吳茱萸次堿納米混懸凝膠貼膏經(jīng)大鼠神闕穴給藥的藥代動力學(xué)分析

周開花，歐水平，丁剛紅，龔余惠，王 森

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2．遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義 563099)

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.) Benth的干燥近成熟果實，其性熱，味辛苦[1]，具有散寒止痛、降逆止嘔，助陽止瀉的功效[2]。吳茱萸穴位貼敷至今仍廣泛應(yīng)用，常貼敷穴位涌泉穴和神闕穴用于治療內(nèi)、外、婦、兒科等多種疾病[3-5]，并拓展用于治療失眠[6]、高血壓[7]等，具有簡、效、便、廉的特點。吳茱萸次堿(Rutaecarpine，RUT)是吳茱萸的藥效成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗血栓形成、抗血小板聚集、保護(hù)心臟和體溫調(diào)節(jié)等藥理作用[8-10]。研究表明，RUT脂水均難溶，限制其口服吸收，在體皮膚微透析實驗發(fā)現(xiàn)，RUT具有緩慢透皮、滲透量高的特點[11]。研究認(rèn)為，神闕穴位皮膚給藥的透過量及速率顯著高于非穴位皮膚[12]，但尚未見RUT外用制劑神闕穴貼敷的體內(nèi)透皮吸收動力學(xué)研究。前期將RUT制成納米混懸凝膠，可促進(jìn)RUT的經(jīng)皮吸收[13]。凝膠貼膏具有載藥量高、維持穩(wěn)態(tài)血藥濃度、延長給藥間隙、使用方便及降低不良反應(yīng)等優(yōu)點[14]。本文將RUT制成吳茱萸次堿納米混懸凝膠貼膏(Rut-nanosuspension based gel patch，RUT-NGP)，以SD大鼠為動物模型，建立體內(nèi)RUT的分析方法，并對該方法進(jìn)行方法學(xué)驗證，研究RUT-NGP經(jīng)神闕穴貼敷給藥后大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征，測定了RUT藥動學(xué)參數(shù)，為RUT-NGP穴位貼敷療法的臨床用藥提供藥動學(xué)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，為RUT新劑型的研究開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 WiSys 5000 高效液相色譜系統(tǒng)(月旭科技(上海)股份有限公司)；TGL-16C離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；DURA12超純水機(jī)(澤拉布儀器科技(上海)有限公司)；Xw-80A漩渦混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；YGC-12氮吹儀(成都雅源科技有限公司)；QPA-08LP空氣發(fā)生器(上海全浦科學(xué)儀器有限公司)；QPN-5L氮氣發(fā)生器(上海全浦科學(xué)儀器有限公司)；ME204E電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；Sartorius BT125D分析天平(Sartorius科學(xué)儀器(北京)有限公司)；N5型多功能修毛磨甲器(寧波愛克利浦電器有限公司)；DL-820D智能超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)；AH-2010高壓均質(zhì)機(jī)(ATS Engineering inc)，TB-0612B型實驗用涂布機(jī)(上海鎧凱科技貿(mào)易有限公司)。

1.2 試藥 吳茱萸次堿原料藥(陜西昊辰生物科技有限公司，WZYCJ180325，純度91%)，吳茱萸次堿對照品(成都曼思特生物科技有限公司，MUST-16040314，純度99.97%)，色胺酮(成都埃法生物科技有限公司，AF8120201，純度98%)，乙醚(重慶川東化工集團(tuán)有限公司)，肝素鈉(北京索萊寶生物科技有限公司)，醫(yī)用膠布膠帶(青島海氏海諾集團(tuán)有限公司)，RUT-NGP(遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)實驗室自制，批號20210625，RUT粒徑(193.27±2.87)nm，RUT含量3.99 mg/cm2)，純水(實驗室自制)，甲醇、乙腈為色譜純(月旭科技(上海)股份有限公司)，其他試劑均為分析純。

1.3 實驗動物 健康雄性SD大鼠，體重180～220 g，購于遵義醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號SCXK(黔)2021-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 RUT含量測定方法的建立

2.1.1 對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取RUT對照品適量，置于50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理10 min，冷卻后加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得濃度為194.2 μg/mL的RUT對照品儲備液，臨用時配制成一系列濃度的對照品溶液。精密稱取色胺酮(Tryptanthrin，TRY)適量，置于50 mL量瓶中，加入甲醇適量，超聲使溶解，冷卻后加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，得205.6 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液，臨用時用甲醇稀釋至100 μg/mL作為內(nèi)標(biāo)溶液。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Ultimate? LP-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相水-乙腈(30∶70)；流速1.0 mL/min；檢測波長343 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積20 μL。

2.1.3 血漿樣品的處理和測定 大鼠眼眶取血置于經(jīng)過肝素鈉預(yù)處理過的1.5 mL EP管中，4 ℃冰箱放置2 h，取出后4 000 r/min離心15 min，取上層血漿，于-20℃冰箱中保存，備用。取大鼠血漿樣品100 μL，加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合1 min后，再加入乙腈800 μL(1∶8)，渦旋混合2 min，在12 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液，室溫下氮氣吹干，殘渣加乙腈100 μL，渦旋混合2 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液20 μL HPLC進(jìn)樣分析。

2.1.4 專屬性考察 按2.1.2項下的色譜條件對空白血漿、空白血漿+內(nèi)標(biāo)溶液、空白血漿+內(nèi)標(biāo)溶液+對照品溶液、大鼠給藥后血漿樣品進(jìn)行分析，見圖1。結(jié)果表明，空白血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)能與RUT、TRY色譜峰分開，且RUT與TRY分離完全，不干擾測定，說明建立的方法專屬性良好。

A:空白血漿；B:空白血漿+內(nèi)標(biāo)；C:空白血漿+內(nèi)標(biāo)+對照品；D:大鼠給藥后血漿樣品(1.色胺酮；2.吳茱萸次堿)。圖1 RUT-NGP神闕穴貼敷給藥后血漿樣品的HPLC圖譜

2.1.5 線性關(guān)系考察 取大鼠空白血漿樣品100 μL，分別加入不同系列濃度的RUT工作液10 μL和10 μL內(nèi)標(biāo)溶液，配成含RUT一系列濃度的溶液，按2.1.3項下血漿樣品的處理方法，2.1.2項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。最后以藥物(RUT)濃度為橫坐標(biāo)(X)，RUT與TRY的峰面積之比為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求得RUT的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1.477 1X+0.002 1(r=0.997 3)，線性范圍為0.010 4～1.942 0 μg/mL，最低定量限為0.010 4 μg/mL。

2.1.6 精密度和準(zhǔn)確度考察 精密吸取大鼠空白血漿100 μL，按2.1.3項下血漿樣品的處理方法，制備低、中、高質(zhì)量濃度的樣品，每個濃度制備6份平行樣品，連續(xù)測定3 d，按2.1.2項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品濃度，計算準(zhǔn)確度和精密度(見表1)。結(jié)果表明，RUT的批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度介于92.49%～103.18%之間，精密度RSD均<15%，說明該法精密度良好，符合生物樣品測定標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.7 穩(wěn)定性考察 精密吸取大鼠空白血漿100 μL，按2.1.3項下血漿樣品的方法處理，制備低、中、高質(zhì)量濃度的樣品，每個濃度制備6份平行樣品，考察樣品分別在室溫條件下存放24 h、-20℃循環(huán)凍融3次及-20℃冰箱存放7 d條件下的穩(wěn)定性，見表1。結(jié)果表明，穩(wěn)定性RSD均<15%，符合生物樣品測定標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.8 提取回收率考察 精密吸取大鼠空白血漿100 μL，分別加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液和RUT對照品溶液，按2.1.3項下血漿樣品的方法處理，制備低、中、高質(zhì)量濃度的樣品，每個濃度制備6份平行樣品，按2.1.2項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄內(nèi)標(biāo)和樣品峰面積，計算樣品濃度(A)。取大鼠空白血漿100 μL，加入甲醇20 μL，渦旋1 min后，加入800 μL乙腈，渦旋混勻2 min，以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清液并在室溫下氮氣吹干，加入乙腈80 μL于殘渣，再分別加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液和對照品溶液，配成含有RUT低、中、高質(zhì)量濃度的血漿樣品，每個濃度制備6份平行樣品，渦旋2 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積并計算樣品濃度(B)，提取回收率=A/B，見表1。結(jié)果表明RUT的提取回收率均>80%，RSD均<15%，符合生物樣品測定標(biāo)準(zhǔn)。

表1 RUT在血漿中的準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性和提取回收率試驗

2.2 藥代動力學(xué)試驗 雄性SD大鼠6只，給藥前12 h禁食，自由飲水，用電動剃毛刀除去大鼠腹部神闕穴及周圍的長毛，再用小剪刀剪凈剃毛區(qū)短毛。給藥前用溫水將大鼠腹部擦洗凈并用棉花將水分吸干，給藥時將貼膏1貼(給藥面積2 cm2)緊密貼敷于大鼠腹部神闕穴(大鼠腹部正中線上，在劍突和恥骨上聯(lián)合作一條連線，分為3等份，以上2/3和下1/3的交點作為神闕穴[15])，為防止大鼠中途因軀體扭動剮蹭將藥膏脫落，在大鼠神闕穴給藥處用一層紗布遮蓋，邊緣再用醫(yī)用膠帶加固，同時記錄給藥時間，于給藥后0.25、0.5、1、2、4、6、12、24、36、48、60、72 h從大鼠眼眶取血0.5 mL，置于1.5 mL預(yù)先用肝素鈉溶液潤濕的EP管中，于4 000 r/min離心10 min，分離得到血漿，按2.1.3項下的方法處理血漿，HPLC進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算大鼠體內(nèi)血藥濃度，將各個時間點為橫坐標(biāo)(X)，血藥濃度為縱坐標(biāo)(Y)，繪制血藥濃度-時間曲線圖(見圖2)。RUT血藥濃度數(shù)據(jù)采用PKSolver 2.0軟件的非房室模型進(jìn)行處理，擬合大鼠體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)(見表2)。

圖2 RUT-NGP經(jīng)大鼠神闕穴給藥后RUT的藥時曲線

表2 RUT-NGP經(jīng)大鼠神闕穴給藥后RUT的藥動學(xué)參數(shù)

3 討論

因加賦形劑調(diào)RUT粉末直接敷神闕穴給藥不方便，故將其制備成RUT-NGP，不僅方便攜帶和貯存，且相對耳穴、針灸、推拿等療法，穴位貼敷透皮吸收，作用直接、起效快、操作簡便，是較為理想的給藥途徑[16]。

本實驗建立了血漿中RUT的測定方法，結(jié)果表明，該測定方法的專屬性良好，血漿中的內(nèi)源物質(zhì)不干擾RUT的測定，樣品用量小，預(yù)處理簡便，適合大批量樣品分析測定。預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，在72 h后取樣的大鼠血樣中，RUT的濃度已接近所建立的HPLC方法線性范圍的最小值，故正式實驗時在72 h內(nèi)取樣。

RUT-NGP經(jīng)大鼠神闕穴貼敷給藥后，RUT可透皮吸收入血，隨著給藥時間的增加，RUT血藥濃度逐漸增加，直到約36 h后，RUT血藥濃度緩慢減少，說明RUT-NGP具有緩釋長效的給藥效果。與文獻(xiàn)[17]報道的吳茱萸巴布膏貼敷大鼠給藥后的藥動學(xué)行為比較，其Tmax為5.85 h，本研究的Tmax較其提高了6.6倍；與文獻(xiàn)[18]吳茱萸提取物的經(jīng)皮吸收藥動學(xué)研究比較，本研究的半衰期t1/2和Tmax分別較其提高了16.45倍和11.87倍。與文獻(xiàn)[19]大鼠口服不同濃度的吳茱萸提取物藥動學(xué)行為比較，本研究大鼠體內(nèi)血藥濃度平穩(wěn)，半衰期t1/2和Tmax明顯增加，可能與RUT納米化可改善其透皮吸收，提高RUT的生物利用度[13]有關(guān)，還可能是與RUT-NGP是經(jīng)大鼠神闕穴貼敷給藥，已有研究表明神闕穴經(jīng)皮吸收比非穴位經(jīng)皮吸收效果好[20]有關(guān)。

本文將RUT做成RUT-NGP經(jīng)大鼠神闕穴貼敷給藥后，有利于延長藥物的作用時間，減少給藥次數(shù)，能夠滿足某些疾病的治療需求，進(jìn)一步為RUT新劑型研發(fā)及臨床研究提供參考和依據(jù)。但RUT-NGP經(jīng)神闕穴貼敷給藥的體內(nèi)透皮吸收動力學(xué)的粒徑及給藥部位等影響規(guī)律尚不明確，有待進(jìn)一步開展RUT-NGP和RUT凝膠貼膏、神闕穴和非穴位貼敷給藥的藥動學(xué)行為比較研究進(jìn)行探討和確認(rèn)。