黃芪丹參對妊娠高血壓大鼠胎盤VEGF、TNF-α表達的影響

李 敏，田 穎，都 燕，潘銀平

(1.西北婦女兒童醫(yī)院 產(chǎn)科，陜西 西安 710000;2.延安大學(xué)附屬醫(yī)院 產(chǎn)科,陜西 延安 716000)

妊娠期高血壓疾病( Hypertension disorder complicating pregnangcy,HDCP)是妊娠過程中特有的疾病，主要的病理變化為血小管引發(fā)的全身性痙攣及身體里各個系統(tǒng)和器官的血流灌注減少，嚴(yán)重威脅母嬰健康，甚至威脅母嬰的生命[1]。妊娠高血壓疾病一般好發(fā)于妊娠20周孕婦，常見的體征為血壓升高和蛋白尿，嚴(yán)重者會導(dǎo)致孕婦發(fā)生胎盤卒中、早剝等并發(fā)癥[2-3]。丹參具有擴張冠狀動脈，抑制血小板聚集，改善微循環(huán)，增加組織供血供氧的作用。黃芪具有擴張血管，降低血壓，增加紅細(xì)胞的攜氧能力及抗自由基的作用。中醫(yī)認(rèn)為妊娠高血壓屬于“血瘀”范疇，丹參可活血化瘀，黃芪可益氣利水，二者聯(lián)合使用可達到益氣活血的效果。有研究顯示腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor α，TNF-α)和血管內(nèi)皮因子血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)在浸潤滋養(yǎng)細(xì)胞的同時，還有效的促進了胎盤的形成[4-5]。TNF-α在妊娠高血壓疾病的發(fā)生機制中作為一種重要的介質(zhì)而存在。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，TNF-α可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞從而產(chǎn)生前列腺素等，導(dǎo)致血管發(fā)生收縮，血壓升高，同時發(fā)現(xiàn)TNF-α可直接導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[6]。VEGF是一種對血管內(nèi)皮細(xì)胞有高效特異促有絲分裂因子，VEGF與其特異性受體結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能，對著床、胎盤血管形成有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF還能通過刺激滋養(yǎng)細(xì)胞MMP-9的活性，調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力，從而影響母體胎盤循環(huán)構(gòu)建。隨著對妊娠高血壓疾病發(fā)病機理的深入研究，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)全身血管內(nèi)皮細(xì)胞廣泛損傷、胎盤脫模部位血管發(fā)育不良是妊娠期高血壓疾病的基本病理改變，但血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷機理尚未完全闡明。有學(xué)者推測TNF-α和VEGF的異常表達與妊娠高血壓疾病的發(fā)生及發(fā)展有密切的關(guān)系所以本文采用黃芪丹參對妊娠高血壓大鼠進行干預(yù)治療，并對其胎盤中的VEGF和TNF水平的表達進行研究，為妊娠高血壓在臨床上的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗選用的30只雌性Wistar大鼠，SPF級，均是來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海實驗動物中心。大鼠體重在200～250 g之間，常溫下飼養(yǎng)大鼠，大鼠自由飲水?dāng)z食1周，讓所有大鼠對新的環(huán)境進行適應(yīng)。

1.2 試劑與儀器 本實驗所有試劑和儀器分別來自由湖南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院制備的黃芪丹參注射液，黃芪提取黃芪總皂甙、總黃酮；丹參提取丹參酮、丹參醌、丹參酚酸。全部經(jīng)過滅菌和過濾后，冷藏備用。美國Cell Signaling Technology公司生產(chǎn)的VEGF抗體；武漢博士德公司生產(chǎn)的TNF-α抗體；北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的APES、DAB試劑盒；美國Sigma公司生產(chǎn)的STZ、PDTC；成都泰盟有限公司生產(chǎn)的BP-600A型大鼠無創(chuàng)血壓測量儀；蘇凈安泰公司生產(chǎn)的超凈工作臺；0lympus日本生產(chǎn)的倒置光顯微鏡；瑞典Bromma公司生產(chǎn)的LKB—V型超薄切片機。

1.3 動物分組與模型建立 選用Wistar健康雌性成年大鼠32只，讓大鼠適應(yīng)1周新環(huán)境，測定大鼠血壓，剔除穩(wěn)定時尾壓>150 mmHg的大鼠，剩余30只大鼠的陰道脫落細(xì)胞做成涂片。用每天的陰道脫落細(xì)胞對大鼠的動情期進行確定，并且讓雌性大鼠和相同種系且均無高血壓的雄性Wistar大鼠進行合籠，大鼠1∶1進行交配，第2天對大鼠進行觀察，如果大鼠出現(xiàn)陰衰的情況，則認(rèn)為是妊娠0 d的大鼠，并且對大鼠的孕期認(rèn)真的進行標(biāo)記。將妊娠大鼠平均分為3組：空白對照組(NC組)、妊娠高血壓大鼠模型組(HDCP組)和妊娠高血壓大鼠模型加黃芪丹參治療組(HQ組)，每組10只。HDCP組和HQ組大鼠在妊娠第12天起皮下注射L-NAME，每日一次，注射量為125 mg(Kg.d)，NC組大鼠在妊娠第12天開始皮下注射生理鹽水，注射量同HDCP組和HQ組大鼠相同。3組大鼠均注射干預(yù)到妊娠第21天。分別于妊娠12、16、17、21 d時測量3組大鼠的動脈收縮壓和尿蛋白含量。以大鼠穩(wěn)定時尾壓>150 mmHg為造模成功。HQ組在妊娠第16天開始腹腔注射黃芪丹參注射液，1d注射1次，每次注射計量為250 mg/kg，連續(xù)注射至妊娠第18天。NC組和HDCP組大鼠均腹腔注射生理鹽水，給藥劑量和時間同HQ組大鼠相同。

1.4 標(biāo)本采集 在大鼠妊娠12 d時收集大鼠的24 h尿量，并對尿量進行檢測。在大鼠分娩前，分2次抽取大鼠尾部靜脈血2 mL并放置離心管中，把分離的血清置入-20℃的環(huán)境中保存?zhèn)溆?。?dāng)大鼠胎盤娩出后，取出胎盤中央位置沒有出現(xiàn)明顯出血的鈣化處的組織，切成1 cm3的塊狀，生理鹽水沖洗后固定，取上清液后，在-20℃的環(huán)境中保存待用。

1.5 血壓和24 h尿蛋白測量 在妊娠第12、16、17、21天，把所有大鼠放置在預(yù)熱箱內(nèi)，對大鼠預(yù)熱5 min，等到所有大鼠都平靜后，對大鼠的尾靜脈壓進行測量，連續(xù)重復(fù)10次，最后取所有結(jié)果的平均值。在妊娠第12天開始測量大鼠的尿液，測量期間所有大鼠禁食，但正常飲水，用BCA法測定，步驟嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。

1.6 胎盤組織形態(tài)學(xué)觀察 麻醉所有大鼠后并處死大鼠，打開大鼠腹部，把胎盤組織取出后固定，石蠟包埋后切片，石蠟切片的厚度為4 μm，脫蠟后進行HE染色并進行觀察。

1.7 測定血清中VEGF和TNF-α的含量 取3組大鼠離心后的血清，分別對大鼠血清中VEGF和TNF-α的含量進行測定。血清中VEGF的測定采用ELISA方法，經(jīng)全自動酶免儀測定；TNF-α含量采用放射免疫分析法進行測定，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)進行。

1.8 Western blot檢測大鼠胎盤組織中VEGF和TNF-α蛋白的表達 將3組大鼠的胎盤組織分別提取100 mg，將細(xì)胞進行裂解并提取核蛋白，并對核蛋白的濃度進行測量，分裝后，保存在零下20攝氏度的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液進行混均，按照4∶1的比例進行，為了讓蛋白質(zhì)變性需將蛋白溶液全部進行煮沸處置。電泳板孔內(nèi)注入蛋白樣品50 μg。轉(zhuǎn)至PVDF膜上后，把脫脂奶粉加入其中進行封閉，時常為1 h。根據(jù)Marker剪下相應(yīng)區(qū)域的PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉，室溫?fù)u床孵育2 h；將稀釋好的一抗BDNF、SYN分別加入，4℃環(huán)境孵育過夜；洗滌PVDF膜。分別將PVDF膜置二抗封閉液中，室溫?fù)u床下孵育1 h；再次洗滌PVDF膜。將PVDF膜在濾紙上控干，用ECL顯色試劑盒顯色；在UPVINC凝膠成像系統(tǒng)顯影，掃描膠片，并用Image J軟件測量各條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白與內(nèi)參灰度比值表示目的蛋白相對表達量。取出PVDF膜，TTBS漂洗10 min×3，DAB顯色后數(shù)碼相機照相。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠不同妊娠時間不同時間血壓情況 在妊娠第12天時，3組大鼠的血壓比較沒有明顯的差異；在妊娠第16、17、21天時，與NC組相比，HDCP組大鼠的血壓情況明顯上升(P<0.05)；HQ組大鼠的血壓情況明顯比HDCP組大鼠下降(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠妊娠不同時間血壓比較

2.2 3組大鼠不同時間24 h尿蛋白比較 在妊娠12天時，3組大鼠24 h尿蛋白的含量沒有明顯的差異(P>0.05)；在妊娠第16、17、21天時，HDCP組大鼠的尿蛋白含量顯著比NC組增多(P<0.05)；經(jīng)過黃芪丹參治療后HQ組大鼠的尿蛋白含量明顯降低(P<0.05，見表2)。

表2 3組大鼠不同時間24 h尿蛋白含量比較

2.3 3組大鼠胎盤組織形態(tài)比較 和NC組大鼠相比，HDCP組大鼠胎盤組織中的絨毛數(shù)量明顯減少，并且結(jié)構(gòu)出現(xiàn)萎縮，部分絨毛纖維素樣壞死，滋養(yǎng)層細(xì)胞代償性增值，出現(xiàn)較多空泡。HQ組較HDCP組絨毛纖維素樣程度減輕，胎盤絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞結(jié)節(jié)減少(見圖1)。

A：NC組；B：HDCP組；C：HQ組；×400。圖1 3組大鼠胎盤組織HE染色結(jié)果

2.4 3組大鼠血清中VEGF和TNF-α含量比較 和NC組大鼠血清中VEGF含量相比較，HDCP組顯著減少(P<0.05)；干預(yù)后的HQ組VEGF含量顯著多于HDCP組(P<0.05)。與NC組大鼠血清中TNF-α含量相比較，HDCP組顯著增多(P<0.05)，與HDCP組相比，HQ組血清中TNF-α含量顯著降低(P<0.05，見表3)。

表3 3組大鼠血清中VEGF含量和TNF-α含量比較

2.5 大鼠胎盤組織中VEGF和TNF-α蛋白水平 與NC組相比較，HDCP組中VEGF蛋白明顯減少，TNF-α蛋白的表達明顯增加(P<0.05)；與HDCP組相比較，經(jīng)過黃芪丹參治療后的HQ組大鼠中VEGF蛋白的表達顯著增加，TNF-α蛋白的表達明顯減少(P<0.05，見圖2、3)。

圖2 各組大鼠胎盤組織中VEGF、TNF-α蛋白表達

A:3組大鼠VEGF蛋白比較；B:與3組大鼠TNF-α蛋白比較；*：與NC組比較，P<0.05；#:與HDCP組比較,P<0.05。圖3 3組大鼠VEGF和TNF-α的蛋白比較

3 討論

妊娠高血壓疾病包括子癇前期、子癇和妊娠高血壓等，是一種妊娠其特有的疾病，多數(shù)病理在妊娠終止時，妊娠高血壓特有的病理改變會隨之出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，由此推測胎盤在妊娠高血壓疾病的過程中起重要作用[7]。通常認(rèn)為在胎盤形成的早期，滋養(yǎng)細(xì)胞對子宮內(nèi)膜浸入過淺，而子宮螺旋小動脈重塑數(shù)量減少和重塑障礙，造成胎盤組織缺血缺氧，滋養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生大量“毒性因子”浸入母體血液循環(huán)，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致妊娠高血壓疾病的發(fā)生[8-9]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)不僅能促進血管內(nèi)皮因子的生長，還能對血管的結(jié)構(gòu)和功能進行有效的維持[10]。有學(xué)者研究表明，VEGF的異常表達很可能是導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙的原因之一，也是妊娠期血壓升高主要原因[11]。研究也證實，HDCP患者血管內(nèi)皮的損傷和腫瘤壞死因子(TNF-α)有關(guān)[12]。有研究證明血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與TNF-α含量的變化呈正相關(guān)，提示TNF-α可能是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要毒性因子之一[13]。目前為止，在臨床上對妊娠高血壓疾病的治療，通常都采用硫酸鎂注射液進行，并且治療時一般的聯(lián)合降壓的藥物，但這種治療方法都是針對癥狀來進行的，不僅會產(chǎn)生大量的不良反應(yīng)，而且有時候的治療效果并不是十分理想，如果孕婦長期使用硫酸鎂治療，不僅會威脅母體的健康，對胎兒的健康也造成嚴(yán)重的威脅。所以，研究更多治療妊娠高血壓疾病的藥物，對目前的醫(yī)學(xué)工作者來說是最為重要的研究課題。

本文采用黃芪丹參對妊娠高血壓大鼠進行干預(yù)治療，并分析其對胎盤組織中VEGF和TNF-α表達的影響。發(fā)現(xiàn)和NC組大鼠相比，HDCP組大鼠的血壓情況和尿蛋白含量都明顯升高；通過給予黃芪丹參進行干預(yù)治療后，與HDCP組大鼠相比HQ組大鼠的血壓和24 h尿蛋白濃度都明顯降低。HE染色發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，HDCP組胎盤中絨毛的數(shù)量明顯減少，組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)萎縮，部分的絨毛出現(xiàn)纖維素樣壞死，滋養(yǎng)層細(xì)胞代償性增值。HQ組較HDCP組絨毛纖維素樣程度減輕，胎盤絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞結(jié)節(jié)減少。提示，黃芪丹參對妊娠高血壓有明顯的治療作用。在臨床上對心腦血管的治療中，黃芪丹參注射液是最常用的制劑之一，丹參酮是組成丹參的主要成分，可有效改善微循環(huán)，同時還對組織的供血供養(yǎng)有一定的增加作用[14]。黃芪注射液主要是由黃芪粉調(diào)制而成，不僅能擴張血管，還能讓血壓抑制腎素明顯降低，讓血液流變性得到改善的同時，讓紅細(xì)胞攜氧能力增加[15]。在中醫(yī)學(xué)中，妊娠高血壓被歸屬為血瘀范圍，丹參能活血的同時對化瘀還有明顯的成效；黃芪對益氣利水有顯著成效，把二者聯(lián)合使用的效果更為顯著。

VEGF不僅對血管的生成有一定的促進作用，還能讓血管的通透性有效的增加，同時對內(nèi)膜的完整性有一定的維持作用，而且對滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤和分化都起著十分重要的作用[16]。本文研究結(jié)果顯示和NC組大鼠相比，HDCP組大鼠血清中VEGF含量和胎盤中的VEGF蛋白明顯減少。VEGF水平的降低可能與其受體的變化有關(guān)，還可能與胎盤中內(nèi)皮細(xì)胞、滋養(yǎng)細(xì)胞合成、分泌的VEGF蛋白減少有關(guān)[17]。TNF是由激活的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種多肽，妊高征時由于免疫失衡及缺氧，導(dǎo)致細(xì)胞毒性因子TNF分泌大量增加，引起脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致血管內(nèi)皮嚴(yán)重?fù)p傷[18]。異常的TNF-α使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高而損傷內(nèi)皮細(xì)胞，讓組織發(fā)生損傷，血管活性物質(zhì)的釋放因此而增加，從而對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和損傷后的修復(fù)能有效的抑制。本文研究發(fā)現(xiàn)，HDCP組大鼠血清中TNF-α含量和胎盤中的TNF-α蛋白表達明顯高于NC組。經(jīng)過黃芪丹參注射液干預(yù)治療后發(fā)現(xiàn)，HQ組大鼠血清VEGF含量和胎盤中VEGF蛋白明顯增多，并且血清中TNF-α含量和TNF-α蛋白表達顯著低于HDCP組?？梢娨砸鏆饣隽⒎ǖ狞S芪丹參有效成分組成的復(fù)方，通過促進血管內(nèi)皮生長因子VEGF蛋白的活性，從而抑制腫瘤壞死因子TNF-α蛋白的表達，以此來達到防治妊娠高血壓的目的。郭永平等[19]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪丹參注射液舒張血管、降低外周阻力、改善胎盤循環(huán)的作用可能是通過抑制TNF-α、促進內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO而實現(xiàn)的。王靜等[20]研究證實，在妊娠高血壓疾病中，VEGF、TNF-α?xí)ㄟ^一氧化氮的合成在妊娠高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

綜上所述，黃芪丹參注射液能促進胎盤組織中VEGF的表達，同時抑制TNF-α的表達，從而對妊娠高血壓起到一定的治療作用。