XPR1在果蠅三齡幼蟲神經(jīng)肌肉接頭中功能初探

張寶雪，牛曉曉，金珊

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 武漢 430062)

0 引言

無機(jī)磷酸鹽的吸收在整個(gè)生物世界中是一種普遍的生物現(xiàn)象.磷在動(dòng)物的骨骼、牙齒和細(xì)胞膜等都是極其重要的組成成分.無機(jī)磷酸鹽參與了生物體內(nèi)大多數(shù)的生化反應(yīng)，因此嚴(yán)格控制細(xì)胞內(nèi)外無機(jī)磷酸鹽的水平對(duì)生物的生長(zhǎng)和發(fā)育都非常重要.近年來的研究發(fā)現(xiàn)，人體中xpr1基因發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致原發(fā)性家族性腦鈣化疾病(PFBC)[1].PFBC是一種罕見的神經(jīng)退行性疾病，以雙側(cè)大腦鈣化為病變特征，鈣化主要分布在透鏡核、尾狀核、丘腦、小腦半球和皮層下白質(zhì)等部位，臨床癥狀表現(xiàn)為認(rèn)知障礙、步態(tài)紊亂、運(yùn)動(dòng)障礙、精神異常和癲癇等.迄今為止研究者們發(fā)現(xiàn)了6個(gè)PFBC的致病基因，包括PDGFRB、PDGFB、slc20a2、xpr1、myorg和jam2[2-4].其中slc20a2編碼無機(jī)磷酸輸入蛋白PiT2，而xpr1是哺乳動(dòng)物中目前唯一已知的編碼磷酸鹽輸出蛋白的基因[5].在小鼠中xpr1突變導(dǎo)致腎的磷吸收功能嚴(yán)重受損，主要原因就是xpr1的功能缺陷影響了磷的外排.XPR1一開始是作為小鼠異嗜型或多嗜型的逆轉(zhuǎn)錄病毒(XMRV)受體被研究者發(fā)現(xiàn)，也是第四個(gè)被發(fā)現(xiàn)的具有多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域分子的哺乳動(dòng)物C型癌逆轉(zhuǎn)錄病毒受體.XPR1是一種非典型G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，與G蛋白的β亞基結(jié)合從而參與cAMP信號(hào)通路.據(jù)報(bào)道XMRV在小鼠體內(nèi)就是由XPR1介導(dǎo)入侵的，結(jié)果就導(dǎo)致cAMP信號(hào)減弱，造成細(xì)胞感染死亡引起神經(jīng)疾病[6].除了作為磷酸鹽輸出蛋白、GPCR以及異嗜型或多嗜型的逆轉(zhuǎn)錄病毒受體之外，XPR1還有別的功能，這里就不一一贅述.綜上所述，不難發(fā)現(xiàn)xpr1突變?nèi)菀滓l(fā)神經(jīng)疾病，所以我們以果蠅為實(shí)驗(yàn)材料，在果蠅幼蟲的神經(jīng)肌肉接頭中去探索xpr1在突觸前神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及功能的調(diào)控作用.人類的xpr1在果蠅中的同源基因?yàn)镃G10481、CG7536、CG2901和CG10483(見圖1)，其中CG10481和CG2901在幼蟲的神經(jīng)系統(tǒng)里并不表達(dá)，雖然CG7536在幼蟲神經(jīng)系統(tǒng)也有表達(dá)，但其集中表達(dá)在幼蟲腸道中.而CG10483主要在幼蟲神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá).所以本研究主要使用與人類的xpr1相似性高達(dá)55%的CG10483為基因背景的果蠅.

圖1 人類xpr1與果蠅xpr1氨基酸序列對(duì)比圖

大多數(shù)生物的腦、脊髓和腺體中存在著豐富的突觸，突觸是兩個(gè)神經(jīng)元或者兩個(gè)細(xì)胞相互接觸聯(lián)系的場(chǎng)所.突觸前細(xì)胞在這里組裝釋放神經(jīng)遞質(zhì)，突觸后細(xì)胞在這里接收整合神經(jīng)遞質(zhì)傳遞的信息.根據(jù)突觸形成的部位及突觸傳遞的性質(zhì)，突觸又分為電突觸和化學(xué)突觸，本文中用到的體系主要為化學(xué)突觸，以下直接稱為突觸.一個(gè)完整的突觸包括突觸前膜、突觸間隙和突觸后膜.神經(jīng)支配肌肉的突觸—神經(jīng)肌肉接頭(Neuromuscular junction NMJ)又稱為運(yùn)動(dòng)終板，是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)與骨骼肌組成，人和動(dòng)物能在環(huán)境中有目的的移動(dòng)與NMJ的功能是分不開的.運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元末端釋放化學(xué)信號(hào)作用于鄰近的肌肉細(xì)胞表面，引起局部電流去極化引起肌肉收縮，損壞這一行為會(huì)導(dǎo)致肌肉無力或者癱瘓[7].與腦神經(jīng)和脊髓神經(jīng)突觸相比，NMJ具有相似的結(jié)構(gòu)特征，但是體積更大，更容易制備，是一個(gè)優(yōu)秀的突觸功能研究模型[8].

果蠅作為典型的模式生物，擁有眾多遺傳學(xué)操作工具.神經(jīng)肌肉接頭的形態(tài)特征和功能調(diào)控在果蠅及脊椎動(dòng)物之間是高度保守的，因此果蠅是研究突觸發(fā)育分子機(jī)制和神經(jīng)傳遞的重要模型.果蠅幼蟲的神經(jīng)肌肉接頭是谷氨酸能的，一個(gè)成熟的谷氨酰胺突觸模型形成于胚胎時(shí)期，但是突觸的發(fā)育貫穿了整個(gè)幼蟲階段[9](胚胎晚期有32個(gè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元支配肌肉).果蠅幼蟲有8個(gè)體節(jié)，A2～A7體節(jié)幾乎相同[10]，在每節(jié)體壁上都排列著左右對(duì)稱的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和由一系列由多核肌細(xì)胞組成的肌肉[11]，且每塊肌肉都由固定的神經(jīng)元支配.許多參與果蠅及脊椎動(dòng)物突觸發(fā)育的細(xì)胞是相似的，傳遞的分子也是保守的，參與果蠅突觸發(fā)育的一些動(dòng)物細(xì)胞粘附分子和細(xì)胞排斥分子的結(jié)構(gòu)或功能也與脊椎動(dòng)物突觸中的相似[12]等.NMJ中蛋白種類豐富，這些蛋白分子會(huì)影響神經(jīng)和肌肉間化學(xué)遞質(zhì)的釋放和接收，它們?cè)谶\(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和突觸后的肌膜上分布復(fù)雜[13].編碼這些蛋白的基因發(fā)生突變可能會(huì)導(dǎo)致NMJ的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響NMJ的功能，嚴(yán)重可致死.經(jīng)我們發(fā)現(xiàn)磷酸鹽輸出蛋白XPR1在果蠅幼蟲的NMJ中也有表達(dá)，考慮到XPR1的多項(xiàng)重要功能，我們?cè)贜MJ這一體系中對(duì)XPR1的功能進(jìn)行探究.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)所用果蠅品系如表1所示.

表1 實(shí)驗(yàn)所用果蠅

1.2 免疫染色所用抗體及染料如表2所示.

表2 實(shí)驗(yàn)所用抗體

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 果蠅三齡幼蟲的獲取 取發(fā)育時(shí)間相同的雄性果蠅和處女蠅.為了控制幼蟲的生長(zhǎng)密度，將果蠅按照10∶5雌雄比例放置在25 ℃ 條件下養(yǎng)殖，培養(yǎng)基內(nèi)加入少量干酵母(可促進(jìn)果蠅產(chǎn)卵).管內(nèi)雌雄果蠅交配產(chǎn)卵48 h后倒出成蟲讓培養(yǎng)基內(nèi)的卵繼續(xù)發(fā)育，待生長(zhǎng)為三齡晚期幼蟲后，取材實(shí)驗(yàn).

1.3.2 果蠅三齡幼蟲的解剖 用解剖鑷從培養(yǎng)管內(nèi)輕輕取出發(fā)育好的三齡幼蟲，然后放入解剖液(HL3)中洗去幼蟲身上的培養(yǎng)基.取出幼蟲吸干解剖液放置于解剖盤上，使幼蟲背部朝上漏出背部的兩根氣管，然后用解剖針固定頭部和尾部.在固定好的幼蟲身上滴一滴解剖液，用解剖剪在幼蟲尾部剪一小口，然后從尾部沿兩根氣管之間剪至頭部.夾取解剖針將幼蟲的皮在頭尾各取兩個(gè)角使幼蟲成片狀伸展開呈六邊形，最后用解剖鑷將內(nèi)臟和氣管清除干凈保留幼蟲大腦及腹側(cè)神經(jīng)節(jié).

1.3.3 免疫染色[14]解剖完成之后吸去幼蟲樣本的解剖液，吸干之后用PFA(4%多聚甲醛)浸住整個(gè)樣品，室溫固定40 min.固定過后，取下解剖針，將樣本用0.2% PBST(1% PBS+0.2% Triton X 100)洗脫液進(jìn)行漂洗，每10 min更換一次洗脫液，連續(xù)漂洗90 min.吸干洗脫液，用移液器加入一抗(0.2%的PBST配制)，4 ℃過夜.吸走一抗，加入0.2% PBST洗脫液連續(xù)洗脫1 h，每10 min更換1次洗脫液.吸干洗脫液，用移液器加入二抗(0.2%的PBST配制)，室溫避光孵育3 h，漂洗樣本，方法同一抗.將染色完成的樣本置于載玻片上，吸干洗脫液，用Vectorshield封片油浸住樣品，蓋上蓋玻片(注意樣品內(nèi)不出現(xiàn)氣泡，否則會(huì)影響圖片采集)后用指甲油密封.

1.3.4 圖片采集和數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)中樣本免疫染色圖片的均由蔡司710共聚焦顯微鏡采集，圖片處理主要由ZEN(black)和Photoshop CS完成.樣本數(shù)據(jù)主要由Graphpad Prism 5.01和Image J處理完成.兩組實(shí)驗(yàn)比較采用T檢驗(yàn)(Student’sttest)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，3組及其以上采用F檢驗(yàn)(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.為了減小誤差，我們統(tǒng)一檢測(cè)第3體節(jié)4號(hào)肌肉的NMJ.

2 結(jié)果

2.1 XPR1分布定位于果蠅三齡幼蟲的NMJ免疫染色結(jié)果顯示GFP標(biāo)記的XPR1在NMJ的神經(jīng)軸突、突觸前(圖2A)和突觸后(圖2B)都有分布 (見圖2).

圖2 XPR1的免疫染色分布圖A：HRP標(biāo)記突觸前神經(jīng)細(xì)胞膜.GFP標(biāo)記的XPR1在NMJ的軸突和突觸前都有分布. 左圖為NMJ神經(jīng)軸突，中間圖及右圖分別為NMJ的突觸及單個(gè)突觸扣結(jié)放大圖. B：DLG(洋紅)標(biāo)記NMJ突觸后的肌肉細(xì)胞膜，GFP標(biāo)記XPR1(綠色)的分布.由圖可知XPR1在NMJ的突觸后也有分布.

2.2xpr1-果蠅的三齡幼蟲的NMJ形態(tài)出現(xiàn)缺陷為了更好地觀察xpr1-果蠅三齡幼蟲的NMJ,我們用HRP和DLG進(jìn)行標(biāo)記.共聚焦圖像顯示，與野生型相比，xpr1-果蠅的NMJ在形態(tài)上出現(xiàn)顯著差異，如圖3A和3B.xpr1-果蠅的NMJ的扣結(jié)明顯變小且不平滑，甚至出現(xiàn)衛(wèi)星扣結(jié)(環(huán)繞在正常突觸扣節(jié)周圍的略小的扣節(jié))，如圖3B箭頭所示所示.雖然xpr1-果蠅幼蟲NMJ的扣結(jié)變小(圖3D)，但其扣結(jié)數(shù)目(圖3C)、長(zhǎng)度(圖3E)及伸展度(圖3F)沒有明顯變化.

圖3 xpr1-果蠅幼蟲的NMJ出現(xiàn)形態(tài)缺陷A，野生型果蠅(w1118)的NMJ染色圖.HRP(洋紅)，DLG(綠).B，xpr1-果蠅的NMJ染色圖.圖C、D、E及F分別為果蠅NMJ扣結(jié)數(shù)目、平均大小、NMJ長(zhǎng)度以及覆蓋面積統(tǒng)計(jì)圖(n>20個(gè)NMJs, ***P<0.001)， Error bars 代表 s.e.m

2.3xpr1在NMJ發(fā)育中的功能主要集中在突觸前為了驗(yàn)證xpr1-三齡幼蟲NMJ變小的結(jié)果，我們對(duì)xpr1-的NMJ分別進(jìn)行突觸前和突觸后挽救實(shí)驗(yàn).我們?cè)趚pr1突變的背景下用elav-Gal驅(qū)動(dòng)UAS-xpr1-進(jìn)行突觸前挽救(elav-Gal4/+;UAS-xpr1/+;xpr1-)，結(jié)果顯示，與野生(圖4A)型相比，NMJ的表型恢復(fù)至正常水平(圖4C).當(dāng)在xpr1突變的背景下，使用C57-Gal4驅(qū)動(dòng)UAS-xpr1進(jìn)行突觸后挽救(UAS-xpr1/+;C57-Gal,xpr1-/xpr1-)，結(jié)果顯示NMJ并沒有恢復(fù)至正常水平(圖4B)，NMJ的扣結(jié)呈緊密排列，與野生型對(duì)照相比扣結(jié)面積明顯較小(圖4F).然后我們又用elav-Gal4驅(qū)動(dòng)UAS-xpr1進(jìn)行XPR1的高表達(dá)(圖4D)，結(jié)果顯示XPR1的高表達(dá)并不會(huì)影響幼蟲NMJ的形態(tài)發(fā)育.我們同樣對(duì)這些基因型的果蠅NMJ的扣結(jié)數(shù)目(圖4E)、長(zhǎng)度(圖4G)和覆蓋面積(圖4H)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示均與對(duì)照組無顯著差異.突觸后挽救結(jié)果顯示NMJ扣結(jié)數(shù)目(圖4E)無顯著變化，大小(圖4F)明顯變小，這與圖片中顯示的結(jié)果一致.這些結(jié)果可能表明xpr1雖然在幼蟲NMJ的突觸前后均有表達(dá)，但在神經(jīng)肌肉接頭發(fā)育中的主要功能集中在突觸前的神經(jīng)系統(tǒng).

圖4 xpr1在NMJ中的功能主要集中在突觸前A，野生型果蠅(w1118)的NMJ染色圖(左).HRP(洋紅)，DLG(綠). B，使用C57-Gal4驅(qū)動(dòng)UAS-xpr1對(duì)無功能突變體進(jìn)行突觸后挽救(UAS-xpr1/+;C57-Gal4, xpr1-/xpr1-)的NMJ染色圖片(C57 Rescue).C,使用elav-Gal4驅(qū)動(dòng)UAS-xpr1對(duì)xpr1-進(jìn)行突觸前挽救(elav-Gal4/+;UAS-xpr1/+;xpr1-)的NMJ染色圖片(elav Rescue).D，使用elav-Gal4驅(qū)動(dòng)UAS-xpr1對(duì)XPR1進(jìn)行高表達(dá)(elav-Gal4/+;UAS-xpr1/+)的NMJ染色圖片(elav UAS). 圖E、F、G及H分別為果蠅NMJ扣結(jié)數(shù)目、平均大小、NMJ長(zhǎng)度以及覆蓋面積統(tǒng)計(jì)圖 (n>25個(gè)NMJs,***P<0.001)，Error bars 代表s.e.m.

3 結(jié)果與討論

xpr1-在果蠅三齡幼蟲NMJ中出現(xiàn)了NMJ扣結(jié)變小、排列緊密且不平滑等形態(tài)缺陷，說明該基因在NMJ具有較重要的功能.實(shí)驗(yàn)中利用在突變體背景下用C57-Gal4在突觸后進(jìn)行回補(bǔ)表達(dá)xpr1, 發(fā)現(xiàn)并不能挽救xpr1-的缺陷表型；然而在突變體背景下用elav-Gal4在突觸前進(jìn)行回補(bǔ)表達(dá)xpr1，發(fā)現(xiàn)幼蟲NMJ的缺陷表型被挽救恢復(fù)至野生型水平，因此我們推測(cè)xpr1-在NMJ發(fā)育中的功能主要集中在突觸前.

人類xpr1與果蠅及其他動(dòng)植物和單細(xì)胞生物編碼xpr1的同源基因具有高度的保守性，表明了其在細(xì)胞中發(fā)揮著重要的基礎(chǔ)功能.在人體中若xpr1發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致PFBC.我們的結(jié)果顯示在xpr1-果蠅的三齡幼蟲中其NMJ突觸后表達(dá)時(shí)不能挽救其突變體表型,說明xpr1在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用.

有研究表明XPR1參與cAMP信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，影響cAMP的水平的主要原因?yàn)閄PR1是一種非典型G蛋白偶聯(lián)受體.cAMP作為細(xì)胞的第二信使在許多細(xì)胞功能中都很重要，如細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、凋亡及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和神經(jīng)傳遞等[6,15].cAMP通過與靶蛋白PKA結(jié)合，使蛋白激酶K(PKA)磷酸化激活調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá).cAMP水平增加會(huì)增強(qiáng)果蠅神經(jīng)肌肉連接結(jié)構(gòu)和功能.果蠅幼蟲的NMJ是谷氨酸能的突觸，NMJ發(fā)育過程的生命活動(dòng)及突觸可塑性的調(diào)節(jié)是cAMP依懶性的. FasII(細(xì)胞粘連分子)能夠控制NMJ結(jié)構(gòu)而非功能的可塑性，在調(diào)控突觸前后發(fā)育中都發(fā)揮著重要作用，并且FasII還可以通過CREB(cAMP的應(yīng)答元件結(jié)合蛋白)與cAMP共同調(diào)節(jié)NMJ結(jié)構(gòu)與功能.CREB是cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，它是單個(gè)基因d(creb2)編碼的，d(creb2)根據(jù)需求可以通過選擇性的剪切和拼接成為激活因子dCREB2-a和抑制因子dCREB2-b.CREB可以啟動(dòng)上游調(diào)控區(qū)含有cAMP反應(yīng)元件(CRE位點(diǎn))的基因的轉(zhuǎn)錄，當(dāng)它的抑制因子dCREB2-b在dunce(編碼cAMP特異性磷酸二酯酶，負(fù)責(zé)cAMP降解)突變體中表達(dá)時(shí)，會(huì)抑制CREB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄從而阻斷突觸的功能但不影響其活動(dòng).當(dāng)激活因子(dCREB2-a)的在FasII突變體表達(dá)時(shí)會(huì)激活CREB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，引起突觸的扣結(jié)數(shù)目增加，也就是說dCREB2-a 的表達(dá)重塑了突觸的cAMP依賴的可塑性[16].xpr1突變時(shí)磷酸鹽輸出功能受損，在人體中會(huì)導(dǎo)致PFBC，病人的大腦中發(fā)生羥基磷酸鈣沉淀的鈣化現(xiàn)象.有研究發(fā)現(xiàn)，給三周大的小鼠喂食缺鈣的食物時(shí)NMJ的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)發(fā)生細(xì)微變化，肌肉缺乏持續(xù)的應(yīng)激反應(yīng)[17].由此可見xpr1對(duì)NMJ發(fā)育的影響是多方面的，后期我們將進(jìn)一步研究xpr1對(duì)NMJ發(fā)育的影響機(jī)制.