堿性離子液體TBAH預(yù)處理對(duì)桉木結(jié)構(gòu)和酶解性能的影響

王淑捷， 侯賢鋒， 黃穎詩(shī)， 陳小鳳， 孫 瑾， 高振忠

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 材料與能源學(xué)院，廣東 廣州 510642)

木質(zhì)纖維生物質(zhì)是一種重要的生物煉制原料，但碳水化合物和木質(zhì)素之間的緊湊結(jié)構(gòu)是其利用的關(guān)鍵障礙。目前，國(guó)內(nèi)外開(kāi)發(fā)了許多預(yù)處理技術(shù)來(lái)打破這種纏繞結(jié)構(gòu)[1-2]。其中，被視為綠色溶劑的離子液體(IL)因不揮發(fā)、化學(xué)穩(wěn)定性好和熱穩(wěn)定性高等特性而備受關(guān)注[3]。IL是由有機(jī)陽(yáng)離子與有機(jī)或無(wú)機(jī)陰離子組成，可以破壞天然纖維素晶體結(jié)構(gòu)中的氫鍵[4]。IL預(yù)處理木質(zhì)纖維素通常會(huì)降低纖維素的結(jié)晶度，部分去除木質(zhì)素和半纖維素從而提高木質(zhì)纖維素在室溫下的酶解能力。四丁基氫氧化銨(TBAH)是一種具有經(jīng)濟(jì)性和低生物毒性的離子液體，可被用于預(yù)處理木質(zhì)纖維生物質(zhì)。諸多研究者對(duì)TBAH陰離子與陽(yáng)離子溶解纖維素的能力進(jìn)行了深入研究[5]，但鮮有提及TBAH中陽(yáng)離子[TBA]+和陰離子OH-在預(yù)處理中的作用機(jī)理。四丁基氟化銨(TBAF)作為一種中性離子液體，與TBAH具有相同的陽(yáng)離子，可用于探究陽(yáng)離子[TBA]+在預(yù)處理桉木中的作用機(jī)理。本研究采用響應(yīng)面分析法，通過(guò)仿真模型獲得TBAH最佳預(yù)處理?xiàng)l件，對(duì)比未處理、NaOH、TBAF和TBAH預(yù)處理的桉木粉的組成成分的變化，并結(jié)合FT-IR、XRD和SEM的分析，探究了TBAH預(yù)處理桉木中陽(yáng)離子[TBA]+和陰離子OH-的作用機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 原料、試劑及儀器

桉木粉末，取自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)的木工廠?？諝飧稍飪芍芎螅煤Y機(jī)篩分樣品，以獲得尺寸為0.18～0.25 mm的桉木粉末。離子液體四丁基氫氧化銨(TBAH)水溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%)、四丁基氟化銨(TBAF)和3,5-二硝基水楊酸(DNS)，均購(gòu)自上海的Aladdin公司。纖維素酶(酶活50 000 U/g)和β-葡萄糖苷酶(酶活110 U/g)，購(gòu)自江蘇省銳陽(yáng)生物技術(shù)有限公司。

NICOLET6700傅里葉變換紅外吸收光譜(FT-IR)儀，美國(guó)Thermo公司；Ultima IV型X射線粉末衍射(XRD)儀，日本Rigaku公司； S-570掃描電子顯微鏡(SEM)，德國(guó)Zeiss公司。

1.2 桉木預(yù)處理

1.2.1TBAH預(yù)處理 將5 g桉木粉末與TBAH溶液按料液比1 ∶20(g ∶mL，下同)混合，在磁力攪拌器中以TBAH的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、預(yù)處理時(shí)間和預(yù)處理溫度為自變量，還原糖產(chǎn)率為響應(yīng)值根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素五水平響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)了該試驗(yàn)的所有組和相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行預(yù)處理[6]。預(yù)處理后的樣品經(jīng)過(guò)砂芯漏斗過(guò)濾，并用大量去離子水洗滌至中性，固體樣品置于(103±2) ℃烘箱中烘至絕干，取出放置干燥器中備用。

1.2.2TBHF預(yù)處理 將5 g桉木粉末與TBAF溶液按料液比1 ∶20混合，在1.2.1節(jié)模擬出的TBAH預(yù)處理的最優(yōu)條件下進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理后的樣品經(jīng)過(guò)砂芯漏斗過(guò)濾，并用大量去離子水洗滌至中性，固體樣品置于(103±2) ℃烘箱中烘至絕干，取出放置干燥器中備用。

1.2.3NaOH預(yù)處理 將5 g桉木粉末與NaOH溶液按料液比1 ∶20混合，在1.2.1節(jié)模擬出的TBAH預(yù)處理最優(yōu)條件下進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理后的樣品經(jīng)過(guò)砂芯漏斗過(guò)濾，并用大量去離子水洗滌至中性，固體樣品置于(103±2) ℃烘箱中烘至絕干，取出放置干燥器中備用。

1.3 纖維素酶解

將0.1 g桉木粉加入50 mL錐形瓶中，并補(bǔ)充30 mL檸檬酸鈉緩沖液(pH 值4.8)，之后加入35 FPU/g 的纖維素酶，30 FPU/g的β-葡萄糖苷酶，用橡膠塞密封瓶子，將混合物在溫度50 ℃和轉(zhuǎn)速150 r/min 的培養(yǎng)箱中酶解72 h。每間隔12 h取出水解產(chǎn)物通過(guò)3，5-二硝基水楊酸(DNS)測(cè)定法測(cè)量還原糖的濃度，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。還原糖產(chǎn)率和纖維素轉(zhuǎn)化率按式(1)～(2)計(jì)算：

(1)

(2)

式中：N1—還原糖產(chǎn)率，mg/g；V—錐形瓶中緩沖液的體積，mL；C—DNS法測(cè)定還原糖質(zhì)量濃度，g/L；W—加入桉木粉質(zhì)量，mg;N2—纖維素轉(zhuǎn)化率，%；Q—樣品中纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/g。

1.4 表征分析

1.4.1組成成分 采用范氏(van Soest)法對(duì)預(yù)處理前后桉樹(shù)粉末進(jìn)行成分分析。以中性洗滌試劑、酸性洗滌試劑和72%H2SO4為原料，制得中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)。ADF與NDF的差值，ADF與ADL的差值，ADL與灰分的差值分別作為半纖維素、纖維素和Klason木質(zhì)素含量[7]。為了獲得可重復(fù)的結(jié)果，將相對(duì)百分比差異設(shè)置為小于5%。

1.4.2FT-IR 將1 mg桉木粉末與100 mg KBr混合均勻通過(guò)壓片機(jī)進(jìn)行壓片，將制備好的壓片放入傅里葉變換紅外吸收光譜儀進(jìn)行掃描。掃描波數(shù)范圍 4000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.4.3XRD 將各個(gè)樣品粉末倒入載玻片的凹槽中，用另一個(gè)載玻片或其他東西將粉末均勻覆蓋在凹槽中(覆蓋度80%～100%)，之后用酒精擦拭干凈灑出在載玻片凹槽外的粉末。然后將樣品放在X射線粉末衍射儀中，樣品的XRD分析在2θ=5～50°的范圍內(nèi)進(jìn)行，掃描步長(zhǎng)為0.02°。根據(jù)式(3)計(jì)算結(jié)晶度指數(shù)(ICr)：

ICr=(I002-Iam)/I002×100%

(3)

式中：I002—2θ值為22.5°時(shí)的峰值強(qiáng)度；Iam—2θ值為19°時(shí)的峰值強(qiáng)度。

1.4.4SEM 在掃描電鏡上觀察桉木粉末的表面形態(tài)。操作電壓為10 kV，在觀察之前將樣品用導(dǎo)電膠黏在樣品底座上，在樣品上噴涂一層薄薄的金，以防止電荷沉積在表面上。然后對(duì)樣品表面進(jìn)行500倍放大觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Design-expert 12軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸和方差分析，并對(duì)回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。該模型的方差結(jié)果在表2中。

表2 TBAH回歸方程方差分析(ANOVA)

圖1 TBAH模型預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值比較Fig.1 Comparison of TBAH model prediction value with experimental value

此外，通過(guò)回歸模型預(yù)測(cè)，TBAH預(yù)處理桉木獲得還原糖的最佳條件為：預(yù)處理時(shí)間57.19 min，預(yù)處理溫度71.98 ℃，TBAH質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.78%。在此預(yù)處理?xiàng)l件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，還原糖的平均產(chǎn)率為365.62 mg/g(纖維素轉(zhuǎn)化率69.24%)，與理論預(yù)測(cè)值367.91 mg/g相比，誤差僅有0.62%，證實(shí)了模型的有效性[14]。

2.2 預(yù)處理對(duì)桉木酶解的影響

2.2.1成分分析 如表3所示，與未處理的桉木粉相比，NaOH、TBAF和TBAH的預(yù)處理后木質(zhì)素和半纖維素的含量較低，表明3種預(yù)處理均會(huì)降解木質(zhì)素和半纖維素。[TBA]+陽(yáng)離子與木質(zhì)素的分子間結(jié)合作用能比[TBA]+陽(yáng)離子與纖維二糖的分子間結(jié)合能低，這表明[TBA]+陽(yáng)離子更傾向于與木質(zhì)素的結(jié)合，所以與NaOH相比，TBAF、TBAH可以降解更多的木質(zhì)素[15]。NaOH預(yù)處理比TBAF和TBAH預(yù)處理降解更多的半纖維素，降解機(jī)理是堿性溶液中OH-使得半纖維素糖基之間的苷鍵斷裂，以及破壞半纖維素和其他成分之間的酯鍵，造成半纖維素水解[16]。與TBAF預(yù)處理相比，TBAH預(yù)處理可去除更多的半纖維素，表明TBAH中的OH-與NaOH預(yù)處理中OH-作用效果類似，表明堿性離子液體TBAH同時(shí)具有陽(yáng)離子[TBA]+和堿性溶液OH-的特性。

2.2.2還原糖產(chǎn)率 使用TBAF、TBAH和NaOH在TBAH預(yù)處理的最佳條件下對(duì)桉木粉進(jìn)行預(yù)處理，還原糖產(chǎn)率分別為301.43、 365.62和356.91 mg/g(見(jiàn)表3)。TBAF、NaOH和TBAH 3種溶液進(jìn)行預(yù)處理后明顯提高了纖維素水解的作用。對(duì)比TBAF與TBAH預(yù)處理后樣品的還原糖產(chǎn)率，相同的陽(yáng)離子[TBA]+條件下，OH-的預(yù)處理效果優(yōu)于F-預(yù)處理。對(duì)比NaOH與TBAH還原糖產(chǎn)率，Na+與[TBA]+的預(yù)處理效果也不同。

表3 預(yù)處理對(duì)桉木化學(xué)成分及酶解的影響

2.3 預(yù)處理對(duì)桉木理化性質(zhì)的影響

2.3.1FT-IR分析 預(yù)處理前后桉木樣品的FT-IR光譜如圖2所示。897 cm-1處吸收峰顯示的是纖維素的β-(1- 4)-糖苷鍵的伸縮振動(dòng)[17-18]，預(yù)處理后的桉木樣品在此處的吸收峰的強(qiáng)度均強(qiáng)于未處理桉木，這表明預(yù)處理后樣品纖維素含量增加。1750和1240 cm-1處分別與半纖維素中的乙酰基的C—O和酯的拉伸振動(dòng)相關(guān)。與未處理桉木相比，預(yù)處理后桉木樣品這兩個(gè)吸收峰均減弱或消失，表明在預(yù)處理過(guò)程中去除了部分半纖維素成分。與TBAF預(yù)處理相比，TBAH和NaOH預(yù)處理桉木此處的吸收峰強(qiáng)度更低[19]，結(jié)合成分分析說(shuō)明了TBAH預(yù)處理中堿性陰離子OH-與NaOH中OH-的作用機(jī)理相同，可以去除更多的半纖維素。1512、 1600和1652 cm-1處的吸收峰分別歸因于木質(zhì)素中的芳香族骨架振動(dòng)和C—H振動(dòng)[20]。與未處理的桉木樣品相比，預(yù)處理后的樣品在這些吸收峰處顯示較弱的信號(hào)，表明預(yù)處理均可降解部分木質(zhì)素。與NaOH預(yù)處理相比，TBAH和TBAF預(yù)處理桉木的吸收峰顯著降低，這是預(yù)處理中[TBA]+作用的結(jié)果。

2.3.2XRD分析 由XRD數(shù)據(jù)(圖3)得出的ICr適用于評(píng)估預(yù)處理對(duì)木質(zhì)纖維生物質(zhì)結(jié)晶度的影響。

與未處理桉木(42.39%)相比，預(yù)處理后的樣品具有更高的ICr，其中TBAF、NaOH和TBAH預(yù)處理后ICr值分別為53.82%、 61.29%以及54.11%。這是因?yàn)轭A(yù)處理破壞了相對(duì)較少的晶體結(jié)構(gòu)和相對(duì)較多的非晶結(jié)構(gòu)域(木質(zhì)素和半纖維素)，從而使得ICr增加[21]。其中，TBAF和TBAH預(yù)處理的ICr低于NaOH預(yù)處理。其原因是IL預(yù)處理中[TBA]+可以破壞纖維素的晶體區(qū)域，使纖維素晶體區(qū)域中的ICr值降低[22]。TBAH與TBAF預(yù)處理相比，可以去除更多的非結(jié)晶區(qū)域；TBAH與NaOH預(yù)處理相比能破壞纖維素的結(jié)晶區(qū)域，所以TBAH預(yù)處理后桉木樣品的ICr值在TBAF與NaOH預(yù)處理樣品之間。

2.3.3SEM分析 為了獲得桉木樣品的直觀形態(tài)信息，使用SEM記錄了未處理桉木、NaOH、TBAF和TBAH預(yù)處理的桉木粉的顯微照片(圖4)。

a.未處理feedstock; b.TBAF; c.TBAH; d.NaOH

未處理的桉木的表面是連續(xù)而光滑的，其中木質(zhì)素為胞間層連接纖維與纖維之間的結(jié)殼物質(zhì)，半纖維素則為細(xì)胞壁中分布在微纖維中的填充物質(zhì)[23]。TBAF和TBAH預(yù)處理后的桉木表面相比于未處理的桉木樣品均變得寬松且不平整。預(yù)處理的桉木樣品表面很多地方呈現(xiàn)蜂窩狀，這可能是由于部分半纖維素和木質(zhì)素被破壞的原因。NaOH預(yù)處理出現(xiàn)大量褶皺，沿徑向細(xì)胞壁破壞呈規(guī)則排列，也使得纖維表面暴露出大量活性界面，加速纖維素的酶解。

3 結(jié) 論

3.1建立響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)模型，確定TBAH預(yù)處理最佳條件：預(yù)處理時(shí)間為57.19 min，預(yù)處理溫度為71.98 ℃，TBAH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.78%。在這條件下，還原糖的產(chǎn)率為365.62 mg/g，預(yù)處理后樣品中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為52.8%、 18%和15%，纖維素轉(zhuǎn)化率達(dá)到69.24%。

3.2主要成分分析和FT-IR圖譜表明堿性離子液體TBAH中的OH-在對(duì)桉木預(yù)處理中的作用與NaOH中OH-的作用機(jī)理相同，可以去除較多的半纖維素；陽(yáng)離子[TBA]+可以降解較多的木質(zhì)素。XRD分析表明預(yù)處理會(huì)降解非結(jié)晶區(qū)，并且[TBA]+會(huì)破壞纖維素晶體區(qū)域。SEM分析表明OH-和[TBA]+二者共同作用會(huì)導(dǎo)致桉木表面破損的、有孔的和不規(guī)則的微觀形態(tài)，提高纖維素酶對(duì)纖維素的可及性，促進(jìn)酶水解以獲得高糖產(chǎn)率。