口腔診療環(huán)境細(xì)菌群落的時(shí)間變化趨勢(shì)研究

楊加震 張穎 劉育含 李帆 曾飛 李修珍 馬玉瑩 楊芳

1.青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心 青島 266071；2.大連醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 大連 116044；3.中國(guó)人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院口腔科 南京 211299；4.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院 天津 300070

口腔是多種微生物的天然棲息地，這些生態(tài)位可成為細(xì)菌、病毒、真菌等致病微生物的儲(chǔ)存庫(kù)，在診療操作中構(gòu)成交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)，甚至可能導(dǎo)致全身感染[1]?？谇辉\療操作中，高速手機(jī)、三用槍等設(shè)備的使用都會(huì)產(chǎn)生大量氣溶膠，這些含有致病微生物的懸浮顆?？稍诰嗷颊? m范圍內(nèi)活動(dòng)[2]，沉積定植于診室環(huán)境表面。在口腔診室綜合治療椅、電腦等位置均檢測(cè)到致病微生物的存在[3]，且有患者在經(jīng)口腔診療后感染軍團(tuán)病的相關(guān)病例被報(bào)道[4]，這些發(fā)現(xiàn)凸顯了診療環(huán)境作為致病微生物儲(chǔ)存庫(kù)和院內(nèi)交叉感染的可能來(lái)源，因此，口腔診療環(huán)境中微生物種群及其功能屬性的認(rèn)識(shí)了解對(duì)于感染防控至關(guān)重要。

環(huán)境表面的清潔與消毒是醫(yī)院感染防控工作計(jì)劃中的基本要素，但達(dá)到所需的消毒水平仍是挑戰(zhàn)之一[5]。目前，口腔診療環(huán)境微生物檢測(cè)研究主要通過(guò)培養(yǎng)技術(shù)。然而，在各種環(huán)境中有99%以上的微生物很難通過(guò)培養(yǎng)識(shí)別[6]，導(dǎo)致缺乏某些獨(dú)特微生物在不同環(huán)境生態(tài)位間傳播和定植的檢測(cè)研究[7]。隨著不依賴培養(yǎng)的高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展，對(duì)環(huán)境微生物群落有了進(jìn)一步了解，不再局限于單一物種或種群。目前，借助該技術(shù)對(duì)于口腔診療環(huán)境的相關(guān)研究?jī)H限于綜合治療椅水中微生物的檢測(cè)[8-9]，缺乏對(duì)口腔診療環(huán)境表面微生物的相關(guān)研究，阻礙了口腔診療環(huán)境有效感染防控策略的制定與實(shí)施。

因此，本研究采用16S rRNA高通量測(cè)序方法并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析手段，探究了口腔診療環(huán)境細(xì)菌群落特征及其隨診室投入使用時(shí)間增加的變化趨勢(shì)，為口腔診療環(huán)境感染防控提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取青島市市立醫(yī)院3間新裝修診室，分別于投入使用前、使用1月、使用3月3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行采樣。在此期間，各診室進(jìn)行日常清潔及消毒，治療區(qū)每名患者治療后使用75%乙醇擦拭消毒，治療外周區(qū)每日工作結(jié)束后進(jìn)行消毒及通風(fēng)，遇污染及時(shí)清潔、消毒，每周對(duì)診室環(huán)境進(jìn)行1次徹底清潔消毒。每間診室選取5個(gè)采樣位點(diǎn)：綜合治療椅燈柄、治療臺(tái)按鍵、綜合治療椅扶手、清潔物品存放抽屜把手、鼠標(biāo)。

1.2 樣本采集

采樣當(dāng)日診療活動(dòng)結(jié)束后，采樣者無(wú)菌條件下操作，使用預(yù)先用無(wú)菌鹽溶液潤(rùn)濕的拭子在采樣面橫豎各涂擦5次，邊涂擦邊旋轉(zhuǎn)拭子。所有樣本均由同一采樣者完成。樣本采集后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因組DNA 提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增及測(cè)序

采用DNeasy PowerSoil Kit（Qiagen公司，美國(guó)）試劑盒對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000檢測(cè)DNA的濃度。選取16S rRNA片段上V3-V4高變區(qū)（引物343F 和798R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物使用電泳檢測(cè)，檢測(cè)后使用磁珠純化，純化后作為2輪PCR模板，并進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增，并再次使用電泳檢測(cè)，檢測(cè)后使用磁珠純化，純化后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Qubit定量。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，并上機(jī)測(cè)序。

1.4 生物處理及統(tǒng)計(jì)分析

為了研究菌群多樣性，原始雙端序列去雜生成優(yōu)質(zhì)序列之后，采用Vsearch（Version 2.4.2）軟件[10]，根據(jù)序列的相似性（相似度≥97%），將序列歸為多個(gè)操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）?；贠TU構(gòu)建稀釋曲線，計(jì)算物種豐富度指數(shù)（Chao1） 和物種多樣性指數(shù)，即Shannon和Simpson指數(shù)，以展示環(huán)境菌群的Alpha多樣性。進(jìn)一步基于樣本的未加權(quán)Unifrac距離，以及主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA），進(jìn)行Beta多樣性分析，以展示不同時(shí)間3組間的物種結(jié)構(gòu)特征。使用QIIME （Version 1.8.0）軟件[11]挑選出各個(gè)OTU的代表序列，并將所有代表序列與Greengene數(shù)據(jù)庫(kù)（http://greengenes.secondgenome.com/）進(jìn)行比對(duì)注釋，計(jì)算出門、屬等水平各物種相對(duì)豐度，進(jìn)行分析比較。Alpha多樣性兩兩進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，Adonis檢驗(yàn)測(cè)定Beta多樣性的顯著性，菌群水平差異采用Kruskal Wallis檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序結(jié)果質(zhì)量分析

基于97%相似水平下，對(duì)各樣本序列信息進(jìn)行聚類分析并統(tǒng)計(jì)得知，45個(gè)樣本在過(guò)濾掉低質(zhì)量的序列后，有效序列的總數(shù)為2 674 086，每個(gè)樣本平均得到59 424條序列。從稀釋曲線（圖1）可知，序列數(shù)量到2 000時(shí)，各樣本稀釋曲線均基本趨于平緩，說(shuō)明取樣合理，能較真實(shí)地反映診室環(huán)境樣本的細(xì)菌微生物。

圖1 樣本稀釋曲線圖Fig 1 Rarefaction curves of three groups

2.2 基于OTU的菌種多樣性分析

對(duì)口腔診療環(huán)境中細(xì)菌群落的構(gòu)成進(jìn)行解析，由基于OTU水平的Venn圖（圖2）可知，3組樣本共得到17 814個(gè)OTU，其中核心OTU為3 576個(gè)，獨(dú)有OTU數(shù)量分別為3 761（G1組）、3 653（G2組）和2 841（G3組）。3組樣本的Alpha多樣性分析如圖3所示，G1組的Chao1指數(shù)明顯高于G3組（P＜0.05）；但3組間的Shannon和Simpson指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 基于OTU水平的Venn圖Fig 2 Venn diagram based on OTU level

圖3 Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)Fig 3 Index of Chao1,Shannon and Simpson

2.3 基于未加權(quán)Unifrac距離的菌落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

診療環(huán)境細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果（圖4）顯示，隨著診室投入使用周期的增加，菌群物種變化存在顯著差異（F＝1.141，P＜0.05，圖4A）；進(jìn)一步通過(guò)距離矩陣進(jìn)行PCoA分析（圖4B），可以看出：G3組與G1、G2組相比，樣本間差異變小。

圖4 3組細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較Fig 4 Comparison bacterial community structure in three groups

2.4 基于門水平口腔診療環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)分析

基于細(xì)菌門水平，對(duì)診室環(huán)境樣本的菌群微生物相對(duì)豐度進(jìn)行比較分析，結(jié)果見圖5。超過(guò)95%的群落組成由以下7個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門構(gòu)成，包括變形菌門（34.86%）、厚壁菌門（26.02%）、擬桿菌門（22.76%）、放線菌門（8.12%）、硝化螺旋菌門（1.92%）、酸桿菌門（1.67%）、芽單胞菌門（1.37%）；3組樣本在門水平上的物種組成較為近似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖5 門水平上細(xì)菌類群比較Fig 5 Comparison of bacterial groups at phylum level

2.5 基于屬水平口腔診療環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)分析

對(duì)3組樣本中豐度前30的細(xì)菌屬的分析結(jié)果顯示，口腔診療環(huán)境優(yōu)勢(shì)菌屬（相對(duì)豐度＞1%）有8種（圖6A），主要依次是：乳桿菌屬（9.61%）、埃希氏菌-志賀氏菌屬（8.94%）、擬桿菌屬（4.82%）、雙歧桿菌屬（3.34%）、鏈球菌屬（2.23%）、副擬桿菌屬（2.21%）、毛螺菌屬（1.61%）、瘤胃菌屬（1.01%）；共檢測(cè)到7種潛在致病菌（圖6B），包括：埃希氏菌-志賀氏菌屬、擬桿菌屬、鏈球菌屬、普氏菌屬、黃桿菌屬、加德納菌屬以及假單胞菌屬，隨著診室使用周期延長(zhǎng)埃希氏菌-志賀氏菌屬的相對(duì)豐度明顯增加（P＜0.05），而假單胞菌明顯減少（P＜0.05）。

圖6 屬水平上細(xì)菌類群比較Fig 6 Comparison of bacterial groups at genus level

3 討論

眾所周知，醫(yī)院感染管理工作不僅僅局限于過(guò)程管理，更重要的是風(fēng)險(xiǎn)管控，及時(shí)識(shí)別、控制風(fēng)險(xiǎn)是降低院內(nèi)感染發(fā)生的重要措施。隨著對(duì)多種傳染性疾病傳播途徑的不斷研究，醫(yī)院環(huán)境被認(rèn)為是包括病原菌在內(nèi)的最大微生物庫(kù)之一，可供微生物定植，并最終導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)感染的發(fā)生[12]。由于口腔診療操作的開放性、侵入性特點(diǎn)，以及口腔診療器械復(fù)雜、腔隙多等結(jié)構(gòu)特征，均增加了清潔滅菌的難度，導(dǎo)致患者及醫(yī)務(wù)人員發(fā)生交叉感染的概率增大。了解微生物群落如何在環(huán)境中的無(wú)生命表面定植并持續(xù)生存，對(duì)于評(píng)估微生物群落可能對(duì)公共健康構(gòu)成的風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要[13]。在這項(xiàng)研究中，筆者通過(guò)16S rRNA基因測(cè)序，對(duì)口腔診療環(huán)境表面細(xì)菌的多樣性進(jìn)行了描述，進(jìn)一步分析了細(xì)菌群落隨診室投入使用時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。

基于16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果，口腔診療環(huán)境表面隨著投入使用時(shí)間的增加，觀察到組內(nèi)獨(dú)有OTU數(shù)量逐漸減少，表明口腔診療環(huán)境中稀有細(xì)菌物種有所降低。進(jìn)一步考察了3組環(huán)境樣本的菌群物種多樣性差異，發(fā)現(xiàn)3菌群物種多樣性Shannon和Simpson指數(shù)均無(wú)差異，但G1組的菌群物種豐富度，即Chao1指數(shù)顯著高于G3組，這與OTU計(jì)算及PCoA分析結(jié)果相一致，提示診療環(huán)境表面菌群物種豐富度隨著投入使用時(shí)間增加而降低，組內(nèi)樣本間相似性增加，考慮為日常清潔消毒或較為單一的口腔診療活動(dòng)對(duì)生態(tài)演替影響的結(jié)果。既往研究表明，人類可以通過(guò)呼吸、脫落細(xì)胞、直接或間接將微生物轉(zhuǎn)移至周圍的物體表面，進(jìn)而影響環(huán)境中細(xì)菌群落的組成，但口腔診療環(huán)境中菌落物種豐富度的變化關(guān)系還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

為研究口腔診療環(huán)境表面菌群具體構(gòu)成，筆者基于種系發(fā)育信息對(duì)樣本中的細(xì)菌進(jìn)行了分析。研究[14]發(fā)現(xiàn)，診療環(huán)境微生物中主要細(xì)菌門構(gòu)成包括變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門等，這與既往關(guān)于手術(shù)室、重癥監(jiān)護(hù)室的環(huán)境表面微生物研究結(jié)果較為一致。這些優(yōu)勢(shì)菌門在人類健康口腔以及齲病、牙周炎患者口腔菌群中均占有較大比重[15-17]，它們可借助診療操作過(guò)程中產(chǎn)生的大量氣溶膠沉降定植在環(huán)境表面。在這項(xiàng)研究中還發(fā)現(xiàn)了高致病性和機(jī)會(huì)致病菌，如埃希氏菌-志賀氏菌、假單胞菌、鏈球菌及黃桿菌等，既往在口腔綜合治療椅水路微生物研究中同樣證實(shí)了這些細(xì)菌的存在[8]。盡管這些致病微生物的物種豐富度較低，但交叉感染的危害不容忽視。埃希氏菌-志賀氏菌不僅與口腔扁平苔蘚有關(guān)，而且在潰瘍性結(jié)腸炎患者中明顯增加，與宿主免疫微生物相互作用相關(guān)[18-19]。假單胞菌與人類多種感染相關(guān)，包括醫(yī)院獲得性肺炎[20]、尿路感染[21]、皮膚感染[22]以及眼部感染[23]等，對(duì)人類健康具有較強(qiáng)的潛在致病性，特別是對(duì)免疫功能低下的患者。而這2種致病菌屬的相對(duì)豐度隨著口腔診室使用時(shí)間的延長(zhǎng)，表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，推測(cè)為物種間相互作用的結(jié)果。不同的微生物間存在著共生、拮抗等相互關(guān)系，且與生物膜的形成密切相關(guān)[24]，復(fù)雜的生態(tài)關(guān)系使得診療環(huán)境消毒面臨巨大挑戰(zhàn)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。