C5orf66-AS1對直腸癌細胞增殖、侵襲及Wnt/β-catenin通路的影響

谷敬鋒，劉海霞，王桂琦，張 建，邢東洋，馬建偉

(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院 外科,河北 石家莊 050011)

直腸癌是一種強侵襲性且發(fā)于腸道的惡性腫瘤，在全球所有類型的癌癥中，發(fā)病率居第三，死亡率居第二[1]。在我國，預計每年在結(jié)腸癌和直腸癌新發(fā)現(xiàn)的病例超過38萬[2]。因此，尋找治療直腸癌的新策略具有重要意義。長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNAs，lncRNAs)是一類特殊的RNA分子，其長度超過200個核苷酸，但其并無蛋白編碼的能力。lncRNAs作為多種疾病的表觀遺傳調(diào)控因子，廣泛參與了多種生物學過程[3]，如介導DNA與蛋白質(zhì)的相互作用、吸附microRNAs以及作為誘餌與蛋白質(zhì)結(jié)合等[4-6]。越來越多的證據(jù)表明，正如癌基因影響患者的預后一樣[7]，一些lncRNAs也影響癌細胞的發(fā)生發(fā)展，提示lncRNAs可能成為靶向治療直腸癌的新途徑[8]。文獻報道，lncRNA C5orf66-AS1在胃癌[9]、宮頸癌[10]以及口腔鱗癌[11]等多種腫瘤細胞中異常表達，可參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移等多個生物學過程。本研究通過檢測C5orf66-AS1在不同直腸癌細胞株中的表達以及siRNA干擾抑制C5orf66-AS1的表達后觀察直腸癌細胞的增殖、凋亡及侵襲過程，并初步探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 直腸癌細胞株SW837、SW1463、HR-8348、COLO741及人正常直腸粘膜上皮細胞(ATCC-0034)均購自美國ATCC中心；胎牛血清、DEME培養(yǎng)基以及0.25%胰蛋白酶購自北京百克賽斯；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；RNA提取試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒均購自北京天根公司；CCK-8細胞增殖試劑盒和Annexin V-FITC/PI試劑盒均購自日本DOJINDO公司；Transwell小室(24孔，孔徑8μm)購自美國CONRING公司；基質(zhì)膠購自美國BD Biocoat公司；一抗β-catenin、PCNA、Vimentin、Caspase-3及GAPDH均購自英國Abcam公司；細胞培養(yǎng)箱、酶標儀及流式細胞儀均購自美國Thermo Scientific(型號：BB150-2TCS、MK3、Life Attune)；熒光定量PCR儀、凝膠成像儀均購自美國BIO-RAD(型號：CFX96、Gel Doc EZ)；倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司(型號：IX71)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 直腸癌細胞株SW837、SW1463、HR-8348、COLO741及人正常直腸粘膜上皮細胞采用DEME培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞繁殖達到培養(yǎng)瓶的90%以上，以1∶3的比例傳代培養(yǎng)，細胞傳代培養(yǎng)大于2次，選取生長狀態(tài)良好且無污染的細胞用于后續(xù)實驗研究。

1.2.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測不同細胞中C5orf66-AS1表達 收集培養(yǎng)的SW837、SW1463、HR-8348、COLO741細胞和人正常直腸粘膜上皮細胞，按照RNA提取試劑盒方法提取不同細胞的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，最后對cDNA樣品進行qRT-PCR檢測，qRT-PCR程序為：95℃5 min；94℃30 s，53℃ 30 s，72℃ 2min，38個循環(huán)。采用2-ΔΔCt計算C5orf66-AS1的相對表達量。

引物序列：C5orf66-AS1-F為5′-CGGGATCAACCCTCTGCTTT-3′，C5orf66-AS1-R為5′-TTCTTGAGAAGCGACTGCGT-3′；GAPDH-F為5′-TGAC-TTCAACAGCGACACCCA-3′，GAPDH-R為5′-TG-AGCGATGTGGCTCGGCT-3′。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染及分組 根據(jù)NCBI中GeneBank中提供的C5orf66-AS1基因的核苷酸序列由上海吉瑪公司設(shè)計并合成沉默C5orf66-AS1的引物。

選擇對數(shù)期生長的SW837細胞接種在6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞生長達到培養(yǎng)瓶的80%以上時，將細胞分為5組，依次為正常對照組(未被轉(zhuǎn)染)、陰性對照組、siRNA沉默C5orf66-AS1-1、-2、-3組，依次作為NC組、si-NC組、si-C5orf66-AS1-1組、si-C5orf66-AS1-2組、si-C5orf66-AS1-3組。按照LipofectamineTM2000說明書操作方法，正常對照組不轉(zhuǎn)染，其他4組分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-C5orf66-AS1-1、si-C5orf66-AS1-2、si-C5orf66-AS1-3。轉(zhuǎn)染后各組細胞先在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～8 h，后更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進行后續(xù)實驗。qRT-PCR驗證C5orf66-AS1的沉默效率，具體操作方法參考1.2.2。

1.2.4 CCK-8檢測SW837細胞增殖活性 將處于對數(shù)期生長的SW837細胞，添加胰蛋白酶消化，后接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，細胞培養(yǎng)過夜后瞬時轉(zhuǎn)染(分別不轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染si-NC、轉(zhuǎn)染si-C5orf66-AS1-3)，分別在24、48、72 h后消化終止培養(yǎng)，加入CCK-8溶液在37℃培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，最后采用酶標儀測定各孔細胞在450 nm波長處的吸光度值(A)，以A值表示各組細胞的增殖活性。

1.2.5 流式細胞儀檢測SW837細胞的凋亡率 收集轉(zhuǎn)染后的各組SW837細胞，先使用PBS漂洗3次，后添加Binding Buffer(100 μL)制備懸浮液，依次添加5 μL AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)溶液，室溫黑暗孵育20 min，最后通過流式細胞儀檢測SW837細胞的凋亡率。

1.2.6 Transwell法檢測SW837細胞的侵襲能力 在實驗開始前先使用無血清的培養(yǎng)基稀釋Metrigel基質(zhì)膠，后加入到Transwell上室并干燥備用。收集各組SW837細胞，制備形成懸浮液后添加至Transwell上室(含干燥Metrigel基質(zhì)膠)，下室中加入正常培養(yǎng)基(含血清)作為誘導劑，正常培養(yǎng)48 h后，用棉簽輕輕去除上室殘留的細胞后添加95%甲醇固定細胞20 min，使用PBS清洗3遍后用棉簽吸干，添加0.5%結(jié)晶紫染色，在倒置顯微鏡中拍照并觀察穿膜的細胞數(shù)，圖像放大200倍。

1.2.7 Western blot實驗檢測SW837細胞中β-catenin、PCNA、Vimentin、Caspase-3蛋白表達 收集轉(zhuǎn)染后的各組細胞，添加適當?shù)腞IPA裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA法檢測樣品蛋白的濃度及質(zhì)量。取適量的蛋白樣品添加緩沖液變性后，每孔點樣25 μL，蛋白膠分離蛋白，隨后通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉封閉后，添加一抗(β-catenin、PCNA、Vimentin、Caspase-3以及內(nèi)參GAPDH)于搖床中4℃孵育過夜，隔天添加預冷的PBS沖洗3次后，添加提前稀釋(1∶5 000)的二抗室溫搖床孵育2 h，再用PBS沖洗3次，添加ECL化學發(fā)光混合液，于凝膠成像儀中觀察拍照。使用Image J軟件計算各蛋白的灰度值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 C5orf66-AS1在直腸癌細胞株中的表達 將人正常直腸粘膜上皮細胞作為對照細胞，qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，C5orf66-AS1 mRNA表達水平在直腸癌細胞SW837、SW1463、HR-8348、COLO741中(3.72±0.11、2.36±0.24、2.45±0.19、1.96±0.13)的表達水平顯著高于人正常直腸粘膜上皮細胞(1.01±0.05，F(xiàn)=228.966，P<0.05)，其中在SW837中表達水平最高，故后續(xù)研究以SW837細胞為直腸癌細胞載體。

2.2 C5orf66-AS1沉默效率檢測 分別使用si-C5orf66-AS1-1、si-C5orf66-AS1-2、si-C5orf66-AS1-3侵染SW837細胞，si-C5orf66-AS1-1、si-C5orf66-AS1-2、si-C5orf66-AS1-3組C5orf66-AS1相對表達水平(0.68±0.10、0.43±0.05、0.19±0.02)顯著低于NC組和si-NC組(0.98±0.13和1.05±0.16，F(xiàn)=71.551，P<0.05)，NC組和si-NC組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。其中si-C5orf66-AS1-3組細胞中C5orf66-AS1表達最低，故其沉默效率最高，后續(xù)將以此組細胞繼續(xù)進行后續(xù)實驗。

2.3 沉默C5orf66-AS1對SW837增殖活性的影響 CCK-8結(jié)果顯示(見表1)，在SW837細胞培養(yǎng)24～72 h內(nèi)，si-NC組與NC組細胞增殖活性無明顯差異(P>0.05)；SW837細胞培養(yǎng)24 h時，與si-NC組相比，si-C5orf66-AS1-3組細胞增殖活性無明顯差異(P>0.05)，而在細胞培養(yǎng)48、72 h時，si-C5orf66-AS1-3組SW837細胞增殖活性明顯降低(P<0.05)。

表1 沉默C5orf66-AS1對SW837細胞增殖活性的影響(A值，

在NC組和si-NC組中，在SW837細胞培養(yǎng)24～72 h內(nèi)，細胞增殖活力隨著培養(yǎng)時間的延長而增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在si-C5orf 66-AS1-3組中，SW837細胞培養(yǎng)48 h后細胞增殖活力明顯高于24 h(P<0.05)，而72 h與48 h細胞增殖活力則無明顯變化(P>0.05)。故后續(xù)實驗培養(yǎng)細胞均培養(yǎng)48 h。

2.4 沉默C5orf66-AS1對SW837細胞凋亡率的影響 流式細胞儀結(jié)果顯示(見圖1)，3組間SW837細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(F=16.581，P<0.05)，其中NC組SW837細胞凋亡率與si-NC組無明顯差異[(6.34±1.06)%比(7.05±1.14)%，P>0.05]；而si-C5orf66-AS1-3組SW837細胞凋亡率顯著高于si-NC組[(18.45±2.94)%比(7.05±1.14)%，P<0.05]。

A：NC組；B：si-NC組；C：si-C5orf66-AS1-3組。圖1 流式細胞儀檢測SW837細胞的凋亡率

2.5 沉默C5orf66-AS1對SW837細胞侵襲的影響 Transwell小室結(jié)果顯示(見圖2)，3組間SW837細胞侵襲數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(F=314.119，P<0.05)，其中與si-NC組相比，NC組穿膜細胞數(shù)無明顯差異(204.51±8.53比196.56±7.39，P>0.05)；而si-C5orf66-AS1-3組細胞穿膜數(shù)顯著降低(114.34±3.93比196.56±7.39，P<0.05)。

A：NC組；B：si-NC組；C：si-C5orf66-AS1-3組。圖2 倒置顯微鏡下觀察SW837細胞侵襲情況(結(jié)晶紫染色，200×)

2.6 沉默C5orf66-AS1對Wnt/β-catenin信號通路的影響 Western blot檢測發(fā)現(xiàn)(見表2、圖3)，3組間SW837細胞中β-catenin、PCNA、Caspase-3和Vimentin蛋白相對表達量差異有統(tǒng)計學意義(F=18.395、20.513、13.089、22.450，P<0.05)，其中與si-NC組相比，NC組SW837細胞中β-catenin、PCNA、Caspase-3和Vimentin蛋白相對表達量無明顯差異(P>0.05)；而si-C5orf66-AS1-3組SW837細胞中β-catenin、PCNA和Vimentin蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，Caspase-3蛋白表達量顯著增高(P<0.05)。

圖3 各組SW837細胞中β-catenin、PCNA、Caspase-3和Vimentin蛋白相對表達量

表2 沉默C5orf66-AS1對SW837細胞中β-catenin、PCNA、Caspase-3和Vimentin蛋白表達的影響

3 討論

直腸癌是一種消化道常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率逐年增高，因其確診時即為中晚期，嚴重影響人類健康[12]。已有研究表明，癌基因和抑癌基因的失調(diào)是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素[13]。已有研究報道lncRNAs具有復雜的生物學功能，能夠調(diào)節(jié)多種疾病的進展，與腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14]。目前有大量功能未知的lncRNAs尚待研究。雖然全基因組研究lncRNAs是揭示更多可能參與癌變或可能代表潛在治療靶點的lncRNAs的好方法，但對各種研究結(jié)果進行直接比較仍然具有挑戰(zhàn)性[11]。

Guo等[15]研究報道，C5orf66-AS1在食管鱗狀細胞癌細胞中表達顯著上調(diào)，增殖相關(guān)基因Ki-67和PCNA及EMT相關(guān)基因N-cadherin和Vimentin蛋白表達下調(diào)，參與侵襲轉(zhuǎn)移途徑的E-cadherin表達上調(diào)，提示C5orf66-AS1能抑制食管癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Lu等[11]報道顯示，在口腔鱗癌細胞中，C5orf66-AS1顯著下調(diào)，C5orf66-AS1的過表達能夠通過調(diào)控CYC1表達進而抑制口腔鱗癌細胞生長、轉(zhuǎn)移和侵襲過程來抑制口腔鱗癌發(fā)展。Rui等[10]研究發(fā)現(xiàn)，C5orf66-AS1可通過與RING1和miR-637競爭，進而促進宮頸癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制宮頸癌細胞的凋亡，從而作為原癌基因促進宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。本研究通過檢測C5orf66-AS1在不同直腸癌細胞系中的表達水平，發(fā)現(xiàn)C5orf66-AS1在直腸癌細胞系中水平顯著上調(diào)，且在SW837細胞中最高。說明C5orf66-AS1在直腸癌細胞中屬于癌基因。此外，已有研究報道發(fā)現(xiàn)，C5orf66-AS1在直腸癌組織中的表達低于癌旁正常組織[16]。本研究結(jié)果與其相反，推測可能是本研究所使用的分離直腸癌細胞株的組織來源與已有研究中所選取的患者組織部位、患病程度等存在差異性，表明C5orf66-AS1可能在不同的組織部位，不同患病程度中發(fā)揮不同的作用。

為了更進一步的研究C5orf66-AS1在直腸癌細胞中的作用，本研究通過使用siRNA干擾技術(shù)沉默C5orf66-AS1，通過檢測干擾效率，選擇干擾效率最高的si-C5orf66-AS1-3組作為后續(xù)沉默C5orf66-AS1表達組。通過進一步檢測SW837細胞的增殖活性、凋亡率以及侵襲能力發(fā)現(xiàn)，沉默C5orf66-AS1可顯著降低細胞的增殖活性和侵襲能力，提高細胞的凋亡率。以上結(jié)果說明抑制C5orf66-AS1表達可顯著抑制SW837細胞的增殖、侵襲，促進其凋亡，可有效阻礙癌細胞的發(fā)生發(fā)展過程。

已有報道，Wnt/β-catenin信號通路是Wnt通路中的經(jīng)典途徑，可參與調(diào)控細胞的生物學過程(增殖、凋亡、侵襲和遷移等)，可在多種腫瘤細胞中被激活，進而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[17-18]。已知Wnt/β-catenin信號傳導通過調(diào)控多功能β-catenin蛋白的表達來調(diào)節(jié)廣泛的細胞生物學過程，β-catenin是Wnt/β-catenin通路中的關(guān)鍵生長刺激因子，可影響細胞增殖、侵襲、分化和其他信號通路的激活[19]。有研究報道，PCNA是檢測細胞增殖活性的指標之一，其表達水平與細胞的增殖狀態(tài)密切相關(guān)，是DNA合成過程中不可或缺的因子[20]。Caspase-3活化可引起多種功能蛋白裂解，導致細胞凋亡，是凋亡的直接執(zhí)行者[21]。Vimentin是間質(zhì)細胞標志蛋白，可使腫瘤細胞獲得游走能力，促進腫瘤細胞向周邊組織侵襲及轉(zhuǎn)移[22]。本研究通過檢測SW837細胞中β-catenin、PCNA、Caspase-3和Vimentin的表達發(fā)現(xiàn)，抑制C5orf66-AS1表達可使細胞中β-catenin、PCNA和Vimentin蛋白水平顯著下調(diào)，Caspase-3蛋白水平顯著上調(diào)。說明抑制C5orf66-AS1可能通過抑制Wnt/β-catenin通路的激活，從而抑制直腸癌細胞PCNA的表達以及EMT發(fā)生，進而抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲能力，通過促進Caspase-3活化促進腫瘤細胞的凋亡過程。

綜上所述，C5orf66-AS1在直腸癌細胞中高表達，抑制其表達可能通過抑制Wnt/β-catenin通路的激活，抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲能力，促進細胞凋亡。C5orf66-AS1可能是直腸癌治療的新靶點。本研究并未從反方向驗證過表達C5orf66-AS1在直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，以及是否還有其他通路參與調(diào)控，還需更深入的研究。