20%的CPB后血清對(duì)大鼠AECⅡ均有損傷作用，但20%的CPB后血清組的細(xì)胞凋亡率高達(dá)53%，細(xì)胞生長(zhǎng)活力已下降到37%，說(shuō)明細(xì)胞受損嚴(yán)重繼續(xù)培養(yǎng)難以存活。10%CPB后血清組細(xì)胞凋亡率明顯比7.5%組高，細(xì)胞生長(zhǎng)活力兩組間比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示10%CPB后血清對(duì)大鼠AECⅡ有損傷作用，對(duì)細(xì)胞活力影響較小，故本實(shí)驗(yàn)選擇10%CPB后血清作為建模濃度(見(jiàn)表1)。

表1 各組大鼠AECⅡ生長(zhǎng)活力及凋亡率的比較

細(xì)胞完全培養(yǎng)基的制備：在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將胎牛血清與大鼠CPB后血清均按10%的比例加入DMEM/F12培養(yǎng)基中，制備成完全培養(yǎng)基，經(jīng)濾菌器過(guò)濾后加入1%的青鏈霉素混合液。

1.3.5 Ac2-26濃度的篩選 A組為CPB血清與藥物及細(xì)胞共培養(yǎng)組，根據(jù)不同的藥物濃度分為A1組0.125 μmol/L、A2 組0.25 μmol/L、A3 組0.5 μmol/L、A4 組1.0 μmol/L、A5組2.0 μmol/L、A6組為4.0 μmol/L、A7組8.0 μmol/L，CCK-8法分別檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)活力變化及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果顯示：加入AC2-26后，0.25、0.5、1.0 μmol/L濃度組細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞活力增強(qiáng)，但0.5 μmol/L濃度組細(xì)胞凋亡率最低(17.8±0.68)%，提示0.5 μmol/L濃度的AC2-26減輕大鼠CPB血清誘導(dǎo)的AECⅡ損傷效果最佳(見(jiàn)表2)。

表2 各組大鼠AECⅡ生長(zhǎng)活力及凋亡率的比較

1.3.6 實(shí)驗(yàn)分組 將培養(yǎng)72 h生長(zhǎng)狀態(tài)良好的AECⅡ分為3組：①正常培養(yǎng)組(N組)：10%的胎牛血清共培養(yǎng)12 h；②體外循環(huán)血清組(C組)：成人10%體外循環(huán)后血清共培養(yǎng)12 h；③Ac2-26組(A組)：在C組基礎(chǔ)上，于培養(yǎng)基中加入0.5 μM Ac2-26，共培養(yǎng)12 h。

1.3.7 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活力 將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔100 μL，約含105個(gè)細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)至72 h后，加入相應(yīng)培養(yǎng)基共培養(yǎng)11 h；避光條件下，PBS清洗后更換新鮮培養(yǎng)基；每孔加入10%完全培養(yǎng)基90 μL和CCK-8試劑10 μL；置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm 處各組的OD值，根據(jù)說(shuō)明書(shū)的公式：細(xì)胞相對(duì)活力(%)=(OD實(shí)驗(yàn)-OD空白)/(OD對(duì)照-OD空白)×100%。

1.3.8 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞正常培養(yǎng)72 h后加入相應(yīng)培養(yǎng)基，共培養(yǎng)12 h；加入不含EDTA的0.25%胰酶2 mL，3～5 min后，終止消化， 1 000 r/min離心5 min；棄上清，4℃預(yù)冷的PBS 2 mL重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，此步驟重復(fù)2次；棄上清，用1X Annexin V結(jié)合緩沖液1mL進(jìn)行重懸；將5μL Annexin V-FITC加入100 μL單細(xì)胞懸液，室溫下避光孵育15 min；加入5 μL PI試劑和200 μL 1× Annexin V 結(jié)合緩沖液，室溫下避光環(huán)境孵育5 min，上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠AECⅡ的形態(tài)觀(guān)察 倒置相差顯微鏡觀(guān)察原代AECⅡ形態(tài)，在24 h，見(jiàn)細(xì)胞貼壁呈島狀或片狀生長(zhǎng)(見(jiàn)圖1A)，48 h細(xì)胞貼壁較多，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞成簇生長(zhǎng)，體積較前增大，呈梭型、多邊型或立方型(見(jiàn)圖1B)，72 h見(jiàn)細(xì)胞體積較前明顯增大，飽滿(mǎn)圓潤(rùn)，呈立方型生長(zhǎng)(見(jiàn)圖1C)，為最佳生長(zhǎng)時(shí)期。

×200，標(biāo)尺=500 μm。圖1 正常AECⅡ培養(yǎng)形態(tài)對(duì)比

2.2 大鼠原代AECⅡ的鑒定SP-C免疫熒光染色結(jié)果 藍(lán)色熒光為細(xì)胞核DAPI染色，紅色熒光為SP-C蛋白表達(dá)，與細(xì)胞核染色圖片組合后可見(jiàn)絕大多數(shù)細(xì)胞均可正常表達(dá)AECⅡ特異性蛋白SP-C，經(jīng)使用Image J軟件分析后，所提取細(xì)胞純度達(dá)95%左右；透射電鏡觀(guān)察到AECⅡ的標(biāo)志性細(xì)胞器——嗜鋨板層小體，進(jìn)一步確認(rèn)細(xì)胞提取培養(yǎng)成功。

2.3 倒置相差顯微鏡觀(guān)察各組大鼠AECⅡ形態(tài)變化 可見(jiàn)N組細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核大小正常，細(xì)胞內(nèi)顆粒物質(zhì)分布均勻，其余二組均可見(jiàn)不同程度的細(xì)胞核腫大，細(xì)胞內(nèi)顆粒物質(zhì)分布不均，胞體變形，其中C組胞體形態(tài)較A組變化大。

A:N組；B: C組；C:A組；×200，標(biāo)尺=500 μm。圖2 各組AECⅡ光鏡的變化

2.4 各組大鼠AECⅡ中SP-C表達(dá)的變化 各組細(xì)胞均可有SP-C表達(dá)，N組胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)高強(qiáng)度熒光表達(dá)，均勻分布于胞質(zhì)內(nèi)，胞核居中；A組細(xì)胞形態(tài)與N組接近，胞質(zhì)內(nèi)蛋白表達(dá)均勻，熒光表達(dá)強(qiáng)度高；C組與N組及A組相比，細(xì)胞胞質(zhì)松散，細(xì)胞核出現(xiàn)聚集征象，部分細(xì)胞出現(xiàn)破裂壞死，熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱；通過(guò)免疫熒光平均強(qiáng)度分析，N組與A組SP-C熒光表達(dá)強(qiáng)度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.647)；C組熒光強(qiáng)度低于A組(P=0.043)及N組(P=0.016，見(jiàn)表3，圖3、4)。

×200，標(biāo)尺=20μm。圖3 各組AECⅡ中SP-C表達(dá)的變化

2.5 各組大鼠AECⅡ透射電鏡下變化 N組細(xì)胞形態(tài)正常，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)結(jié)構(gòu)完好的嗜鋨板層小體，線(xiàn)粒體無(wú)水腫；A組細(xì)胞見(jiàn)嗜鋨板層小體結(jié)構(gòu)相對(duì)完好，可見(jiàn)部分線(xiàn)粒體輕度腫脹；C組細(xì)胞胞核疏松，特異性結(jié)構(gòu)嗜鋨板層小體的平行排列消失，線(xiàn)粒體腫脹明顯(見(jiàn)圖5)。

圖4 各組AECⅡ中SP-C熒光平均強(qiáng)度的變化

A:N組；B: C組；C:A組。紅色箭頭處為AECⅡ標(biāo)志性細(xì)胞器嗜鋨板層小體；×20 000，標(biāo)尺=2 μm。圖5 各組AECⅡ電鏡下的變化

2.6 各組大鼠AECⅡ生長(zhǎng)活力的比較 N組細(xì)胞活力明顯高于C組(P=0.009)，N組與A組細(xì)胞生長(zhǎng)活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.743)；C組與N、A組相比，細(xì)胞生長(zhǎng)活力下降超過(guò)30%(見(jiàn)表3，圖6)。

*：與N組比，P<0.05；#：與C組比，P<0.05。圖6 各組AECⅡ生長(zhǎng)活力的比較

表3 各組AECⅡ生長(zhǎng)活力、凋亡率及SP-C平均熒光強(qiáng)度的比較

2.7 各組大鼠AECⅡ的細(xì)胞凋亡率比較 N組與A組細(xì)胞凋亡率均在10%之內(nèi)，而C組凋亡率在23%以上，N組(5.58±0.58)與C組(P<0.001)及A組(P<0.001)之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中N組的凋亡率最低，C組(29.50±0.47%)與A組(7.28±0.40%)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，A組凋亡率明顯降低(見(jiàn)表3，圖7)。

A：N組；B：C組；C：A組；D：各組細(xì)胞凋亡率組間比較；*：與N組比，P<0.05；#：與C組比，P<0.05。圖7 各組AECⅡ凋亡率的變化

3 討論

CPB是一種非生理循環(huán)系統(tǒng)，CPB誘導(dǎo)的肺損傷機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為主要的因素有全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和肺缺血-再灌注損傷 (Lung ischemia-reperfusion injury， LIRI)[5]，具體機(jī)制不清。研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠LIRI中，AECⅡ是重要的損傷效應(yīng)細(xì)胞[6]。本實(shí)驗(yàn)擬用人體CPB血清建立大鼠原代AECⅡ損傷模型，模擬CPB后AECⅡ受損情況。本實(shí)驗(yàn)用SD大鼠提取原代AECⅡ，培養(yǎng)48 h后，電鏡下觀(guān)察到嗜鋨板層小體，經(jīng)SP-C熒光染色發(fā)現(xiàn)有AECⅡ特有的SP-C蛋白的表達(dá)，細(xì)胞純度可達(dá)95%左右。在正常培養(yǎng)的AECⅡ中加入成人10%的CPB術(shù)后血清，細(xì)胞凋亡率明顯增高，細(xì)胞相對(duì)活力也明顯下降；免疫熒光下見(jiàn)細(xì)胞胞質(zhì)松散，細(xì)胞核出現(xiàn)聚集征象，部分細(xì)胞出現(xiàn)破裂壞死，SP-C熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱；電鏡下AECⅡ胞核疏松，嗜鋨板層小體平行排列結(jié)構(gòu)消失，空泡形成，線(xiàn)粒體水腫明顯；光鏡下見(jiàn)胞體及細(xì)胞核腫脹明顯，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)顆粒物質(zhì)大小不一，分布不均。說(shuō)明CPB血清可以造成大鼠AECⅡ的損傷，大鼠原代AECⅡ損傷模型成功建立。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白A1擬肽Ac2-26可增加大鼠肺組織內(nèi)源性ANXA1的表達(dá)及IL-10含量，促進(jìn)肺中性粒細(xì)胞凋亡，明顯減輕肺組織病理?yè)p傷，對(duì)肺有一定的保護(hù)作用[7]。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，外源性AnxA1擬肽Ac2- 26通過(guò)與FPR結(jié)合可減輕大鼠體外循環(huán)肺損傷，降低肺組織中TNF-α、IL-1β、ICAM-1和NF- κb p65水平，使肺組織的病理?yè)p傷評(píng)分減低[8]。Luo等[9]研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用Ac2-26可以抑制LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移，通過(guò)p38、JNK-MAPK信號(hào)通路，減少促炎性介質(zhì)TNF-α、IL-1β、MCP-1和MIP-1α的產(chǎn)生，從而緩解炎癥性疼痛。在LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞損傷模型中，Ac2-26可抑制細(xì)胞凋亡，使促凋亡蛋白Bax和caspase-3水平降低，而B(niǎo)cl-2上調(diào)，并且提高細(xì)胞活力[10]。說(shuō)明Ac2-26在體內(nèi)發(fā)揮著抗炎作用，能減輕組織與細(xì)胞的損傷。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在CPB血清組細(xì)胞中加入Ac2-26后，A組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)SP-C蛋白表達(dá)均勻，熒光表達(dá)強(qiáng)度(0.992±0.016)高于CPB血清組(0.940±0.016)；電鏡下見(jiàn)嗜鋨板層小體結(jié)構(gòu)相對(duì)完好，可見(jiàn)部分線(xiàn)粒體輕度腫脹；細(xì)胞凋亡率(7.28±0.40)%明顯低于C組(29.50±0.47)%，細(xì)胞生長(zhǎng)活力(0.96±0.21)明顯高于C組(0.68±0.11)，說(shuō)明Ac2-26可提高細(xì)胞SP-C蛋白表達(dá)，減輕CPB血清誘導(dǎo)的離體大鼠AECⅡ損傷，對(duì)細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。其結(jié)果將為尋找CPB肺保護(hù)措施提供理論依據(jù)。