高校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物質(zhì)量控制研究與創(chuàng)新實(shí)踐

張志妮 ,楊力衡 ,嚴(yán) 楚 ,蔡衛(wèi)斌?

(1.中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,廣州 510006;2.廣州市白云區(qū)畜牧獸醫(yī)站,廣州 510550)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為“活的精密儀器”,是生命科學(xué)研究中必須具備的四大基本條件之一,涉及疾病機(jī)制研究、治療方法研究、疫苗研究與評(píng)價(jià)等多個(gè)領(lǐng)域。截止至2019 年7 月,在過(guò)去30 年里,涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物論文中,PubMed 論文數(shù)據(jù)庫(kù)論文154 萬(wàn)篇,占生物醫(yī)學(xué)論文的79%,藥學(xué)尤其是毒理、安全性評(píng)價(jià)論文 占85%,Nature、Science、Cell、Nature Medicine、Nature Genetics、Nature Cell Biology、Nature Biotechnology、Jouranl of Experimental Medicine 等國(guó)際一流學(xué)術(shù)雜志有22 萬(wàn)篇、占77%,而我國(guó)在2013～2015 年間則有32844 篇、占7%,從1901～2018 年的81 年度(占頒獎(jiǎng)年度的75%)諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)涉及25 種動(dòng)物,被應(yīng)用了168 次[1]。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量直接關(guān)系著研究和評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、可靠性和可重復(fù)性,動(dòng)物感染烈性傳染病后極易集體死亡、實(shí)驗(yàn)中斷,且攜帶人畜共患傳染病菌動(dòng)物不僅威脅實(shí)驗(yàn)人員健康,一旦擴(kuò)散還將產(chǎn)生嚴(yán)重的公共衛(wèi)生安全。如實(shí)驗(yàn)室源性感染事件有2019 年某研究所布魯氏菌感染、2011 年某高校教學(xué)山羊布氏桿菌感染[2],實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獲得性病原感染事件有2006 年某高校流行性出血熱感染[3]、2004年實(shí)驗(yàn)室人員感染流行性出血熱[4]、20 世紀(jì)末全國(guó)各地實(shí)驗(yàn)大鼠和工作人員流行性出血熱高陽(yáng)性率[5]等。

高校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,為集教學(xué)、科研及生產(chǎn)三位一體的公共服務(wù)性平臺(tái),支撐了學(xué)校及附屬醫(yī)院的醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生命科學(xué)、化工、農(nóng)學(xué)、材料等多學(xué)科教學(xué)和科研的重要技術(shù)服務(wù)。隨著新技術(shù)、新研究方法的不斷發(fā)展,基因修飾動(dòng)物亦被作為重要、常用的研究對(duì)象,多從不同國(guó)家、研究機(jī)構(gòu)引入。動(dòng)物來(lái)源復(fù)雜,高?？蒲卸鄬W(xué)科、多方向,實(shí)驗(yàn)類型復(fù)雜,實(shí)驗(yàn)時(shí)間不確定性,學(xué)生為主體的實(shí)驗(yàn)人員流量大、流動(dòng)性強(qiáng)等等,均易造成病原菌的傳入、交叉感染和傳播擴(kuò)散[6]。本研究旨在總結(jié)和探討近年來(lái)的病原控制制度和檢測(cè)工作成效和心得。

1 建立了病原控制制度

建立并執(zhí)行了《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)入制度》,從制度方面加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源管理和質(zhì)量控制,規(guī)范實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)入動(dòng)物設(shè)施。具體措施如下。

1.1 規(guī)范動(dòng)物來(lái)源

切斷傳染源,是傳染病控制最有效措施,安全、可靠的動(dòng)物來(lái)源,是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原控制的源頭和關(guān)鍵。據(jù)監(jiān)測(cè)病原檢出率將動(dòng)物來(lái)源分等級(jí):一級(jí)(最高級(jí)):即至少連續(xù)暗檢3 次,病原檢測(cè)均為陰性的生產(chǎn)設(shè)施動(dòng)物來(lái)源;二級(jí):不滿足一級(jí)、三～五級(jí)來(lái)源的生產(chǎn)設(shè)施動(dòng)物來(lái)源;三級(jí):自檢、暗檢、抽檢和常規(guī)檢疫中出現(xiàn)非人蓄共患病病原、非動(dòng)物烈性傳染病病原、一般為條件致病菌陽(yáng)性的生產(chǎn)設(shè)施動(dòng)物來(lái)源,動(dòng)物退出設(shè)施,6 個(gè)月內(nèi)不接收相同來(lái)源動(dòng)物;四級(jí):動(dòng)物烈性傳染病病原陽(yáng)性的生產(chǎn)設(shè)施動(dòng)物來(lái)源,1 年內(nèi)禁止該來(lái)源動(dòng)物進(jìn)入設(shè)施;五級(jí):人蓄共患病病原陽(yáng)性的生產(chǎn)設(shè)施動(dòng)物來(lái)源,按國(guó)家相關(guān)法規(guī)法律處理。

進(jìn)入動(dòng)物設(shè)施的常規(guī)動(dòng)物(含突變系),需提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明,銷售清單、送貨單/簽收單、近3～6 個(gè)月內(nèi)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)報(bào)告(包含實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求的相應(yīng)等級(jí)單位病原檢測(cè)項(xiàng)目,結(jié)果均為合格),境外來(lái)源需提供來(lái)源機(jī)構(gòu)的獸醫(yī)報(bào)告(標(biāo)明病原檢測(cè)項(xiàng)目及結(jié)果)和海關(guān)認(rèn)可的入關(guān)隔離檢疫場(chǎng)所隔離檢疫報(bào)告;基因修飾動(dòng)物原則上均需通過(guò)生物凈化(一般是經(jīng)典的剖宮產(chǎn)代乳凈化技術(shù)或體外受精及胚胎移植技術(shù))達(dá)SPF級(jí),或達(dá)國(guó)標(biāo)清潔級(jí)+SPF 級(jí)必須檢測(cè)和必要時(shí)檢測(cè)病原檢測(cè)合格(以下稱“活檢”) 的相關(guān)證明材料[7-9]。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施功能分區(qū)和檢疫管理

高校動(dòng)物中心可能因歷史原因、不同校區(qū)的需求、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物繁育保種、科研多學(xué)科和多方向、實(shí)驗(yàn)類型和來(lái)源復(fù)雜、學(xué)生流動(dòng)性大等情況,動(dòng)物設(shè)施分布于不同校區(qū)、不同樓宇,可按功能進(jìn)行分區(qū)并執(zhí)行針對(duì)性管理措施:

1.2.1 屏障環(huán)境繁育區(qū)

繁育區(qū)使用于基因修飾動(dòng)物的保種繁育,不涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。進(jìn)入該區(qū)的基因修飾動(dòng)物必須執(zhí)行生物凈化或活檢(動(dòng)物不適用于活檢時(shí),可用同籠飼養(yǎng)至少30 d 以上的哨兵動(dòng)物活檢替代);進(jìn)入該區(qū)的野生型動(dòng)物,一級(jí)來(lái)源的常規(guī)動(dòng)物(含突變系)需經(jīng)檢測(cè)證實(shí)監(jiān)測(cè)病原為陰性(監(jiān)測(cè)病原項(xiàng)目詳見表1,每年綜合檢測(cè)成本、病原菌的致病性、對(duì)常見動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的干擾程度及過(guò)往檢測(cè)數(shù)據(jù),及時(shí)持續(xù)更新監(jiān)測(cè)病原譜。);二級(jí)來(lái)源動(dòng)物則執(zhí)行活檢。其余情況執(zhí)行“1.1 規(guī)范動(dòng)物來(lái)源”的內(nèi)容。

表1 2018～2021 年大、小鼠監(jiān)測(cè)病原譜Table 1 Objective monitoring pathogen genealogy of rat and mouse form 2018 to 2021

1.2.2 屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)區(qū)

該區(qū)僅開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn),禁止繁殖。執(zhí)行“邊檢疫、邊實(shí)驗(yàn)、重防范”原則,動(dòng)物進(jìn)入該區(qū)前,一級(jí)來(lái)源動(dòng)物需經(jīng)檢疫期的健康觀察;二級(jí)來(lái)源動(dòng)物經(jīng)檢測(cè)證實(shí)監(jiān)測(cè)病原為陰性。其余情況執(zhí)行“1.1 規(guī)范動(dòng)物來(lái)源”的內(nèi)容。

1.2.3 普通環(huán)境實(shí)驗(yàn)區(qū)

該區(qū)僅開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn),禁止繁殖。進(jìn)入該區(qū)的動(dòng)物需經(jīng)檢疫期的健康觀察。其余情況執(zhí)行“1.1規(guī)范動(dòng)物來(lái)源”的內(nèi)容。

1.2.4 暫養(yǎng)區(qū)

該區(qū)執(zhí)行屏障設(shè)施的硬件及管理要求,僅用于動(dòng)物經(jīng)影像檢測(cè)、手術(shù)、行為學(xué)觀察或其他屏障外操作后,需短期飼養(yǎng)、但又無(wú)法返回屏障設(shè)施的情況,管理人員嚴(yán)格把控實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)規(guī)模和周期。

1.3 在養(yǎng)動(dòng)物的病原監(jiān)測(cè)

1.3.1 病原監(jiān)測(cè)

繁殖區(qū)采用哨兵動(dòng)物監(jiān)測(cè)(臟墊料法)[10-12],監(jiān)測(cè)現(xiàn)行國(guó)標(biāo)清潔級(jí)+SPF 級(jí)病原,增添國(guó)內(nèi)外流行且對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)影響較大的病原,如小鼠諾如病毒、牛棒狀桿菌等,據(jù)監(jiān)測(cè)結(jié)果,提供快速預(yù)警從而控制病原微生物感染和擴(kuò)散,并為檢疫期監(jiān)測(cè)病原譜的更新提供數(shù)據(jù)支持;其他區(qū)域主要執(zhí)行個(gè)性化的獸醫(yī)護(hù)理[13]。

1.3.2 獸醫(yī)護(hù)理

在獸醫(yī)指導(dǎo)、培訓(xùn)下,每位飼養(yǎng)工作人員、設(shè)施管理人員執(zhí)行日常獸醫(yī)護(hù)理、巡房工作,觀察動(dòng)物日常健康狀況,發(fā)現(xiàn)異常動(dòng)物及時(shí)上報(bào)獸醫(yī),經(jīng)檢測(cè)診斷后執(zhí)行相應(yīng)的防控、處理措施。獸醫(yī)則對(duì)設(shè)施進(jìn)行定期的巡視檢查、獸醫(yī)護(hù)理工作現(xiàn)場(chǎng)指導(dǎo)、病原控制和動(dòng)物福利措施的落實(shí)情況監(jiān)督等[13]。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的“點(diǎn)對(duì)點(diǎn)”運(yùn)輸

1.4.1 動(dòng)物進(jìn)入設(shè)施

因動(dòng)物來(lái)源復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)者流動(dòng)性大等情況,動(dòng)物的運(yùn)輸除符合國(guó)標(biāo)要求外[9],執(zhí)行“點(diǎn)對(duì)點(diǎn)”動(dòng)物轉(zhuǎn)運(yùn)管理制度,即實(shí)驗(yàn)者聯(lián)系供應(yīng)商訂購(gòu)動(dòng)物后,供應(yīng)商與待進(jìn)入設(shè)施的管理人員執(zhí)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物交接,實(shí)驗(yàn)者與設(shè)施工作人員將動(dòng)物接收入設(shè)施內(nèi)。

1.4.2 動(dòng)物離開設(shè)施

屏障設(shè)施內(nèi)待移出的動(dòng)物,應(yīng)滿足包裝規(guī)范、保障生存環(huán)境、有專用通道、不被周圍人群直視等要求,用專用包裝盒,在屏障設(shè)施內(nèi)包裝后方可移出,普通環(huán)境移出的動(dòng)物,需于運(yùn)輸籠具上覆蓋透氣遮布[9]。

1.5 動(dòng)物相關(guān)用品的監(jiān)測(cè)

應(yīng)根據(jù)國(guó)標(biāo)要求,需定期監(jiān)測(cè)的項(xiàng)目可有:設(shè)施環(huán)境技術(shù)因子、動(dòng)物相關(guān)用品如動(dòng)物飲用水和墊料、高壓爐的滅菌效果和飼料等[9,14]。

2 病原檢測(cè)工作

2018 年以來(lái),在檢測(cè)了1481 批次非活體檢實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本中,包括動(dòng)物糞便、皮膚拭子、鼻咽拭子、血清、毛發(fā)等,有106 批次病原陽(yáng)性,其中的15批小鼠肝炎病毒(Mousehepatitisvirus,MHV)陽(yáng)性小鼠立即撤場(chǎng),動(dòng)物執(zhí)行安樂(lè)死后經(jīng)高壓滅菌器滅菌,動(dòng)物尸體裝入專用尸體袋存放于尸體冷藏柜,集中作無(wú)害化處理。檢疫飼養(yǎng)區(qū)域處理如下:管制進(jìn)出,封閉送風(fēng)、排風(fēng)口;使用殺滅病原菌濃度的消毒 液(如 0.13～ 0.26 mol/L 過(guò)氧乙酸按0.008 L/m3)對(duì)飼養(yǎng)空間、角落、縫隙和物品表面進(jìn)行噴霧消毒,密封24 h 后,開啟送風(fēng)、排風(fēng)口;移出的動(dòng)物籠具、相關(guān)物品及廢棄物等先行高壓滅菌或殺滅病原菌濃度消毒液浸泡消毒后,執(zhí)行實(shí)驗(yàn)廢棄物相關(guān)規(guī)定處理;管制進(jìn)出至少3 個(gè)月,重新啟用前,封閉送風(fēng)、排風(fēng)口執(zhí)行區(qū)域凈化處理,空氣潔凈度和落下菌數(shù)合格后方可投入使用。同時(shí),嚴(yán)密監(jiān)控飼養(yǎng)區(qū)域的其他動(dòng)物,并一年內(nèi)禁止同來(lái)源的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)入;檢測(cè)了395 份活體動(dòng)物樣本,其中38例病原陽(yáng)性,檢疫期病原檢測(cè)陽(yáng)性動(dòng)物均立即退出了設(shè)施。非活體動(dòng)物樣本的監(jiān)測(cè)病原陽(yáng)性批次比例至2021 年達(dá)17.72%,說(shuō)明動(dòng)物入場(chǎng)前的病原監(jiān)測(cè)是非常必要的。活體檢測(cè)的陽(yáng)性率自2019 年出現(xiàn)下降,則主要是部分基因修飾動(dòng)物執(zhí)行了生物凈化。具體情況詳見表2。

表2 2018～2021 年病原檢測(cè)Table 2 Pathogen detection form 2018 to 2021

從動(dòng)物來(lái)源方面看,2018 年監(jiān)測(cè)的動(dòng)物來(lái)源有12 家,2021 年已達(dá)27 家,呈逐年上升趨勢(shì),動(dòng)物來(lái)源愈趨復(fù)雜、多樣,動(dòng)物質(zhì)量良莠不齊,但總體質(zhì)量水平有所提高。詳見表3。

表3 2018～2021 年供應(yīng)單位來(lái)源Table 3 Supply units form 2018 to 2021

3 討論

在上述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病原檢測(cè)和質(zhì)量控制過(guò)程中,我們發(fā)現(xiàn)病原監(jiān)測(cè)是保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的有效防線。首先,能有效地切斷傳染源,通過(guò)設(shè)施的功能分區(qū),不同功能區(qū)域執(zhí)行了不同的檢疫制管理度、監(jiān)測(cè)病原譜的及時(shí)更新、動(dòng)物相關(guān)用品等的定期檢測(cè),杜絕了攜帶陽(yáng)性病原的動(dòng)物和動(dòng)物用品的進(jìn)入,使得設(shè)施規(guī)避了污染風(fēng)險(xiǎn);檢疫期嚴(yán)密監(jiān)控小鼠肝炎病毒,將數(shù)批陽(yáng)性動(dòng)物排除在設(shè)施之外,哨兵動(dòng)物的檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)了此舉的必要性;鞭毛蟲為陽(yáng)性檢出率較高的寄生蟲之一,而檢疫期的檢測(cè)排除、哨兵動(dòng)物的監(jiān)測(cè)、在養(yǎng)動(dòng)物的糞便排查和抽查工作,也是控制該寄生蟲的有效措施;動(dòng)物飲用水的定期無(wú)菌檢測(cè)、高壓爐滅菌效果和環(huán)境技術(shù)因子的定期監(jiān)測(cè),為設(shè)施的水機(jī)和高壓爐使用效果是否合格、維護(hù)措施是否得當(dāng)、日常消毒管理工作是否到位等做出客觀的數(shù)據(jù)支持。其次,陽(yáng)性病原的檢出,為設(shè)施消除了病原傳播隱患,中心曾在老舊設(shè)施的動(dòng)物糞便中,檢出MHV、鞭毛蟲陽(yáng)性,爾后返回至其飼養(yǎng)區(qū)域進(jìn)行合并樣本排查,發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性后,對(duì)陽(yáng)性樣本的覆蓋區(qū)域的課題組信息梳理、歸類后,進(jìn)行課題組合并樣本檢測(cè)或單籠檢測(cè),均發(fā)現(xiàn)病原陽(yáng)性動(dòng)物集中于某一課題組、甚至于同一品系,經(jīng)綜合分析后考慮,病原為課題組違規(guī)操作攜帶進(jìn)入設(shè)施所致。隨之進(jìn)行的全面排查、定點(diǎn)抽查和哨兵動(dòng)物監(jiān)測(cè)結(jié)果均提示,該病原陽(yáng)性動(dòng)物轉(zhuǎn)入設(shè)施的時(shí)間較短,發(fā)現(xiàn)及時(shí),均未造成擴(kuò)散傳播?？梢娪行У牟≡瓩z測(cè)措施,在阻止病原于設(shè)施內(nèi)的傳播隱患方面效果顯著。

隨著時(shí)代的發(fā)展,各領(lǐng)域基礎(chǔ)研究突飛猛進(jìn),產(chǎn)業(yè)發(fā)展異常迅猛,各學(xué)科交叉融合,國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)設(shè)施呈井噴狀建設(shè),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物需求量更是暴增,高校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心作為重要的基礎(chǔ)性支撐服務(wù)平臺(tái),保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量和生物安全防控是平臺(tái)核心工作,通過(guò)有效的病原控制、優(yōu)質(zhì)的科研服務(wù),以期為學(xué)?！半p一流”建設(shè)和國(guó)家相關(guān)學(xué)科領(lǐng)域發(fā)展做出更大的貢獻(xiàn)。