利用TAIL-PCR克隆Gluconobacter suboxydans葡萄糖脫氫酶基因及其生物信息學(xué)分析

戴寶新，馮惠勇，李天明，劉天佳,3，劉靜文，儀 宏,*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，河北 石家莊 050018；3.河北常山生化藥業(yè)股份有限公司，河北 石家莊 050018）

利用TAIL-PCR克隆Gluconobacter suboxydans葡萄糖脫氫酶基因及其生物信息學(xué)分析

戴寶新1,2，馮惠勇1，李天明1，劉天佳1,3，劉靜文1，儀 宏1,*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，河北 石家莊 050018；3.河北常山生化藥業(yè)股份有限公司，河北 石家莊 050018）

以Gluconobacter suboxydans J菌株基因組DNA為模板，基于吡咯喹啉醌附著位點的保守區(qū)域設(shè)計引物，通過交錯式熱不對稱PCR獲得編碼葡萄糖脫氫酶（glucose dehydrogenase，GDH）的全長基因（gdh），并對其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：gdh基因全長2 268 bp，編碼755個氨基酸，其蛋白序列與Gluconobacter屬的GDH具有較高的同源性。GDH的分子質(zhì)量約為81.72 ku，pI值約為5.14；GDH蛋白的二級結(jié)構(gòu)由18.41%的α-螺旋、16.16%的延伸和65.43%的無規(guī)則卷曲3種結(jié)構(gòu)模塊組成；GDH N末端的AA 1～140區(qū)域有5個跨膜結(jié)構(gòu)域。

葡萄糖酸；交錯式熱不對稱PCR；弱氧化醋酸桿菌；葡萄糖脫氫酶；生物信息學(xué)

葡萄糖酸作為膨松劑、凝固劑、螯合劑、酸味劑而廣泛應(yīng)用于食品、化工、水處理、建筑等行業(yè)，葡萄糖酸鹽類可作為食品添加劑和營養(yǎng)增補劑[1-2]。葡萄糖酸和檸檬酸一樣具有清爽的酸味，而且葡糖酸還稍帶甜味，因此可與檸檬酸一樣用在飲料中[3]。在營養(yǎng)增補劑、食品保鮮劑、品質(zhì)改良劑等方面有廣泛的應(yīng)用[4]。美國、日本等國家早在20世紀(jì)50年代就開始大批量生產(chǎn)葡萄糖酸，目前世界葡萄糖酸的產(chǎn)量約為6萬t，而我國總產(chǎn)量不足千噸，因此葡萄糖酸的生產(chǎn)研究具有良好的應(yīng)用前景。

葡萄糖酸是葡萄糖經(jīng)過簡單氧化反應(yīng)生成的溫和有機酸，催化葡萄糖氧化的酶類有兩種，一種是由真菌產(chǎn)生的葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD，EC1.1.3.4），氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫[5]。目前，發(fā)酵法及酶法生產(chǎn)葡萄糖酸都采用的是黑曲霉或青霉產(chǎn)生的葡萄糖氧化酶，這方面的報道較多[6-10]。另種是由細(xì)菌產(chǎn)生的葡萄糖脫氫酶（glucose dehydrogenase，GDH，EC1.1.1.5.2），催化葡萄糖脫氫生成葡萄糖酸[11]，這種葡萄糖脫氫酶是一種單體蛋白，存在于許多氧化細(xì)菌中，如Gluconobacter oxydans、Acinetobacter calcoaceticus等[12]。1979年，Olijve等[13]發(fā)現(xiàn)了吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）依賴型的GDH。然而，Velizarov等[14]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中GDH沒有任何的輔助因子。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）依賴型的GDH是二聚體蛋白，與PQQ依賴型的GDH沒有同源性。2000年，Sode[15]、Igarashi[16]等的研究表明，依賴水溶性PQQ的葡萄糖脫氫酶可以利用定點突變技術(shù)，置換單個氨基酸提高熱穩(wěn)定性。弱氧化醋酸桿菌（Gluconobacter suboxydans），是一種專性需氧細(xì)菌，自身生長的營養(yǎng)要求低，生長速度快，屬于“吃得少、產(chǎn)得多”的類型，利用細(xì)菌生產(chǎn)葡萄糖酸具有產(chǎn)業(yè)化潛力，但是有關(guān)Gluconobacter suboxydans產(chǎn)生的GDH還未見報道。

本實驗利用氨基酸保守序列分析和交錯式熱不對稱PCR（thermal assymmetric interlaced PCR，TAILPCR），從氧化醋酸桿菌中獲得PQQ依賴型的GDH基因的全序列，并對該基因序列及蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究葡萄糖脫氫酶的性質(zhì)、催化機制以及在葡萄糖酸生產(chǎn)上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

弱氧化醋酸桿菌（Gluconobacter suboxydans）J 河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院工業(yè)微生物研究室保藏。

限制性內(nèi)切酶、Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 大連寶生物工程公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；PCR引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 菌株J基因組DNA的提取

將菌株J在固體平板上培養(yǎng)48 h，收集菌體，按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說明書提取菌體J總DNA。

1.2.2 編碼GDH的基因（gdh）保守片段的克隆

根據(jù)GenBank中記錄的Gluconobacter oxydans 621H的基因組（CP000009.1）基因序列，分析PQQ附著位點的保守區(qū)域，設(shè)計引物GDH1F、GDH2F、GDH3F、GDH4F、GDH5F、GDH6F、GDH9F、GDH1R、GDH2R、GDH3R，引物序列見表1。通過各上、下游引物的組合，進(jìn)行PCR擴增。擴增條件為94℃預(yù)變性4 min，94℃、30 s，52℃、30 s，72℃、2 min，32個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物純化后，TA克隆于pEasy-T1載體。

表1 實驗中所用引物序列Table 1 Primer sets used in this study

1.2.3 gdh基因全序列的克隆與分析

1.2.3.1 TAIL-PCR的引物序列

根據(jù)已克隆并測序的菌株J的gdh，設(shè)計2組3條特異性巢式引物，5’端3個向外的特異性引物為GHR1、GHR2、GHR3，3’端3個向外的特異性引物GHF1、GHF2、GHF3，引物序列見表1。8個隨機引物（簡稱RAPD1,RAPD2,…,RAPD8）為生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3.2 TAIL-PCR擴增

表2 端和特異性引物的TAIL-PCR反應(yīng)程序Table 2 3’-terminus and 5’-terminus-specific PCR primers used for TAIL-PCR

表2 端和特異性引物的TAIL-PCR反應(yīng)程序Table 2 3’-terminus and 5’-terminus-specific PCR primers used for TAIL-PCR

引物反應(yīng)程序反應(yīng)次數(shù)反應(yīng)程序循環(huán)次數(shù)反應(yīng)溫度與時間3’端特異性引物第1次1195℃、5 min 2595℃、0.5 min，63℃、0.5 min，72℃、2.0 min 3195℃、0.5 min，25℃、0.5 min，72℃、2.0 min 95℃、0.5 min，63℃、0.5 min，72℃、2.0 min；95℃、0.5 min，63℃、0.5 min，72℃、2.0 min；95℃、0.5 min，29℃、0.5 min，72℃、2.0 min 5172℃、5 min第2次6195℃、5 min 415 415 95℃、0.5 min，61℃、0.5 min，72℃、2.0 min；95℃、0.5 min，61℃、0.5 min，72℃、2.0 min；95℃、0.5 min，29℃、0.5 min，72℃、2.0 min 5172℃、5 min

續(xù)表2

以菌體J基因組DNA為模板，在25 μL體系中以GHF1與隨機簡并引物（RAPD1,RAPD2,…,RAPD8）分別配對，進(jìn)行第1次PCR擴增，所得產(chǎn)物稀釋50倍后取1 ?L作模板，以GHF2和相應(yīng)的RAPD引物開始第2次PCR擴增；所得產(chǎn)物稀釋50倍后取1 ?L作為模板，以GHF3和相應(yīng)的RAPD引物進(jìn)行第3次PCR擴增。采用同樣的方法，以GHR1、GHR2、GHR3為引物，使用隨機簡并引物，進(jìn)行TAIL-PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序見表2，以0.8 g/100 mL瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物大小。

1.2.3.3 序列分析

使用DNAClub軟件分析核苷酸序列中的開放閱讀框（open reading frame，ORF），推導(dǎo)編碼的氨基酸序列。使用DNASTAR軟件繪制不同來源的GDH的進(jìn)化樹。利用在線軟件ExPASY Proteomics Server compute PI/Mw tool（http://web.expasy.org/compute_pi/）分析GDH的分子質(zhì)量和等電點。使用Network Protein Sequence Analysis在線軟件（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_hnn.pl）分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)，利用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/）在線軟件進(jìn)行跨膜區(qū)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 gdh基因保守區(qū)中間片段的克隆

由圖1可知，根據(jù)在NCBI上Gluconobacter oxydans 621H的基因組（CP000009.1）氨基酸序列分析，PQQ附著位點的保守區(qū)域大約在AA190～510之間，根據(jù)保守區(qū)域內(nèi)的氨基酸序列，反推出保守區(qū)內(nèi)的堿基序列，以此為根據(jù)設(shè)計上游引物：GDH1R、GDH2R、GDH3R，設(shè)計下游引物：GDH1F、GDH2F、GDH3F、GDH4F、GDH5F、GDH6F。

圖 11 Gluconobacter oxyddaannss 621H的GDH氨基酸序列保守域分析Fig.1 Analysis of the conserved domains of the amino acid sequence of GDH of Gluconobacter oxydans 621H in NCBI

圖2 GDH保守片段PCR擴增產(chǎn)物Fig.2 PCR amplification products of conservative GDH fragment

將引物進(jìn)行兩兩配對，分別進(jìn)行PCR擴增，在0.8 g/100 mL瓊脂凝膠上各取3 ?L PCR產(chǎn)物電泳（圖2），結(jié)果表明，在第2、3、4、6、7、8、9、11、12、13泳道都有單一條帶，選取PCR擴增產(chǎn)物最長的片段，即第8、11泳道產(chǎn)物，純化后進(jìn)行TA克隆，獲得GDH中間部分片段。

2.2 TAIL-PCR擴增N端和C端基因序列

以菌株J基因組為模板，5’端3個向外的特異性引物為GHR1、GHR2、GHR3，與8個隨機引物按反應(yīng)程序進(jìn)行3次PCR擴增。3’端3個向外的特異性引物GHF1、GHF2、GHF3分別與8個隨機引物按反應(yīng)程序進(jìn)行3次PCR擴增。在0.8 g/100 mL瓊脂凝膠上各取TAIL-PCR第2次和第3次擴增產(chǎn)物3 ?L電泳。由圖3可知，3’端特異性引物與試劑盒中隨機引物RAPD1和RAPD3得到的擴增結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相同，第3次的PCR擴增產(chǎn)物比第2次的PCR擴增產(chǎn)物小100 bp；5’端特異性引物與試劑盒中隨機引物RAPD1與RAPD2、RAPD4得到的擴增結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相同，第3次的PCR擴增產(chǎn)物比第2次的PCR擴增產(chǎn)物小100 bp。將第3次PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，將其連接到pEasy-T1載體上進(jìn)行TA克隆，進(jìn)行測序。

圖3 TAIL-PCR擴增N端和C端基因序列產(chǎn)物Fig.3 TAIL-PCR amplification products of the C-terminus and N-terminus

2.3 gdh全基因序列分析

將3段基因測序結(jié)果拼接，得到gdh全序列。在NCBI上分析已測得的菌株gdh基因的序列，結(jié)果表明ORF長度為2 268 bp，編碼755個氨基酸。核酸BLAST分析表明，克隆的gdh序列與Gluconobacter oxydans 621H的gdh基因（cp000009.1）有較高的同源性為83%，與G. oxydans的gdh基因（X32710.1）的同源性為82%。氨基酸BLAST分析表明，克隆的GDH序列與Gluconobacter oxydans 621H（YP_190704.1）的氨基酸同源性為87%，與Gluconobacter morbifer G707（ZP_09094391.1）的同源性為85%，與Gluconobacter oxydans（CAA44594.1）的同源性為85%，與Gluconacetobacter xylinus NBRC 3288（YP_004867379.1）的同源性為58%，與Gluconacetobacter europaeus LMG 18494（ZP_08901745.1）的同源性為59%。根據(jù)菌株J的GDH基因的ORF編碼氨基酸序列，利用DNASTAR軟件的MegAlign繪制不同來源的GDH的進(jìn)化樹，結(jié)果見圖4。

圖4 利用DNASTAR 軟件繪制的不同來源的GDH進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed on the basis of ghd gene sequences by neighbor joining using the software DNASTAR

利用在線軟件ExPASy Proteomics Server compute PI/ Mw tool （http://web.expasy.org/compute_pi/）預(yù)測菌株J的GDH分子質(zhì)量約為81.72 ku，等電點pI值約為5.14。

使用Network Protein Analysis在線軟件（http://npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_hnn.pl）分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)。克隆的gdh所編碼的蛋白的二級結(jié)構(gòu)由18.41%的α-螺旋、16.16%的延伸和65.43%的無規(guī)則卷曲3種結(jié)構(gòu)模塊組成。

利用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/）在線軟件進(jìn)行了跨膜區(qū)分析，結(jié)果表明，GDH的N末端有5個明顯的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)，分別為AA 7～29、AA 39～56、AA 61～83、AA 116～138，膜外蛋白區(qū)為AA 30～38、AA 84～86、AA 139～755，膜內(nèi)蛋白區(qū)為AA 1～6、AA 110～115。

3 結(jié) 論

TAIL-PCR是一種染色體步移技術(shù)，用來分離與已知序列鄰近的未知DNA序列的分子生物學(xué)技術(shù)。該方法因其簡單、高特異性、高效、高靈敏及快速等優(yōu)點，而成為一種擴增基因側(cè)翼序列的有效方法[17-19]。本實驗基于保守序列分析，采用改進(jìn)的TAIL-PCR成功地從Gluconobacter suboxydans克隆了1個新的PQQ依賴的葡萄糖脫氫酶基因，GenBank、Swiss-prot等數(shù)據(jù)庫中都未見報道。通過生物信息學(xué)分析，該基因與Gluconobacter oxydans 621H及Gluconobacter frateurii NBRC 101659的氨基酸的同源性較高；氨基酸序列與NCBI中報道的葡萄糖酸桿菌屬的GDH具有一定同源性。利用軟件分析的理論分子質(zhì)量為81.72 ku，與Ameyama等[20]報道的Gluconobacter suboxydans的GDH 83 ku相接近。利用軟件分析的二級結(jié)構(gòu)表明GDH蛋白的二級結(jié)構(gòu)由18.41%的α-螺旋、16.16%的延伸和65.43%的無規(guī)則卷曲3種結(jié)構(gòu)模塊組成，其N末端的AA1～140區(qū)域共有5個跨膜結(jié)構(gòu)，其余氨基酸序列處于膜外部。Satoshi等[21]報道PQQ依賴的葡萄糖脫氫酶A型酶的N末端為跨膜區(qū)，本研究的分析結(jié)果與此報道基本一致。綜上所述，GDH基因全序列的克隆以及核酸序列、蛋白序列及初步結(jié)構(gòu)分析的信息，為進(jìn)一步研究葡萄糖脫氫酶的性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)、催化機制以及在葡萄糖酸生產(chǎn)上的應(yīng)用提供參考。

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Cloning through TAIL- PCR and Bioinformatics Analysis of the Glucose Dehydrogenase Gene from Gluconobacter suboxydans

DAI Bao-xin1,2, FENG Hui-yong1, LI Tian-ming1, LIU Tian-jia1,3, LIU Jing-wen1, YI Hong1,*
(1. College of Biological Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co. Ltd., Shijiazhuang 050018, China; 3. Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co. Ltd., Shijiazhuang 050018, China)

Pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase (PQQ-dependent GDH, EC1.1.5.2), which catalyzes the conversion of D-glucose to gluconic acid, is an important enzyme in the production of gluconic acid by fermentation or enzymatic method. The aim of this study was to clone and characterize the gene enconding PQQ-dependent GDH from Gluconobacter suboxydans. Primers were designed based on the conserved region of the PQQ-attaching sites, and the entire gdh gene was obtained by thermal asymmetric interlaced-PCR (TAIL-PCR). The gene was then sequenced and analyzed by bioinformatics methods. The sequence analysis suggested that its coding region consisted of 2268 bp nucleotides encoding 755 amino acids. The deduced amino acid sequence showed a high level of similarity to the PQQ-dependent GDH of Gluconobacter oxydans. The molecular weight of the encoded protein was 81.72 ku with an isoelectric point of 5.14. The bioinformatic analysis suggested that its second structure consisted of 18.41% alpha helix, 16.16% extended strand and 65.43% random coil and its N-terminal contained five transmembrane domains locating in the region between amino acid residues 1 and 140. This study indicates that TAIL-PCR provides a simple and efficient method for the cloning of the unknown genes. The bioinformatic analyses of GDH provide a foundation for further investigation on the characteristics and catalytic mechanism of GDH and its potential applications in gluconic acid production.

gluconic acid; thermal asymmetric interlaced-PCR (TAIL-PCR); Gluconobacter suboxydans; glucose dehydrogenase; bioinformatics

Q812

A

1002-6630(2014)01-0194-05

10.7506/spkx1002-6630-201401038

2012-11-29

戴寶新（1987—），女，碩士研究生，研究方向為生物化工。E-mail：daibaoxin666@163.com

*通信作者：儀宏（1966—），男，教授，碩士，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：fenghuiyong@163.com