清肺顆粒固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基成分研究

張 艷，薛沾枚，劉雪松，蘇 景，郝敬友，唐 偉，劉彥凱，孫洪杰，史同瑞

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，齊齊哈爾 161005；2.黑龍江省動物疫病控制中心，哈爾濱 150069；3.哈爾濱綠達(dá)生動物藥業(yè)有限公司，哈爾濱 150039)

中草藥的傳統(tǒng)提取方法有浸提法、水煎法、醇提取和水蒸餾法等，這些方法雖然操作簡單，但存在提取率低、易破壞中藥有效成分、降低藥物療效等弊端[1-3]。為了更加科學(xué)、高效地提取中藥活性成分，人們一直在探索創(chuàng)新并優(yōu)化中藥的提取技術(shù)[4-5]。生物發(fā)酵中藥是利用微生態(tài)學(xué)、仿生學(xué)等方法將中藥或其提取液以1株或幾株益生菌作為菌種，在體外模擬動物腸道環(huán)境對中藥有效成分的生物學(xué)轉(zhuǎn)化的一種方法[6-8]。清肺顆粒是由板藍(lán)根、葶藶子、浙貝母、桔梗、甘草等多味中藥組成的方劑，具有清肺平喘、止咳化痰的功效，主治肺熱咳喘、咽喉腫痛[9]。解淀粉芽孢桿菌是一種需氧益生芽孢桿菌，可產(chǎn)生多種生物酶，如纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶和β-葡聚糖酶等[10-11]，各種生物酶有助于植物細(xì)胞壁的裂解，使藥物的有效成分更徹底地釋放出來。清肺顆粒組方中板藍(lán)根和葶藶子占比較多，故選擇二者共有的活性成分(R,S)-告依春為評價(jià)指標(biāo)。采用可產(chǎn)生多種生物酶的解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵法可顯著提高清肺顆粒組方(R,S)-告依春的提取率。為進(jìn)一步優(yōu)化清肺顆粒組方的固態(tài)發(fā)酵工藝，本試驗(yàn)在單因素法篩選培養(yǎng)基組成的基礎(chǔ)上，以響應(yīng)面法確定了培養(yǎng)基各組分配比，并比對發(fā)酵清肺顆粒與傳統(tǒng)工藝清肺顆粒藥物有效成分(R,S)-告依春含量的差異，以期為清肺顆粒生產(chǎn)工藝改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

板藍(lán)根、葶藶子、桔梗、甘草、貝母、麩皮、玉米面和黃豆粉均由哈爾濱綠達(dá)生動物藥業(yè)有限公司提供；蔗糖、甘露醇、麥芽糖、可溶性淀粉、酵母浸膏、(NH4)2SO4、NH4Cl、尿素、蛋白胨、葡萄糖、CaCO3、KH2PO4、MgSO4、MnSO4、NaCl均為分析純，均購自齊齊哈爾市現(xiàn)代精細(xì)化工有限公司；解淀粉芽孢桿菌由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院微生物研究室分離鑒定并保存。

分析天平(型號：WT1003H)購自常州萬泰天平儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號：DH4000II)、超凈工作臺(型號：CJ-2S)購自天津市泰斯特儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)搖床(型號：SPH-2102C)購自上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；立式壓力滅菌器(型號：LDZX-75KBS)購自上海申安醫(yī)療器械廠；高速多功能中藥粉碎機(jī)(型號：DFY-500)購自溫嶺市林大機(jī)械有限公司。

1.2 高效液相色譜(HPLC)法測定(R,S)-告依春含量

1.2.1 色譜條件 色譜柱為InertSustain C18，流動相為甲醇∶0.02%磷酸=7∶93，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為245 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.2 對照品溶液制備 精密稱取(R,S)-告依春對照品4 mg，加入100 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成40 μg/mL的對照品溶液。

1.2.3 線性關(guān)系考察 精密移取一定量對照品溶液于容量瓶中，用甲醇定容制成濃度分別為2.5、5、10、20和40 μg/mL的溶液，上樣量10 μL，測定峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率試驗(yàn) 分別精密量取濃度為0.5、5和10 mg/mL的對照品溶液，上樣量10 μL，測定峰面積。精密度試驗(yàn)連續(xù)上樣6次，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)；穩(wěn)定性試驗(yàn)，間隔2 h分別進(jìn)樣，在12個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定峰面積，計(jì)算RSD值；重復(fù)性試驗(yàn)，同一供試品溶液，連續(xù)制備6份，分別測定各中藥有效成分平均含量，計(jì)算RSD；加標(biāo)回收率檢驗(yàn)，將已知濃度的樣品加入一定量標(biāo)準(zhǔn)樣品再進(jìn)行檢測，計(jì)算它們的平均回收率和RSD值。

1.3 發(fā)酵菌的活化

將凍存的解淀粉芽孢桿菌解凍后劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，平板上挑取單個(gè)菌落接種營養(yǎng)肉湯，37 ℃搖床130 r/min培養(yǎng)18～22 h。

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素篩選

基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：蛋白胨20 g，葡萄糖10 g，氯化鈉5 g，水1 L，pH 7.0～7.2。按受試營養(yǎng)成分與基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源、氮源和無機(jī)鹽基本一致的原則替換。

4.以學(xué)術(shù)英語為導(dǎo)向，設(shè)計(jì)具有邏輯風(fēng)格的英語課程。教師作為課堂設(shè)計(jì)的主導(dǎo)者，需要具備為課程設(shè)計(jì)的能力，以此啟發(fā)學(xué)生進(jìn)行思考。學(xué)術(shù)英語課堂不再是教師單純對知識點(diǎn)講解，更需要通過引導(dǎo)者的身份來指引學(xué)生進(jìn)行學(xué)習(xí)。教學(xué)實(shí)踐中，我們應(yīng)從話語主題或背景出發(fā)，注重內(nèi)容意義、寫作目的、運(yùn)用意境等多角度，讓學(xué)生自發(fā)產(chǎn)生疑問，教師通過富有邏輯地講解和分析讓學(xué)生對所質(zhì)疑的事物有一種頓悟的感覺，最終實(shí)現(xiàn)圍繞其論證的理解、分析與評估等批判性思維方法和策略訓(xùn)練學(xué)生提出和解決問題的能力，促進(jìn)學(xué)生批判性思維能力的培養(yǎng)。

1.4.1 碳源篩選 分別以10 g/L蔗糖、10 g/L甘露醇、10 g/L麥芽糖、50 g/L玉米面、50 g/L可溶性淀粉和100 g/L清肺組方中藥粉替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，其他成分不變，同時(shí)以基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照。將發(fā)酵菌液以2%接菌劑量接種，置于37 ℃以130 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，混勻取樣，HPLC法測定(R,S)-告依春含量，試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.4.2 氮源篩選 分別以50 g/L黃豆粉、50 g/L麩皮、10 g/L酵母浸膏、10 g/L (NH4)2SO4，10 g/L NH4Cl、10 g/L尿素替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白陳，其他成分不變，按1.4.1方法培養(yǎng)。

1.4.3 無機(jī)鹽篩選 分別以3 g/L CaCO3、2 g/L KH2PO4、2 g/L MgSO4、0.2 g/L MnSO4替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的NaCl，其他成分不變，按1.4.1方法培養(yǎng)。

1.5 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化

1.5.1 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基成分 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以中藥粉比例、氮源比例、無機(jī)鹽比例、和水比例4個(gè)因素為自變量，以(R,S)-告依春含量(Y)為評價(jià)指標(biāo)，按表1的因素水平表設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案，篩選最優(yōu)培養(yǎng)基參數(shù)。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基成分因素水平

1.5.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 按前文方法接種優(yōu)化的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定每克固態(tài)發(fā)酵物中的(R,S)-告依春含量，驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 (R,S)-告依春含量比對

HPLC法測定工藝優(yōu)化前、后發(fā)酵培養(yǎng)基中(R,S)-告依春含量，應(yīng)用外標(biāo)法計(jì)算，重復(fù)3次。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié) 果

2.1 HPLC法測定(R,S)-告依春含量

2.1.1 線性關(guān)系考察 (R,S)-告依春對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=22 219x-36 975，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9994，(R,S)-告依春含量在2.5～40 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(圖1)。(R,S)-告依春標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖2，出峰時(shí)間16.848 min。

圖1 (R,S)-告依春標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of epigoitrin

圖2 (R,S)-告依春標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of epigoitrin standard

2.1.2 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 精密度試驗(yàn)RSD分別為2.68%、1.82%和0.74%，說明建立方法的精密度良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD分別為1.42%、1.72%和2.08%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。重復(fù)性試驗(yàn)RSD分別為1.28%、2.26%和0.98%，表明方法的重復(fù)性良好。 加樣回收率試驗(yàn)平均回收率分別為100.07%、99.27%和99.85%，RSD分別為1.04%、0.94%和1.78%，說明方法的準(zhǔn)確性良好。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的篩選

2.2.1 碳源篩選 由圖3A可知，以葡萄糖為碳源的發(fā)酵底物中每克中藥中(R,S)-告依春含量最高，為0.0178 mg/g，其次為清肺組方中藥、可溶性淀粉和甘露醇，分別為0.0177、0.0174和0.0174 mg/g，均顯著高于其他碳源(P<0.05),且這幾種碳源間差異不顯著(P>0.05),綜合考慮選擇清肺組方中藥為碳源。

2.2.2 氮源篩選 由圖3B可知，以黃豆粉為氮源的發(fā)酵底物中每克中藥中(R,S)-告依春含量最高，為0.0176 mg/g，其次是尿素和蛋白胨分別為0.0174和0.0173 mg/g，均顯著高于其他氮源(P<0.05),故選黃豆粉為氮源。

2.2.3 無機(jī)鹽篩選 由圖3C可知，以碳酸鈣為無機(jī)鹽的發(fā)酵底物中每克中藥中(R,S)-告依春含量最高，為0.0175 mg/g，其次是對照氯化鈉和硫酸鎂，均為0.0174 mg/g，均顯著高于其他無機(jī)鹽(P<0.05),故無機(jī)鹽選用碳酸鈣。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面統(tǒng)計(jì)模型 按照表1的設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)表2的結(jié)果建立回歸方程如下：Y=0.018+3.333A×10-4+3.083B×10-4-1.667C×10-4+1.75D×10-4-1.75AB×10-4-1.25AC×10-4+AD×10-4-7.5BC×10-5+7.5BD×10-5-CD×10-4-4.833A2×10-4-7.458B2×10-4-5.833C2×10-4-3.708D2×10-4。

2.3.2 方差分析 二次多項(xiàng)式方差分析表見表3。由表3可知，該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，決定系數(shù)R2=0.98，調(diào)整后的Adj.R2=0.96均較高，失擬項(xiàng)P>0.05，說明模型失擬性不顯著，回歸模型擬合程度高。其中A、B、C、D、AB、AC、A2、B2、C2和D2對方程影響顯著。由各因素一次項(xiàng)F值的大小可知，影響(R,S)-告依春含量的因素主次順序?yàn)锳>B>D>C,即碳源影響最大，氮源次之，水和無機(jī)鹽影響作用較小。

2.3.3 雙因素交互分析及最優(yōu)值預(yù)測 二維等高線圖與三維效應(yīng)圖見圖4。隨著中藥比例和氮源比例及無機(jī)鹽和中藥比例逐漸增加，(R,S)-告依春含量逐漸升高，并在原點(diǎn)位置達(dá)到最高值。經(jīng)Design Expert軟件分析得到的最佳理論培養(yǎng)基成分為藥粉30.2%、黃豆粉10.27%、碳酸鈣0.198%和水59.91%，此條件下的每克發(fā)酵中藥中(R,S)-告依春含量為0.0184 mg/g。

2.3.4 驗(yàn)證性試驗(yàn) 結(jié)合具體試驗(yàn)條件，最終選取的最佳培養(yǎng)基成分為：中藥粉30%、黃豆粉10%、碳酸鈣0.2%和水59.8%。 經(jīng)3次重復(fù)固態(tài)發(fā)酵后，每克固態(tài)發(fā)酵物中(R,S)-告依春含量分別為0.0184、0.0182和0.0184 mg/g，平均值為0.0183 mg/g，與預(yù)測值標(biāo)準(zhǔn)差為0.001。真實(shí)值與預(yù)測值相吻度好，重現(xiàn)性良好，證明所得最佳培養(yǎng)基成分可靠。

肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05)；While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖3 碳源(A)、氮源(B)和無機(jī)鹽(C)對發(fā)酵中藥中(R,S)-告依春含量的影響Fig.3 Effects of carbon source (A),nitrogen source (B) and inorganic salt (C) on the content of epigoitrin in fermented traditional Chinese medicine

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及優(yōu)化結(jié)果

續(xù)表

表3 二次多項(xiàng)式模型方差分析表

A、B,氮源比例與中藥比例間的等高線圖與3D效果圖；C、D,無機(jī)鹽比例與中藥比例間的等高線圖與3D效果圖A and B,Contour plots and 3D renderings between nitrogen source and herb ratio;C and D,Contour plots and 3D renderings between inorganic salt and herb ratio圖4 各因素與指標(biāo)之間的等高線圖與3D效果圖Fig.4 Contour plots and 3D renderings between various factors and indicators

2.4 (R,S)-告依春含量比對

由圖5可知，水煎工藝、發(fā)酵工藝的出峰時(shí)間分別為16.713和16.704 min與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間16.848 min基本相符。發(fā)酵后的(R,S)-告依春含量為0.0184 mg/g，發(fā)酵前為0.0150 mg/g。在同等條件下，發(fā)酵后較發(fā)酵前的(R,S)-告依春含量提高了22.36%(P<0.01)。

圖5 水煎工藝(A)和發(fā)酵工藝(B)中(R,S)-告依春液相色譜圖Fig.5 Liquid chromatogram of epigoitrin in decoction process (A) and fermentation process (B)

3 討 論

芽孢桿菌菌體自身能合成蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶，以及可降解飼料中復(fù)雜碳水化合物的酶，如果膠酶、葡聚糖酶、纖維素酶等，其中很多是動物本身不具有的酶[12-14]。陶榮霞[15]研究了17株益生芽孢桿菌產(chǎn)酶能力，結(jié)果顯示，多數(shù)菌有產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶的能力，只有少數(shù)菌株具有微弱的產(chǎn)脂肪酶能力。本試驗(yàn)采用的發(fā)酵菌株可產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶和淀粉酶，但不產(chǎn)植酸酶和脂肪酶。

目前，有關(guān)益生菌生物發(fā)酵的研究報(bào)道很多，但多集中在液體發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵較少。王卉等[16]研究解淀粉芽孢桿菌L-S60的固態(tài)發(fā)酵工藝顯示，花生餅粉、麥麩和棉粕的質(zhì)量比為53∶35∶12，蛋白胨3.0 g/kg，葡萄糖2.0 g/kg，無水硫酸鎂0.2 g/kg時(shí)每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物中的解淀粉芽孢桿菌數(shù)十分理想。史同瑞等[17]研究解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵黃芪工藝顯示，培養(yǎng)基中含黃豆粉10%、黃芪粉30%、CaCO30.2%、水58.8%時(shí)，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物中的解淀粉芽孢桿菌數(shù)較為理想。秦宇軒等[18]研究解淀粉芽孢桿菌L-H15的固態(tài)發(fā)酵參數(shù)結(jié)果顯示，豆粕和麥麩質(zhì)量比為1∶2.8，稻殼20%，蛋白胨0.38%，乳糖0.2%時(shí)，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物中的解淀粉芽孢桿菌數(shù)可達(dá)1.68×1010CFU/g。上述研究結(jié)果均表明,在提供適當(dāng)比例的碳源、氮源和無機(jī)鹽情況下,解淀粉芽孢桿菌可在固體發(fā)酵培養(yǎng)物中良好生長。

本研究是對清肺中藥組方進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，由于中藥中含有較多的糖類成分可替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源，故沒有另外添加葡萄糖；經(jīng)解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵提取的清肺顆粒中(R,S)-告依春含量較傳統(tǒng)的水煎工藝顯著提高。同樣有一些益生芽孢桿菌對中藥進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，獲得了藥物有效成分含量顯著提高的結(jié)果。侯美如等[19]利用解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵黃芪，固態(tài)發(fā)酵物中多糖含量提高了39.59%，黃酮含量提高41.59%和皂苷含量提高22.63%。白海等[20]采用枯草芽孢桿菌等混合益生菌對中藥渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵物中蛋白質(zhì)含量提高了47.3%，多糖含量提高了1.4%。 丁嘉偉等[21]利用11種混合益生菌對青蒿藥渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵物中獲得了更高含量的雙氫青蒿酸、青蒿乙素和粗蛋白質(zhì)。朱慶賀等[22]應(yīng)用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵當(dāng)歸，固態(tài)發(fā)酵物中的多糖含量達(dá)24.91 mg/g，適合產(chǎn)業(yè)化推廣。但也有研究表明，益生菌的生物發(fā)酵會降低中藥中某種有效成分的含量。鄭言等[23]采用地衣芽孢桿菌對銀杏葉進(jìn)行了固態(tài)發(fā)酵，結(jié)果顯示發(fā)酵物中粗蛋白質(zhì)、粗灰分、粗脂肪和粗氨基酸含量均有提高，總黃酮和粗纖維含量卻大幅降低。綜上所述，合理利用益生菌并采用適宜條件進(jìn)行固體發(fā)酵在飼料添加劑領(lǐng)域和獸藥開發(fā)領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用潛力。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)篩選的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為清肺組方中藥粉30%、黃豆粉10%、CaCO30.2%和水59.8%。37 ℃固態(tài)發(fā)酵24 h，每克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物中(R,S)-告依春含量達(dá)0.0184 mg/g，較傳統(tǒng)水煎提取法提高了22.36%，優(yōu)化的固態(tài)發(fā)酵基料可促進(jìn)(R,S)-告依春含等活性成分釋放。