蟾皮標準關鍵控制指標的研究

程民 代磊 張婷

摘要：目的：建立蟾皮標準的關鍵控制指標。方法：采用TCL法鑒別蟾皮中華蟾酥毒基，依法測定重金屬及有害元素、33種禁用農藥、黃曲霉毒素等，UV法測定游離總生物堿的含量。結果：薄層鑒別特征顯著，藥材重金屬及有害元素不合格率為0.07%，33種禁用農藥和黃曲霉毒素均合格，游離總生物堿含量在0.05%～0.26%之間。結論：該方法簡單可行，專屬性強，重復性好，可用于蟾皮的質量控制。

關鍵詞：蟾皮;華蟾酥毒基;游離總生物堿

【中圖分類號】 Q969.35+8.6? ? 【文獻標識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）03--02

蟾皮為蟾蜍科動物中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor的干燥皮[1]，始載于《本草綱目拾遺》[2]，別名有蛤蚆皮、癩蟆皮、干蟾皮等，于夏秋季節(jié)捕捉，殺死或燙死，剝取外皮，貼于板上或撐開、干燥，具有清熱解毒，利水消脹的功效[3]，用于小兒疳積、咽喉腫痛、腫瘤。目前蟾皮的質量標準無國家標準，僅有幾個省的地方標準收載且質控指標少、簡單，標準不能全面反映和控制蟾皮質量的現(xiàn)狀，本研究采用UV法對5-羥色胺成分進行定量分析，TLC法對華蟾酥毒基進行鑒別，重點解決吲哚類生物堿成分質量控制方法的建立，同時按《中國藥典》2020年版四部方法對33種禁用農藥、重金屬及有害元素、黃曲霉毒素等進行考察，最終形成蟾皮多成分控制系統(tǒng)的科學、實用、先進、可控的蟾皮藥材質量標準。

1 材料

1.1? 主要儀器

Evolution220紫外可見分光光度計（賽默飛世爾科技（中國）有限公司），Agilent 8890-7000D氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜儀（安捷倫科技公司），Agilent 1290-6470液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜儀（安捷倫科技公司），Agilent 7800電感耦合等離子體質譜儀（安捷倫科技公司），Evolution220紫外可見分光光度計（賽默飛世爾科技（中國）有限公司），Linomat 5卡瑪半自動點樣儀（CAMAG），TLC Visualizer卡瑪薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（CAMAG），MARS6微波消解儀（培安有限公司），XPE56分析天平（梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

蟾皮對照藥材（批號：120963-201405，來源中國食品藥品檢定研究院），華蟾酥毒基對照品（批號：110803-201807，來源：中國食品藥品檢定研究院），33種禁用農藥混合對照品（批號：S057535，來源：天津阿爾塔科技有限公司），30種禁用農藥混合對照品（批號：S062923，來源：天津阿爾塔科技有限公司），磷酸三苯酯對照品（批號：120132-202009，來源：上海奈啟生物科技有限公司），黃曲霉毒素混合溶液（批號：61001-202006，來源：中國食品藥品檢定研究院），5-羥色胺鹽酸鹽對照品（批號：111656-202002，純度：97.8%，來源：中國食品藥品檢定研究院）;硅膠GF254板（TLC Silica gel 60 F254）（規(guī)格：10cm×20cm，廠家：Merck）;鹽酸、冰醋酸、對二甲氨基苯甲醛等試劑均為分析純。

15批蟾皮均經(jīng)安徽省中藥材標準編制工作專家委員會鑒定，見表1。

2 方法與結果

2.1薄層鑒別

取本品粗粉1.0g，加甲醇20ml，超聲處理30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2ml使溶解，作為供試品溶液。另取干蟾皮對照藥材1.0g，同法制成對照藥材溶液。另取華蟾酥毒基對照品，加甲醇制成1ml含0.2mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部 通則0502）試驗，吸取上述三種溶液各5～10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮（4：3：3）為展開劑，展開，取出，晾干。噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰，置紫外燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。詳見圖1。

2.2重金屬及有害元素

按《中國藥典》2020年版四部2321鉛、鎘、砷、汞、銅測定法中的電感耦合等離子體質譜法對15個批次的樣品進行檢查，15批樣品中有一批超出《中國藥典》2020年版重金屬及有害元素標準要求，超標元素為汞元素，不合格率為0.07%，結果見表2。

2.3 33種禁用農藥

按《中國藥典》2020年版四部通則2341農藥殘留量測定法第五法（氣相色譜-串聯(lián)質譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質譜法）對15個批次的樣品進行檢查，15個批次的蟾皮按照《中國藥典》2020年版的標準禁用農藥殘留項均合格，沒有超標的存在，但蟾皮中禁用農藥檢出率為86.7%，該現(xiàn)象可能是蟾蜍在未代謝掉的環(huán)境中進食產生了富集現(xiàn)象，結果見表2。

2.4 黃曲霉毒素

按《中國藥典》2020年版四部通則2351真菌毒素測定法中的第二法（液相色譜-串聯(lián)質譜法）對15個批次的樣品進行檢查，15批蟾皮藥材黃曲霉毒素均為未檢出，結果見表2。

2.5 游離總生物堿含量測定

2.5.1檢測波長的選擇

根據(jù)蟾皮藥材所含成分的理化特性，以及《中國藥典》2020年版四部、各地方標準中記載、相關文獻報道對蟾皮的研究，使用紫外-可見分光光度計為測定儀器，選定555nm為檢測波長。

2.5.2 顯色劑用量的選擇

制備樣品做反應液用量的考察，分別取1.0 ml， 1. 5 ml， 2.0 ml樣品液，再分別加1%冰醋酸溶液（1.0 ml， 0. 5 ml， 0 ml）補至2 ml，加入15%對二甲氨基苯甲醛鹽酸溶液2 ml，反應30min 后測定，結果3種測定結果近似，無顯著性差異，為了減少操作步驟和誤差，最終確定選用2.0 ml樣品液加入反應液2.0 ml進行反應。

2.5.3 樣品的提取方法

取本品粗粉（過10目篩）約300 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加1%冰醋酸溶液25ml，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40kHz） 30分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用1%冰醋酸溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4 樣品濃度與峰面積之間的線性關系考察

精密稱取5-羥色胺鹽酸鹽對照品，用水配制成濃度為0.072mg/ml的濃溶液，搖勻。精密量取0.25 ml、0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml、4.0 ml置5ml量瓶中，加入水至刻度，搖勻。取2 ml上述對照品溶液，加15%對二甲氨基苯甲醛鹽酸（2→3）溶液2 ml，搖勻，室溫放置30分鐘，照紫外-可見分光光度法 （通則0401），以相應試劑空白，在555nm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，其回歸方程為：y=0.07392+0.01840x，R=0.9967。

2.5.5? 精密度試驗

精密吸取同一濃度對照品溶液，重復測定6次，進行精密度試驗，結果5-羥色胺RSD為0.05%，表明精密度良好。

2.5.6 樣品穩(wěn)定性試驗

按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，室溫下自然放置，分別于0、15、30、45、60、90、120分鐘測定含量，結果樣品放置2小時后，RSD為3.08%;0-45分鐘的RSD為1.72%，故樣品在45分鐘內穩(wěn)定性良好。

2.5.7? 樣品重復性試驗

分別精密稱取6份，按照上述樣品的提取處理方法，對樣品進行提取處理。結果5-羥色胺RSD為0.61%，表明該方法有良好的重復性。

2.5.8? 回收率試驗

采用加樣回收法，精密稱取5份已知含量同一批號的樣品150 mg，分別精密加入對照品溶液（0.072 mg/ml）5 ml，各加入20 ml1%冰醋酸溶液，稱重。超聲30 min，補足失重。濾紙過濾后，水性過濾頭過濾，各取2 ml上述續(xù)濾液，加15%對二甲氨基苯甲醛鹽酸（2→3）溶液2 ml，搖勻，室溫放置30分鐘，照紫外-可見分光光度法 （ 通則0401 ），以相應試劑空白，在555nm的波長處測定吸收度，結果平均回收率為98.57%，相對標準偏差為2.03%，，表明方法準確性良好，結果見表3。

2.5.9? 樣品含量測定

按上述方法測定各批號蟾皮中游離總生物堿含量，計算含量結果，即得。結果見表7。

3討論

3.1 TCL條件的篩選 本實驗根據(jù)文獻報道[4][5][6]，選用脂蟾毒配基、華蟾酥毒基、沙蟾毒精對照品，比較了三氯甲烷-甲醇（9：1）和環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮（4：3：3）展開劑系統(tǒng)，對供試品溶液制備方法、不同點樣量、不同點樣方式、3種不同廠家薄層版、不同溫度不同濕度、預平衡進行了考察，結果個別供試品色譜中，在與脂蟾毒配基、沙蟾毒精對照品色譜相應的位置上，熒光斑點不清晰，分析原因為脂蟾毒配基、沙蟾毒精在蟾皮中含量低，受蟾皮加工方式的影響，會導致脂蟾毒配基、沙蟾毒精在蟾皮中批間差異大，故將此薄層色譜鑒別方法中僅選用華蟾酥毒基對照品，結果該方法專屬性、耐用性強，薄層鑒別特征顯著。

3.2 超聲提取時間的選擇

分別精密稱取相同重量樣品3份，分別加入25ml 1%冰醋酸溶液，稱重，以上各樣按不同超聲時間處理，分別為30 min， 60 min和90 min，超聲，補足失重，濾紙濾過，0.45 μm過濾頭濾過，各取2 ml續(xù)濾液，分別加入15%對二甲氨基苯甲醛鹽酸溶液2 ml，反應30min 后測定，于紫外-分光光度計555nm處測定相應吸光度。結果超聲30分鐘和60分鐘含量近似，因此選取超聲提取30 min。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（四部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：558.

[2]周謐，傅興圣.不同采收情況與干蟾皮中酯類成分含量對比研究[J].海峽醫(yī)藥，2018，30（10）：41-44.

[3]李寶晶，，吳炎，王磊，等.蟾皮中的蟾蜍甾烯類成分及其細胞毒活性研究[J].中草藥，2021，52（10）：2876-2883.

[4]周謐，傅興圣，朱琳，等.干蟾皮藥材質量標準研究[J].藥學與臨床研究，2017，25（3）：209-212.

[5]喻昌燕，孟令杰，姜念，等.蟾皮化學成分和藥理活性的研究進展[J].中草藥，2021，52（4）：1206-1220.

[6]焦安妮，于敏，李蕾，等.高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定干蟾皮中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基[J].中草藥，2019，50（15）：3687-3690.