miRNA-34a-5p,SIRT6在不同月齡小鼠耳蝸中的表達(dá)及意義

蘇琳凌，王世飛，謝天宏，饒 澄，龍依琳，李 歡

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科，貴州 遵義 563099)

老年性耳聾(Age-related hearing loss,AHL)是指因年齡的增長而出現(xiàn)聽力減退的生理現(xiàn)象[1]，典型臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性、雙耳對稱性的聽力下降，往往伴有言語理解能力的明顯下降。目前AHL 的致病因素較復(fù)雜，近年來國內(nèi)外相關(guān)研究多提示炎癥、線粒體突變、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等多種途徑都參與了老年性耳聾的發(fā)生發(fā)展，且mtDNA的突變或缺失是AHL發(fā)生的根本原因。 SIRT6 是Sirtuin (沉默信息調(diào)節(jié)因子 )蛋白家族中的第四類成員，可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞核中廣泛表達(dá)，并自發(fā)地催化自身 ADP-核糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，調(diào)控包括衰老在內(nèi)的眾多生命過程，可通過調(diào)控 DNA 雙鏈損傷修復(fù)來延緩細(xì)胞衰老過程，從而延長壽命，是一個(gè)理想的“衰老抑制因子”。miRNA-34a是一種較為保守的miRNA，通常作為癌癥的生物標(biāo)記物，其介導(dǎo)癌癥細(xì)胞多與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等相關(guān)[2]，miRNA微陣列結(jié)果顯示，哺乳動(dòng)物體內(nèi)，隨著年齡的增加，miRNA-34a表達(dá)水平也隨之上升，但作用機(jī)制尚不明確[3]。現(xiàn)國內(nèi)外多數(shù)研究者發(fā)現(xiàn)miRNA-34a、SIRT6在其他組織器官細(xì)胞凋亡中的作用呈負(fù)相關(guān)[4]，但在老年性耳聾發(fā)病機(jī)制中的作用罕見報(bào)道。本研究擬分別檢測C57BL/6小鼠4個(gè)生長發(fā)育時(shí)間點(diǎn)( 3、6、12 和 16 月齡)及D-半乳糖造模小鼠耳蝸組織中miRNA-34a-5p(從miRNA-34a前體的5’端臂加工而來)、SIRT6表達(dá)的增齡性變化特點(diǎn)，探討兩者在AHL發(fā)生發(fā)展中的相互作用及意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取不同年齡段無耳疾C57BL /6雄性小鼠24只，體重30～40 g，按不同年齡分為:3月齡組6只，6月齡組6只，12月齡組6只，16月齡組6只，選取10只2月齡SPF級C57BL/6小鼠，體重均為15～25 g。上述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由上海靈暢生物科技有限公司提供，于本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心低噪音環(huán)境下常規(guī)飼養(yǎng)，室溫21～23℃，相對濕度40%～60%，室內(nèi) 12 h 明暗自動(dòng)切換，通風(fēng)良好。動(dòng)物購買回來后，分別放入籠中飼養(yǎng)，自由攝食與進(jìn)水。按照《遵義醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)條例》，嚴(yán)格規(guī)范飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過程。

1.2 儀器與試劑 顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)；顯微手術(shù)器械( 淮北軟隆生物科技有限公司，中國)；多功能熒光酶標(biāo)儀( SANYO 公司，日本)；SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(大連TaKaRa有限公司，中國)；KitTakara-PrimeScriptTM RT試劑盒(大連TaKaRa有限公司，中國)；RNAiso Plus(大連TaKaRa有限公司，中國)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(賽默飛公司，美國)；戊巴比妥鈉規(guī)格：25 g/瓶(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司，中國)；D-半乳糖(D-gal)；規(guī)格：100 g/ 瓶(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，中國)。

1.3 D-半乳糖衰老小鼠動(dòng)物模型制作 選取2月齡SPF級C57BL/6小鼠10只，每日頸背部皮下注射D-半乳糖150 mg/kg，連續(xù)6周。實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食飲水、節(jié)律光照，隨機(jī)選取6只小鼠用于后續(xù)研究。

1.4 耳蝸標(biāo)本預(yù)處理 取各組小鼠，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，注射參照劑量為50 mg/kg。在顯微鏡下，將小鼠固定于腦立體定位儀(根據(jù)Paxinos和富蘭克林的立體定位坐標(biāo)系中的老鼠大腦[2012])，斷頭處死小鼠后迅速取出雙側(cè)聽泡，并分別將耳蝸進(jìn)行分離，用等滲生理鹽水沖洗耳蝸樣本組織，并置入-80℃液氮中進(jìn)行保存。一只用于測定miRNA-34a-5p表達(dá)，另一只用于測定SIRT6表達(dá)。

1.5 miRNA-34a-5p熒光定量PCR檢測 取各組耳蝸組織于1.5 mL離心管中，每50～100 mg組織加1mL TRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不超過TRIzol體積的10%。Trizol 法提取總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，產(chǎn)物用于qRT-PCR 擴(kuò)增。70℃ 預(yù)變性 5 min，42℃ 退火 15 min，4℃ 延伸 5 min 反轉(zhuǎn)錄形成 cDNA，擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參。qRT-PCR 反應(yīng)條件:95℃ 預(yù)變性 30 s， 95℃變性 5 s，60℃ 退火 30 s，循環(huán) 40 次,再95℃變性 15 s，60℃ 退火 30 s 。目的基因引物序列如表1所示。

表1 miRNA-34a-5p 和參照基因引物序列

1.6 SIRT6熒光定量PCR檢測 取各組耳蝸組織于1.5 mL離心管中，每50～100 mg組織加1 mL TRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不超過TRIzol體積的10%。Trizol 法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，產(chǎn)物用于qRT-PCR 擴(kuò)增。70℃ 預(yù)變性 5 min，42℃ 退火 15 min，4℃ 延伸 5 min反轉(zhuǎn)錄形成 cDNA，擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參。qRT-PCR 反應(yīng)條件:95℃ 預(yù)變性 30 s， 95℃變性 5 s，60℃ 退火 30 s，循環(huán) 40 次,再95℃變性 15 s，60℃ 退火 30 s 。所有數(shù)據(jù)均使用 2-△△CT方法進(jìn)行處理，目的基因引物序列如表 2 所示。

表2 SIRT6和參照基因引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Graphad Prism 6.01 軟件繪制圖表。組間比較應(yīng)用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠耳蝸中miRNA-34a-5p 表達(dá) 3、6、12、16月齡的C57BL/6 小鼠的耳蝸段miRNA-34a-5p表達(dá)水平依次增加，兩兩間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 。其中D-半乳糖造模組與3、6月齡相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ；與12、16月齡組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖1)。

***:P<0.001。圖1 miRNA-34a-5p 表達(dá)水平

2.2 各組小鼠耳蝸中SIRT6的表達(dá) 3、6、12、16月齡C57BL/6小鼠的耳蝸段SIRT6表達(dá)水平依次降低，兩兩間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中D-半乳糖造模組與3、6、12月齡相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ,D-半乳糖造模組與16月齡組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖2)。

***:P<0.001。圖2 SIRT6表達(dá)水平

經(jīng) Pearson相關(guān)性分析，耳蝸中段 miRNA-34a-5p 表達(dá)與SIRT6 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.591，P﹤0.05) 。

3 討論

目前老年性耳聾的致病機(jī)制復(fù)雜，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不明確，國內(nèi)外近年來研究提示AHL的發(fā)生發(fā)展包含了多種途徑，如DNA損傷應(yīng)答的改變、線粒體功能障礙、炎癥以及基因調(diào)控的變化等[5]；寧云紅等[6]報(bào)道也提示老年性耳聾發(fā)生的根本原因與線粒體DNA(mtDNA)的突變或者缺失相關(guān)；研究顯示，耳蝸細(xì)胞凋亡與線粒體DNA缺失或者基因突變的積累有關(guān)；耳蝸毛細(xì)胞中的線粒體DNA、細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)會(huì)因活性氧(ROS)的積累而被破壞，從而導(dǎo)致慢性炎癥的發(fā)生[7]。自由基穩(wěn)態(tài)失衡致內(nèi)耳損傷、細(xì)胞凋亡以及糖原蓄積致聽覺器官功能喪失也與AHL的發(fā)病機(jī)制相關(guān)；但現(xiàn)有的研究方向多限于對其某方面的因素，對綜合因素的研究甚少。由此可見，尋找上述各種途徑的交叉點(diǎn)，可能是AHL發(fā)病機(jī)制研究的關(guān)鍵，也可能是其治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

沉默信息調(diào)節(jié)因子(Silent information regulator，Sirtuin)是一類NAD + 依賴的組蛋白去乙酰化酶，Sirtuin 6(SIRT6)則屬于其中一員，具有多種底物和催化活性，可介導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡途徑從而抑制細(xì)胞凋亡[8]；同時(shí)SIRT6參與細(xì)胞衰老各個(gè)相關(guān)機(jī)制的調(diào)控，在細(xì)胞凋亡、免疫和細(xì)胞衰老等生理過程中，核轉(zhuǎn)錄因子kB( Nuclear factor kB，NF-kB) 信號通路有著重要的作用，研究表明BZBS可能通過激活Sirt6/NRF2/HO-1和Sirt6/P53-PGC-1α-TERT信號通路來保護(hù)快速衰老小鼠的氧化還原穩(wěn)態(tài)和端粒完整性，抑制細(xì)胞凋亡來減輕早衰[9]；有報(bào)道對129例有長壽家族史的居民和86例無長壽家族史的個(gè)體進(jìn)行了病例對照研究，確定低水平的SIRT6甲基化可能是中國人長壽的潛在保護(hù)因素[10]。SIRT6具有去乙酰化酶活性，同時(shí)能通過催化自身 ADP-核糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)獲得核糖基轉(zhuǎn)移酶活性[11]；在DNA損傷早期，SIRT6可多途徑提高DNA雙鏈損傷 (Double-strand break，DSB)修復(fù)能力，招募SNF2H(一種atp依賴的染色質(zhì)重塑)到DNA雙鏈斷裂點(diǎn)，進(jìn)行DNA的損傷修復(fù)[12]。總之SIRT6參與復(fù)制性衰老及多種衰老過程，主要通過調(diào)控衰老相關(guān)基因、維持基因組穩(wěn)定性實(shí)現(xiàn)。針對AHL相關(guān)的進(jìn)展機(jī)制，可假設(shè)SIRT6對AHL的進(jìn)展應(yīng)具有調(diào)控作用，本研究發(fā)現(xiàn)在不同月齡C57BL/6小鼠及D-半乳糖造模小鼠耳蝸中，SIRT6的表達(dá)水平在月齡組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示SIRT6參與了老年性耳聾發(fā)展的調(diào)控；而16月齡小鼠與D-半乳糖造模小鼠組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),同時(shí)隨著年齡增長，SIRT6表達(dá)水平降低，這進(jìn)一步提示SIRT6可能抑制及延緩老年性耳聾的發(fā)展。

miRNA是一類普遍存在于真核生物中非編碼單鏈小分子RNA，長約21～25個(gè)核苷酸，在基因轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮重要調(diào)控功能[13]。與細(xì)胞衰老相關(guān)的機(jī)制如線粒體突變、氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡等，幾乎都與 miRNA 相關(guān)[14]，對miRNA 功能的進(jìn)一步研究有益于多種疾病機(jī)制的研究與診療。miRNA-34a可通過介導(dǎo)腦組織中的細(xì)胞凋亡因子干預(yù)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后生物過程，在大腦中的作用和活性受控制其表達(dá)(例如 Tp53/73)及其下游靶基因(例如SIRT1和SIRT6)和信號傳導(dǎo)途徑(例如Notch途徑)所調(diào)控[15]；Huang 等[16]研究miRNA-34a/Bcl-2 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在AHL的作用，結(jié)果表明 miRNA-34a 的過表達(dá)可以抑制Bcl-2 表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)毛細(xì)胞的凋亡；相反，抑制 miRNA-34a 的表達(dá)可以減緩毛細(xì)胞凋亡。Thounaojam等[17]研究發(fā)現(xiàn),用miR-34a抑制劑(IB)轉(zhuǎn)染細(xì)胞可阻止HG誘導(dǎo)的線粒體功能障礙和衰老相關(guān)標(biāo)志物的上調(diào)，而miR-34a模擬物可促進(jìn)細(xì)胞衰老和線粒體功能障礙；這些都進(jìn)一步證實(shí)miRNA-34a 可促進(jìn)細(xì)胞衰老。本研究結(jié)果表明，隨著月齡增長，小鼠耳蝸 miRNA-34a-5p表達(dá)水平隨著年齡增加而增加，兩兩間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 。其中D-半乳糖造模組與3、6月齡相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ；與12、16月齡組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在老年性耳聾發(fā)病機(jī)制中，SIRT6 、miRNA-34a的作用罕見報(bào)道。本研究對miRNA-34a組與SIRT6在不同月齡C57BL/6小鼠及D-半乳糖造模小鼠耳蝸表達(dá)相關(guān)性研究表明，隨著月齡增長， C57BL/6小鼠耳蝸中 miRNA-34a 水平升高、SIRT6水平降低，說明miRNA-34a促進(jìn)老年性耳聾病理進(jìn)程的發(fā)展,SIRT6為老年性耳聾發(fā)展進(jìn)程中的保護(hù)因子，兩者呈負(fù)相關(guān)，miRNA-34a與 SIRT6可能是治療老年性聾的新靶點(diǎn)。其作用方式可能與DNA損傷修復(fù)、線粒體功能障礙等相關(guān)，如SIRT6可能通過調(diào)控miRNA-34a的表達(dá)，降低ROS的細(xì)胞內(nèi)累積效應(yīng)，同時(shí)修復(fù)損傷的mtDNA，從而起到抗衰老作用。但兩者間具體的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)行深入研究。