利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析高溫處理對人參皂苷的轉(zhuǎn)化規(guī)律

張語遲，劉箬瑤，劉春明，李賽男

(長春師范大學(xué)中心實驗室，吉林 長春 130032)

人參(PanaxginsengC．A．Mey)是我國傳統(tǒng)的藥材，用藥歷史已有兩千多年，其中人參皂苷是其有效成分之一，在抗腫瘤、抗衰老、益智、強心及造血等方面具有較強的藥理活性[1-5]。人參的常壓蒸制品稱為“紅參”，由于在蒸制過程中皂苷發(fā)生轉(zhuǎn)化，因此紅參與人參在臨床上具有不同的療效。人參經(jīng)過高壓蒸制皂苷會進(jìn)一步發(fā)生轉(zhuǎn)化，生成了常壓蒸制時所沒有的皂苷，因此可以進(jìn)一步地改變?nèi)藚⒌呐R床藥效。

近年來，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)已被廣泛用于皂苷類化合物的快速分析研究[6-9]。該技術(shù)集液相色譜對復(fù)雜體系的高分離能力和質(zhì)譜獨特的選擇性、靈敏度、相對分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)信息于一體，特別是電噴霧(ESI)技術(shù)，僅需要微量的樣品，在短時間內(nèi)就能獲取化合物結(jié)構(gòu)和相對分子質(zhì)量信息，為研究熱不穩(wěn)定和極性較大的化合物提供了有利的分析方法[10-12]。因此，本文利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對經(jīng)過高溫處理的人參與未經(jīng)過處理的對照藥材進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并重點對高溫處理前后人參皂苷的轉(zhuǎn)化規(guī)律進(jìn)行了研究。為人參炮制及加工過程中人參皂苷的轉(zhuǎn)化提供了理論基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

鮮人參購自長春市御真堂藥店，由長春師范大學(xué)張語遲副教授鑒定，為五加科植物人參的新鮮根和根莖。人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，批號為Rb1：20201105；Rb2：20200815；Rc：20201205；Rd：20210520；Re：20201020；Rg1：20201009)，乙腈、醋酸為色譜純(美國Thermo-Fisher公司，批號為乙腈：150941；醋酸：172036)。

Waters 2695型高效液相色譜儀，配備Waters 2996 diode array detector檢測器 ；Finnigan LCQTM型電噴霧離子阱質(zhì)譜儀(美國Thermo-Finnigan公司)；高壓蒸鍋(力辰科技，LHS-12B型)。

1.2 實驗方法

1.2.1 HPLC-ESI-MS分析條件

色譜條件：色譜柱為日本資生堂Shiseido-CAPCELL，C18-ODS (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A為乙腈，流動相B為0.2%醋酸水溶液。洗脫條件為 0～50 min：25%～50%A、75%～50%B；50～140 min：50%～90%A、50%～10% B；140～150 min：90%～100%A、10%～0 B。流速：0.5 mL/min；檢測波長：195 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量:10 μL。質(zhì)譜條件為噴霧電壓：4.5 kV，金屬毛細(xì)管溫度：250℃，鞘氣為N2，壓力為680 kPa，輔助氣體為He, 其壓力為100 kPa，分析條件采用負(fù)離子模式，掃描范圍為：50～2 000。

1.2.2 樣品制備

分別稱取經(jīng)120℃蒸制3 h的人參樣品與未經(jīng)過蒸制的對照藥材各2 g，均加入30 mL三氯甲烷置索氏提取器中加熱回流2 h，然后將2份粉末倒入50 mL錐形瓶中，均加入40 mL飽和正丁醇進(jìn)行超聲提取，均在30℃、500 W的條件下超聲提取1 h，濾過，濾液常壓蒸干。用甲醇、吡啶定容于10 mL量瓶中，備用。

2 結(jié)果與討論

對未經(jīng)蒸制的人參與120℃下蒸制3 h的樣品中的人參皂苷的轉(zhuǎn)化規(guī)律進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，經(jīng)過蒸制的人參與對照藥材所含皂苷種類與含量明顯不同，利用液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，在負(fù)離子模式下對皂苷轉(zhuǎn)化規(guī)律進(jìn)行了系統(tǒng)研究，其未經(jīng)蒸制的人參與經(jīng)過蒸制的人參液相色譜圖見圖1和圖2。

圖1 未經(jīng)蒸制的人參與總離子流圖

圖2 120℃下蒸制的人參與總離子流圖

結(jié)果表明，在經(jīng)過蒸制的人參中共檢測到24個主要化學(xué)成分，利用液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析化合物1—24的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)果見表1。利用該數(shù)據(jù)結(jié)合圖1和圖2可以直觀地分析蒸制過程中皂苷的轉(zhuǎn)化情況。

表1 人參皂苷的液質(zhì)聯(lián)用數(shù)據(jù)

續(xù)表

結(jié)果表明，經(jīng)過高溫蒸制的人參皂苷種類與含量均發(fā)生明顯的變化，最大的特征在于人參皂苷Re、Rg1、Ac-Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rs1、Rs2含量減少，而人參皂苷Rg6、F4、Rk3、Rh4、20S-Rg3、20R-Rg3、Rk1、Rg5、20S-Rh1、20R-Rh1含量顯著增多，可以通過質(zhì)譜信息并結(jié)合人參皂苷結(jié)構(gòu)分析人參皂苷的轉(zhuǎn)化過程。

人參皂苷Re為三醇型皂苷，在皂苷元3位上連接羥基，6位上連接葡萄糖基，在20位上連接葡萄糖基和鼠李糖基。由于連接6位葡萄糖基的端基碳為仲碳糖基，性質(zhì)較穩(wěn)定，而20位連接雙糖基的端基碳為叔碳糖基，性質(zhì)較活潑，在高溫蒸制的過程中20位的雙糖基發(fā)生水解，將原來的雙糖基由羥基取代。從而生成了人參皂苷Rg2，但是人參皂苷Rg2的含量并沒有隨著蒸制的進(jìn)行而上升，原因在于人參皂苷的20位叔碳的不穩(wěn)定性，在蒸制過程中Rg2又進(jìn)一步發(fā)生了轉(zhuǎn)化，在三醇型皂苷20/22位之間和20/21位之間發(fā)生了脫水反應(yīng)。生成了不飽和的人參皂苷Rg2，即人參皂苷F4與Rg6。反應(yīng)過程見圖3。

圖3 人參皂苷Re轉(zhuǎn)化為人參皂苷F4和Rg6的原理圖

同理，人參皂苷Rg1也為三醇型皂苷，在皂苷元3位上連接羥基，在6位與20位上均連接葡萄糖基。在高溫蒸制的過程中20位的雙糖基發(fā)生水解，將原來的雙糖基由羥基取代。從而生成了人參皂苷Rh1，在蒸制過程中Rh1又進(jìn)一步發(fā)生了轉(zhuǎn)化，在三醇型皂苷20/22位之間和20/21位之間發(fā)生了脫水反應(yīng)。生成了不飽和的人參皂苷Rh1，即人參皂苷Rk3與Rh4。此外，高溫蒸制后產(chǎn)生了17、18、19、20、21、22、23、24號8個色譜峰，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)并結(jié)合色譜相對保留時間確定為人參皂苷20S-Rg3、20R-Rg3、20S-Rs3和 20R-Rs3、Rk1、Rg5、20S-Rh1、20R-Rh1。人參皂苷Rs1與人參皂苷Rs2為二醇型皂苷，在A型皂苷元3位上均連接雙葡萄糖基和一個乙酰基，在20位分別連接葡萄糖-吡喃型阿拉伯糖和葡萄糖-呋喃型阿拉伯糖，在高溫蒸制的過程中20位的雙糖基發(fā)生水解，將原來的雙糖基由羥基取代。從而生成了人參皂苷Rs3。

除人參皂苷Rs1和Rs2外，人參中另含有大量的二醇型皂苷，包括人參皂苷Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd。這類皂苷結(jié)構(gòu)的共同特點為均在3位上連接雙葡萄糖基，區(qū)別在于在20位連接的糖基不同，經(jīng)過高溫蒸制時20位叔碳糖連接的糖基發(fā)生水解，各種二醇型皂苷20位原來的糖基均由羥基取代，從而所有的二醇型皂苷在高溫蒸制時均產(chǎn)生了同樣的皂苷，即3位上連接雙葡萄糖，20位上連接羥基，即人參皂苷20S-Rg3和20R-Rg3。同理，在生成的過程中由于20位碳不穩(wěn)定可以脫去一分子水生成不飽和的人參皂苷20S-Rg3和20R-Rg3，即人參皂苷Rk1和Rg5，由于二醇型人參皂苷水解產(chǎn)物均為人參皂苷20S-Rg3、20R-Rg3、Rk1和Rg5，導(dǎo)致該四種產(chǎn)物含量極高，反應(yīng)過程見圖4。

圖4 人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd轉(zhuǎn)化為人參皂苷20S-Rg3、20R-Rg3、Rk1和Rg5的原理圖

為了驗證該信息，選取人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd標(biāo)準(zhǔn)品各2 mg，混合后用10 mL水溶解，于120℃處理2 h，處理結(jié)束后將皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的蒸制品取出，將水蒸干，用甲醇定容于10 mL量瓶中，電噴霧質(zhì)譜進(jìn)行分析。皂苷標(biāo)準(zhǔn)品蒸制后產(chǎn)生了荷質(zhì)比為783.55和765.55離子，為人參皂苷20S-Rg3、20R-Rg3、Rk1和Rg5。

3 結(jié)論

120℃處理人參可以改變?nèi)藚⒃碥辗N類與含量，人參皂苷Re、Rg2水解為人參皂苷Rg6和F4，人參皂苷Rg1水解為Rk1、Rk3和Rh4，二醇型人參皂苷Rs1和Rs2水解為人參皂苷Rs3，除人參皂苷Rs1和Rs2外，其余人參皂苷均水解生成人參皂苷20S-Rg3、20R-Rg3、Rk1和Rg5。其原理在于人參皂苷元3位與6位的端基碳為仲碳糖基，性質(zhì)較穩(wěn)定，在高溫處理時不發(fā)生水解，而皂苷元20位端基碳為叔碳糖基，性質(zhì)不穩(wěn)定，在高溫處理時發(fā)生水解，將20位碳上連接的糖基全部水解掉，在水解的同時伴隨著脫水反應(yīng)，故而生成了一系列不飽和皂苷。利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是研究人參皂苷類化合物的快捷、準(zhǔn)確的方法，可以實現(xiàn)提取物中皂苷類化合物的分離和分析同步完成，適合復(fù)雜提取物中化學(xué)成分的快速分析。