基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探索散偏湯治療偏頭痛的作用機(jī)制

楊柳青，范 博，陳莉萍,2，李 玲*，陳慧娟

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川成都 610039；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,四川成都 611137；3.四川省第二中醫(yī)醫(yī)院，四川成都 610014）

偏頭痛是臨床常見(jiàn)的一種原發(fā)性頭痛，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的單側(cè)或雙側(cè)搏動(dòng)性頭痛，它主要是由于顱內(nèi)血管舒縮功能障礙而引起頭部偏側(cè)疼痛，常間歇性發(fā)作，且病程持久。中醫(yī)稱偏頭痛為“頭風(fēng)”，多是由于七情內(nèi)傷，氣血瘀阻經(jīng)絡(luò)，連及臟腑，復(fù)受外邪侵襲而引發(fā)的一種周期性發(fā)作的疾病[1]。世界衛(wèi)生組織調(diào)查顯示，人群中偏頭痛患病率為15%～18%[2]，我國(guó)是患偏頭痛人數(shù)最多的國(guó)家。目前用于偏頭痛發(fā)作期治療的藥物包括非甾體類抗炎藥、阿片類藥物，麥角類制劑和曲普坦類特異性藥物[3]，用于預(yù)防期的藥物有鈣通道與β 受體阻滯劑、抗抑郁藥、抗癲癇藥等[4]。中醫(yī)用藥主要有散偏湯、川芎茶調(diào)散、天麻鉤藤湯、血府逐瘀湯等[5]。

散偏湯出自清《辨證錄》，現(xiàn)收錄于國(guó)家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》之中。全方由白芍五錢，川芎一兩，白芷五分，郁李仁一錢，柴胡一錢，白芥子三錢，香附二錢，甘草一錢組成，具有疏風(fēng)止痛和利肝膽之功效。主要治療半邊頭風(fēng)證，現(xiàn)階段散偏湯治療偏頭痛的研究文獻(xiàn)較多，臨床治療效果顯著，無(wú)明顯不良反應(yīng)[6?7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，散偏湯方劑中八味藥均有不同程度的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛功效[7]，但目前對(duì)散偏湯治療偏頭痛的作用機(jī)制研究較少。因此本文欲采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探索散偏湯治療偏頭痛的作用機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)研究藥物與靶點(diǎn)之間“多成分、多靶點(diǎn)、多通路”的一門(mén)學(xué)科，現(xiàn)階段網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥治療疾病作用機(jī)制的初步研究方面提供了很好的參考價(jià)值。本文也將通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)散偏湯治療偏頭痛的作用機(jī)制進(jìn)行探索，為后續(xù)的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 散偏湯主要活性成分和靶點(diǎn)

預(yù)測(cè)利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://tcmspw.com/tcmsp.php）經(jīng)過(guò)ADME 篩選后收集白芷、白芍、川芎、柴胡、甘草、香附、郁李仁的化學(xué)成分，以類藥性（DL）≥0.18 且口服生物利用度（OB）≥30%篩選出7 種藥物的主要活性成分。方劑中白芥子在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中并未收納，利用中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMID）（http://119.3.41.228:8000/tcmid/）查找白芥子的主要活性成分，根據(jù)其CAS 號(hào)或化學(xué)名稱在TCMSP 中查出活性成分的OB、DL 值。

篩選后得到的藥物活性成分在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)[8]中下載對(duì)應(yīng)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)SDF 文件。藥物靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)使用SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swiss-targetprediction.ch/）,在其頁(yè)面提交所下載的SDF 文件，進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，選擇可能性大于0 的靶點(diǎn)，即可得到所預(yù)測(cè)成分的靶點(diǎn)。

1.2 疾病靶點(diǎn)篩選和交集靶點(diǎn)和獲取

在OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://omim.org/）[9]的Gene Map 頁(yè)面和GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（www.genecards.org）[10]中以“migraine”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，查找有關(guān)偏頭痛的靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，合并兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)再次去重即得到偏頭痛相關(guān)靶點(diǎn)。利用微生信網(wǎng)站的jvenn 網(wǎng)站（www.bioinformatics.com.cn/stat-ic/others/jvenn/example.html）[11]提交篩選出的藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)，生成“藥物-疾病”共有靶點(diǎn)韋恩圖，得到散偏湯治療偏頭痛共有靶點(diǎn)。

1.3 偏頭痛與藥物交集靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

相關(guān)蛋白-蛋白相互作用(Protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建是將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)[12](https://www.string-db.org/），提交搜索，設(shè)置為高置信區(qū)間>0.9，隱藏游離的靶點(diǎn)，下載蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)tsv 文件,導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件,構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。使用軟件中的cytoHubba插件篩選出關(guān)鍵基因，其中設(shè)置為前30 個(gè)節(jié)點(diǎn)，排序算法選擇MCC（maximum clique centrality,最大團(tuán)中心性）。

1.4 藥物?靶點(diǎn)?疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

用Excel 軟件制作“Network”和“Type”文件，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件，構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”關(guān)系圖，其中節(jié)點(diǎn)表示藥物、活性成分、靶點(diǎn)、疾病，邊則表示某兩種組分之間的聯(lián)系。運(yùn)用軟件中的Network Analyzer 工具分析所得到的網(wǎng)絡(luò)。

1.5 靶點(diǎn)的功能及通路分析

將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://metascape.org/gp/index.html）[13]，進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（kyoto encyclopedia of gene and genomes,KEGG)分析和基因本體論（gene ontology,GO）分析。設(shè)置最小有3 個(gè)基因在通路上即被顯示，P 值設(shè)置為0.01，最小富集為1.5，分別對(duì)KEGG 通路、生物過(guò)程（biological processes）、細(xì)胞組分（cellular components）以及分子功能（molecular functions）進(jìn)行富集分析，下載分析好的全部文件。

2 結(jié)果

2.1 藥物成分和疾病靶點(diǎn)分析

經(jīng)過(guò)篩選，共得到157 個(gè)活性成分，其中有8 個(gè)成分是多種中藥所共有成分。SwissTargetPredict數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)獲得1066 個(gè)藥物作用靶點(diǎn)。以“migraine”在OMIM 和GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索其靶點(diǎn)，將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)合并去重之后，共得到1045 個(gè)疾病靶點(diǎn)。把所得到的藥物作用靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入jvenn 數(shù)據(jù)庫(kù)，繪制韋恩圖，得到205 個(gè)疾病與藥物共同靶點(diǎn)。韋恩圖如圖1 所示。

圖1 散偏湯潛在靶點(diǎn)和偏頭痛疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.2 散偏湯治療偏頭痛的PPI 網(wǎng)絡(luò)

PPI 網(wǎng)絡(luò)圖由175 個(gè)蛋白靶點(diǎn)以及904 條偏頭痛相關(guān)的蛋白質(zhì)互作關(guān)系組成，通過(guò)對(duì)該網(wǎng)絡(luò)無(wú)向的分析得到該網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)平均自由度為10.33，該網(wǎng)絡(luò)由6 個(gè)連接緊密的模塊組成。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖如圖2 所示。利用cytoHubba 插件得到此網(wǎng)絡(luò)中前25 個(gè)關(guān)鍵基因，如表1 所示。

表1 PPI 網(wǎng)絡(luò)MCC 評(píng)分前25 位關(guān)鍵基因

圖2 散偏湯治療偏頭痛相關(guān)靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 散偏湯治療偏頭痛的“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

本研究中，運(yùn)用Cytoscape3.7.2 軟件，對(duì)散偏湯的八味中藥，157 個(gè)活性成分，偏頭痛和藥物的205 個(gè)共同靶點(diǎn)構(gòu)建了可視化的雙向交互網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)圖由371 個(gè)節(jié)點(diǎn)、3283 條邊組成，如圖3。對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，去除散偏湯、偏頭痛以及八味藥節(jié)點(diǎn)，計(jì)算得到平均節(jié)點(diǎn)自由度為17.09，節(jié)點(diǎn)度值大于17 的節(jié)點(diǎn)總共有157 個(gè)，有63 個(gè)為散偏湯治療偏頭痛的相關(guān)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，94 個(gè)為八味藥的活性成分節(jié)點(diǎn)，分別列出了前30 個(gè)重要的基因以及活性成分，如下表2、表3 所示。

表2 “藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)大于平均自由度的30 個(gè)靶點(diǎn)

表3 “藥物?靶點(diǎn)?疾病”網(wǎng)絡(luò)大于平均自由度的30 個(gè)成分節(jié)點(diǎn)

圖3 散偏湯治療偏頭痛的“藥物?靶點(diǎn)?疾病”交互網(wǎng)絡(luò)圖

由表2 可知，CYP19A1、ESR2、ESR1、ADORA-2A、EGFR、ADORA1、MAOA 均有非常高的自由度，遠(yuǎn)高于平均自由度的3 倍。由表3 可知，活性成分自由度相較靶點(diǎn)自由度要小，活性成分中自由度最高的是山柰酚，其為白芍、郁李仁、柴胡、香附、甘草共有成分，依次是羅通定，是香附中的成分，獨(dú)活素，為白芷的一種香豆素活性成分。由此看出，散偏湯功效是多種藥物與多種靶點(diǎn)共同作用的結(jié)果。

2.4 KEGG 通路富集分析

將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG通路富集分析，最終得到334 條通路，按照通路上基因數(shù)量由大到小排序，我們列出了前20 條信號(hào)通路，其中包括有神經(jīng)活性配體-受體相互作用、MAPK 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路等。運(yùn)用微生信在線作圖網(wǎng)站[14]（http://www.bioinformatics.com.cn/plot_basic_horizontal_ba r_062）繪制出條形圖，如圖4(a)所示。并運(yùn)用易漢博生物信息在線作圖工具(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/GOenrichmentplot.h tml）繪制出了氣泡圖，如圖4(b)所示。

圖4 散偏湯治療偏頭痛潛在靶點(diǎn)KEGG 富集分析柱狀圖（a）以及氣泡圖（b）

對(duì)205 個(gè)共同靶點(diǎn)利用Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO 分析。得到生物過(guò)程相關(guān)的GO-BP 總共為306 條，根據(jù)在此生物過(guò)程中基因數(shù)目由大到小排序，共列出前20 個(gè)生物相關(guān)過(guò)程。其中包含突觸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)程、無(wú)機(jī)離子穩(wěn)態(tài)、分泌調(diào)節(jié)生物過(guò)程等。GO-CC 分析總共得到108 個(gè)細(xì)胞成分相關(guān)條目，列出的前20 條細(xì)胞組分有突觸后、突觸前、突觸膜、受體復(fù)合體、細(xì)胞體等。GOMF 分析總共得到136 個(gè)分子功能相關(guān)條目，前20 條包含有通道活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、門(mén)控通道活性、激酶活性等。

將篩選出的前20 條GO-BP、GO-CC、GOMF 運(yùn)用微生信在線作圖工具繪制三合一的柱狀圖，如圖5（a）。同時(shí)運(yùn)用易漢博生物信息在線作圖工具繪制出氣泡圖，如圖5(b)、5（c）、5（d）所示。

圖5 散偏湯治療偏頭痛潛在靶點(diǎn)GO 富集分析柱狀圖及氣泡圖

3 討論

散偏湯治療偏頭痛效果良好，但目前對(duì)其藥理機(jī)制研究較少。為研究其作用機(jī)制，本次研究對(duì)散偏湯治療偏頭痛的205 個(gè)共同靶點(diǎn)以及散偏湯中八味中藥的主要活性成分進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。PPI 網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)該網(wǎng)絡(luò)由6 個(gè)聯(lián)系緊密的模塊組成，篩選出排名前25 的關(guān)鍵基因。排在首位的是APP（淀粉樣蛋白-β 前體），其裂解產(chǎn)生的淀粉樣蛋白-β 被看作是阿爾茲海默病發(fā)生的關(guān)鍵性物質(zhì)，并且APP751和APP770廣泛表達(dá)于腦外周[15]，偏頭痛的發(fā)生可能與其相關(guān)。OPRK1 是κ 型阿片受體，參與人體感覺(jué)的調(diào)節(jié)。在Lindsey M.Snyder 等[16]的研究中，κ 型阿片受體在不同感覺(jué)神經(jīng)元中表達(dá)，外周選擇性的κ 型阿片受體激動(dòng)劑可以減少疼痛和神經(jīng)源性炎癥。CCR5 和CXCL8 都屬于趨化因子，CCR5 的拮抗劑可以減少細(xì)胞炎癥因子釋放，炎癥減輕，SARS-CoV-2 血漿病毒血癥減少[17]；CXCL8 能響應(yīng)炎癥刺激，加大CXCL5、CXCL8 和CXCL10 的表達(dá)會(huì)加重牙周炎癥和破壞[18]。散偏湯對(duì)于偏頭痛的治療可能存在與上述中相關(guān)或相同的作用機(jī)制，但并無(wú)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道具體機(jī)制，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其具體機(jī)制。

分析“藥物?疾病?靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果顯示，節(jié)點(diǎn)自由度排名靠前的依次是山柰酚、羅通定、獨(dú)活素。山柰酚具有抗癌、抗氧化作用，與銅離子絡(luò)合后能有效地清除自由基，在一定條件下對(duì)DNA 有保護(hù)作用[19]；山柰酚能通過(guò)調(diào)控circNOL12/miR-6873-3p/FRS2 軸減輕ox-LDL 誘導(dǎo)的人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥、凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)[20]，還具有減輕糖尿病腎病的作用[21]。羅通定是多巴胺受體D2的阻斷劑，主要體現(xiàn)為鎮(zhèn)痛作用，此外還有鎮(zhèn)靜催眠、鎮(zhèn)咳、治療高血壓、心律失常等作用[22]。Santhana Krishnan 等[23]的研究證實(shí)獨(dú)活素對(duì)水稻黃單胞菌和林炭疽菌的抑菌活性；Haripriya Shanmugam 等[24]的研究表明獨(dú)活素具有骨再生能力，或可用于骨質(zhì)疏松癥。山柰酚的減輕炎癥作用，羅通定的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用，都與改善偏頭痛癥狀相符合。

偏頭痛發(fā)生的一個(gè)主要病因被認(rèn)為是參與疼痛和炎癥傳播的中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)和血管壁之間作用的不平衡，導(dǎo)致擴(kuò)散性皮質(zhì)抑制和三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)興奮性閾值降低[25]。KEGG 富集分析結(jié)果顯示，散偏湯或是通過(guò)調(diào)控MAPK、PI3K-Akt、HIF-1 等信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)其對(duì)偏頭痛的治療作用。MAPK 通路在細(xì)胞的增殖、凋亡、炎癥等多方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。體內(nèi)研究顯示，抑制JNK 和p38MAPK 這兩條并行的“應(yīng)激誘導(dǎo)”MAPK 通路并激活NF-κB 可以減輕偏頭痛炎癥反應(yīng)的發(fā)生[26]。偏頭痛大鼠模型腦組織PI3K/Akt 信號(hào)通路被激活[27]，人腎小管上皮細(xì)胞炎癥加重時(shí)PI3K/Akt/NFκB 信號(hào)通路的表達(dá)較高[28]，這些結(jié)果均表明PI3K/Akt 通路在炎癥細(xì)胞內(nèi)表達(dá)較高。HIF-1(缺氧誘導(dǎo)因子)是神經(jīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵性神經(jīng)保護(hù)因子，在機(jī)體低氧濃度時(shí)或缺氧應(yīng)答時(shí)至關(guān)重要[29]。HIF-1 信號(hào)通路能夠激活NO，影響炎癥反應(yīng)，參與血管平滑肌舒張，散偏湯治療偏頭痛也可能與此作用機(jī)制相關(guān)。HIF-1α 通路上的NOS2/NOS3/IL6/VEGEA 等基因介導(dǎo)的炎癥和血管舒縮可能是散偏湯治療偏頭痛的重要機(jī)制。GO 分析結(jié)果表明，偏頭痛受多種細(xì)胞行為、分子功能調(diào)控，包含突觸信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、傳遞，體內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，循環(huán)系統(tǒng)參與，通道活性、激酶活性等。

綜上，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，散偏湯治療偏頭痛可能活性成分有山柰酚、羅通定、獨(dú)活素等，得分較高靶點(diǎn)有APP、CCR5、CXCL8、OPRK1 等；散偏湯對(duì)偏頭痛治療效果與MAPK、PI3K-Akt、HIF-1 等信號(hào)通路存在一定相關(guān)性，或也參與了突觸信號(hào)傳遞、穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、通道活性、酶活性等生物學(xué)過(guò)程。本次研究初步探索了散偏湯治療偏頭痛的主要活性成分及作用機(jī)制，為后續(xù)深入研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和參考。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)缺乏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的局限性，課題組將采用驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)對(duì)散偏湯治療偏頭痛的作用機(jī)制進(jìn)行下一步研究。