高通量互作蛋白組圖譜研究揭示U6 snRNA在腫瘤細(xì)胞中多維度調(diào)控mRNA加工成熟過程

楊芝芝，楊兵，田彬，廖建友

非編碼RNA（non?coding RNA，ncRNA）是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，其中包括核糖體RNA（ribo?somal RNA，rRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）、核小RNA（small nuclear RNA，snRNA）、核仁小 RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）、小干擾RNA（microRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA）等［1-3］，這些RNA 的共同特點(diǎn)都是能在RNA 水平上行使各自的生物學(xué)功能。snRNA共有6種，由于含U豐富，故編號(hào)為U1~U7。snRNA只存在于細(xì)胞核中，其中U3存在于核仁中，其他6 種存在于核質(zhì)中。snRNA 具有修飾的堿基，并在5'末端有一個(gè)三甲基鳥苷酸（TMG）的類似“帽”結(jié)構(gòu)，3'末端有自身抗體識(shí)別的Sm 抗原結(jié)合的保守序列［4］，其特點(diǎn)是穩(wěn)定且含量豐富，如U1 分子在每個(gè)核中的含量可有106個(gè)。snRNA 序列高度保守，如人和爪蟾的U1 snRNA 有90%的序列相同［5］。snRNA 不參與蛋白質(zhì)合成活動(dòng)，其重要功能是構(gòu)成RNA 剪接體（spliceosome）的主要成分，在mRNA 前體剪接和加工方面起著重要作用，也參與其他各種RNA 前體的轉(zhuǎn)錄后加工過程［6］，同時(shí)也對(duì)維持rRNA 構(gòu)象，起著輔助的作用。U3 snRNA 與核仁內(nèi) 28S rRNA 的成熟有關(guān)［7］，而U1 則是在核漿中與前體mRNA 的剪接加工有關(guān)［8］，U7 參與組蛋白 mRNA 3'?末端的形成［9］。

U6 snRNA（以下簡(jiǎn)稱U6）是pre?mRNA 剪接體催化核心的重要組成部分，是細(xì)胞生長(zhǎng)的一個(gè)重要調(diào)控因子［10］。研究顯示U6 的紊亂與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如Lou 等發(fā)現(xiàn)U6 在各種腫瘤中廣泛異常表達(dá)［11］。Tao 等［12］發(fā)現(xiàn)U6 相關(guān)sm 樣蛋白LSm3、小核糖核蛋白D2 多肽（SNRPD2）、核糖體蛋白S3a（RPS3A）、S100 鈣結(jié)合蛋白A8（S100A8）等既是輕度認(rèn)知功能障礙（MCI）的主要致病基因，也是橋接基因。不僅是U6 與腫瘤等疾病相關(guān)，其相互作用蛋白也與腫瘤等密切相關(guān)，比如U6 的相互作用蛋白LSM1 在87%的胰腺癌病人［13］、40%的前列腺癌［14］、20%的乳腺癌中顯著異常高表達(dá)［15］。研究顯示LSM1 只要在腫瘤細(xì)胞中有輕微的改變都能引起腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的顯著變化［15］。這說明U6 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的異常對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展調(diào)控是至關(guān)重要的。盡管如此，關(guān)于U6參與腫瘤調(diào)控方面的研究還較少，對(duì)U6 如何調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制知道得還很少，其中一個(gè)主要原因是受限于對(duì)其分子功能的全面認(rèn)識(shí)。目前還不清楚U6 的功能是否僅限于參與形成剪接復(fù)合體進(jìn)行對(duì)pre?mRNA 的剪接和加工。探索U6 新的生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制有助于幫助理解腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。

ncRNA 一般通過其結(jié)合的RNA 結(jié)合蛋白（RBP）去發(fā)揮生物學(xué)功能［16］，如一種核仁特異性lncRNA(LoNA)，它的5'部分能夠結(jié)合核仁蛋白NCL以抑制 rRNA 轉(zhuǎn)錄［17］，以 snoRNA 為末端的長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA）SLERT 能夠結(jié)合和改變DDX21分子構(gòu)像，消除DDX21 對(duì)Pol I 轉(zhuǎn)錄的抑制，促進(jìn)蛋白翻譯［18］；rRNA 則通過與核糖體相關(guān)蛋白共同組成核糖體來行使翻譯功能，而miRNA則通過與AGO蛋白的結(jié)合來抑制mRNA 翻譯或者促進(jìn)mRNA 降解來調(diào)控基因表達(dá)［19］。因此要了解非編碼RNA 的功能，確定其在體內(nèi)所結(jié)合的蛋白至關(guān)重要。研究顯示非編碼RNA 在體內(nèi)所結(jié)合蛋白的種類和復(fù)雜性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出人們的預(yù)期，目前已知的剪接體相關(guān)基因總共才143 個(gè)，但利用ChIRP?MS（Chromatin isolation by RNA purification and masss pectrmetry）技術(shù)鑒定出來的與U1 結(jié)合的蛋白有418 個(gè)，與U2結(jié)合的蛋白有370 個(gè)，這提示U1 和U2 snRNA 參與了大量與RNA剪接不相關(guān)的細(xì)胞過程［20］。

在本研究中，為了系統(tǒng)認(rèn)識(shí)U6 的生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制，我們采用RNA 相互作用蛋白組技術(shù)ChIRP 來純化腫瘤細(xì)胞中U6 snRNA 所結(jié)合的所有RBP，然后結(jié)合高靈敏度質(zhì)譜分析技術(shù)（LC?MS）去定性識(shí)別這些蛋白，從而建立U6 在腫瘤細(xì)胞中的相互作用蛋白組圖譜，系統(tǒng)解析U6 所參與的調(diào)控通路和生物學(xué)功能。本研究將能幫助理解U6 參與腫瘤調(diào)控的機(jī)制，為腫瘤的診斷和治療提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 CHIRP 實(shí)驗(yàn)

1.1.1 探針設(shè)計(jì) 在NCBI 上查詢?nèi)嗽吹腢6 基因序列（表1）。在https：//www.biosearchtech.com/chirp?designer/上設(shè)置合適的參數(shù)獲得探針，并在廣州銳博生物訂購兩條帶有3'末端BiotinTEG 修飾的反向探針。

1.1.2 細(xì)胞交聯(lián) 使用胰酶消化293T 細(xì)胞，PBS清洗兩遍，計(jì)數(shù)，收集2×108個(gè)細(xì)胞；加入3%甲醛溶液（Sigma，用PBS 配置，10 mL/107 個(gè)細(xì)胞）重懸細(xì)胞?；靹蚝笫覝胤跤?0 min。加入甘氨酸（gly?cine）使終濃度為0.125 M，混勻后室溫孵育5 min終止交聯(lián)。4℃離心棄上清。預(yù)冷PBS 洗一次，離心棄上清。

1.1.3 裂解細(xì)胞 稱取1.5 mL 蛋白低吸附管重量以推算細(xì)胞團(tuán)重量。加入10 倍體積的含有蛋白酶抑制劑和RNA 酶抑制劑的Lysis Buffer（0.05 M Tris?HCl pH：7.0，0.1 mM EDTA，1% SDS），重懸混勻。以30 s on，45 s off 的參數(shù)來超聲細(xì)胞懸液。待細(xì)胞裂解液澄清后，吸5 μL 消化掉蛋白后跑瓊脂糖膠，檢測(cè)超聲效果。直至DNA 大小在100~500 bp，超聲完成。

1.1.4 探針雜交 將超聲樣品離心取上清。取1/100作為 Input 對(duì)照。取 10 μL C?1 beads（invitrogen）用100 μL Lysis Buffer 洗三次。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到15 mL 管中，按照每mL Lysis Buffer 加入2 mL Hybridization Buffer（750 mM NaCl，1% SDS，0.05 M Tris?HCl pH：7.0，1 mM EDTA pH8.0，15%甲酰胺）加入雜交液。加入10 μL C?1 beads，在雜交爐中37 ℃旋轉(zhuǎn)孵育30 min。去除珠子，取蛋白上清每毫升體積加入1 μL 100 μM 探針雜交過夜。取100 μL C?1 beads，等體積的 Lysis Buffer 來將磁珠懸浮加到蛋白上清中，37 ℃旋轉(zhuǎn)孵育30 min。用Wash Buffer（2× SSC，0.5% SDS）洗 5 次磁珠。最后加入磁珠等體積的Wash Buffer，取10 μL 磁珠用于提取RNA。剩下所有磁珠用于獲取蛋白。

1.1.5 蛋白獲取 棄上清留磁珠，加入等體積的 Biotin elution Buffer（12.5 mM D?Biotin、7.5 mM HEPES pH：7.5、75 mM NaCl、1 mM EDTA pH：8.0，0.15% SDS、0.075% sarkosyl、0.02% Na?Deoxycho?late、6.4 mM NaOH），渦旋后室溫靜置20 min，65 度干浴1 h，收集上清。再次加入與磁珠等體積的Biotin elution Buffer，重復(fù)操作獲得上清，合并兩次上清。加入4 倍體積預(yù)冷丙酮，?20 度沉淀過夜。

1.2 MS 樣品前處理

4 度離心棄上清，分別加入70%乙醇和冷丙酮各洗一次。加入 UA buffer（8 M Urea，100 mM Tris?HCl）回溶蛋白，室溫震蕩2 h 溶解；加入二硫蘇糖醇DTT 對(duì)蛋白進(jìn)行還原（30 度，1 h）；加入碘乙酰胺IAA 進(jìn)行烷基化（室溫，45 min），然后加入質(zhì)譜級(jí)的trypsin 37 度酶解過夜。加入10% TFA 終止酶解，懸干后進(jìn)行脫鹽處理，然后上機(jī)檢測(cè)所富集到的蛋白。

1.3 RT?QPCR

在 10 μL RNA Input 和 10 μL 磁珠中分別加入85 μL RNA PK Buffer pH：7.0（100 mM NaCl、10 mM Tris?HCl pH：8.0、1 mM EDTA pH：8.0、0.5%SDS）和5 μL Proteinease K，在水浴鍋中 45 度孵育45 min。加入DEPC 水補(bǔ)齊體積200 μL，再分別加入200 μL氯仿和 200 μL 水飽和酚，渦旋后 13 000 r/min，4 ℃離心10 min。取上清加入25 μL 3M NaAc，0.5 μL糖原（Glycogen Blue），3 倍體積無水乙醇，-80 ℃沉淀過夜。13 000 r/min，4℃離心20 min，棄上清，95%乙醇洗一次，風(fēng)干后用少量DEPC 水回溶。對(duì)于RT?qPCR，使用帶 RT Primer Mix 的 PrimeScript RT Enzyme Mix I（TAKARA）和 5× PrimeScript Buffer 2進(jìn)行cDNA 合成。采用TB Green Premix Ex TaqⅡ（TAKARA）和CFX96TM 實(shí)時(shí)系統(tǒng)（BIO?RAD）進(jìn)行QPCR。qPCR檢測(cè)目標(biāo)RNA U6和GAPDH的豐度。

1.4 RIP?QPCR

293T 細(xì)胞在冷 PBS 中紫外照射（254 nm，1500 kJ），交聯(lián)后收集細(xì)胞，離心后去除上清，加入含有蛋白酶抑制劑和RNA 酶抑制劑的RIPA 緩沖液（50 mM Tris?HCl pH：7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA、0.1% SDS、1% NP40、0.5%脫氧膽酸鈉、0.5 mM DTT）重懸細(xì)胞，在冰上孵育30 min，然后用Bioruptor Plus（Diagenode）對(duì)裂解液進(jìn)行超聲處理。超聲處理后，用DynabeadsTMprotein G（invitrogen）在4 ℃下預(yù)洗裂解液1 h，然后用相應(yīng)抗體在4 ℃下與裂解液旋轉(zhuǎn)孵育4 h，加入等量同源Normal IgG作為空白對(duì)照，然后加入protein G 4 ℃孵育過夜。使用RIPA 緩沖液洗滌2 次磁珠，1 M RIPA 緩沖液（7 mL RIPA 緩沖液+ 3 mL 3 M NaCl）洗滌 4 次。用 RIPA緩沖液回溶磁珠，蛋白酶 K 消化（45 min，45 ℃）后，用苯酚和氯仿分離RNA，然后與gDNA Eraser（TAKARA）孵育，進(jìn)行cDNA合成和qPCR。

1.5 GO 和 pathway 富集分析

為了有效提取蛋白組可能參與的生物學(xué)過程和可能的分子機(jī)制信息，我們?cè)噲D采用GO（gene ontology）分析對(duì)蛋白組進(jìn)行注釋。GO 是一個(gè)提供基因及其產(chǎn)物功能注釋信息的數(shù)據(jù)庫，分為分子功能（molecular function）、生物學(xué)過程（biological process）和細(xì)胞組成（cellular component）三方面。而 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是一個(gè)綜合數(shù)據(jù)庫，包含基因、通路、疾病和藥物等信息，能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)基因及其產(chǎn)物可能參與的信號(hào)通路。聯(lián)合這兩種分析方法對(duì)鑒定到的U6互作蛋白組進(jìn)行綜合注釋，預(yù)測(cè)這些蛋白可能參與的分子功能、生物過程、細(xì)胞組成和信號(hào)通路，從而挖掘U6 可能的新的生物學(xué)功能和分子調(diào)控機(jī)制。

1.6 蛋白復(fù)合體富集分析與PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了更好地了解U6 可能參與的生物學(xué)過程和分子調(diào)控機(jī)制，我們利用ConsensusPathDB 這個(gè)數(shù)據(jù)庫，它整合了超過30 個(gè)分子互作相關(guān)數(shù)據(jù)庫，包括蛋白與蛋白互作、生化反應(yīng)、基因調(diào)控互作以及4601條通路信息。利用ConsensusPathDB分析獲得U6 互作蛋白組的蛋白復(fù)合體富集信息，同時(shí)使用STRING 數(shù)據(jù)庫（Search Tool for the Retrival of Interating Genes/Proteins Database），幫助有效搜尋蛋白質(zhì)之間互作關(guān)系信息，包括蛋白質(zhì)之間的直接物理互作，和間接功能相關(guān)性。借助Cyto?scape 軟件，一款將蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)可視化并能夠進(jìn)行編輯和分析的軟件，將STRING 數(shù)據(jù)庫查詢的蛋白互作信息可視化并構(gòu)建蛋白與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein?protein interaction network，PPI）。

2 結(jié)果與分析

2.1 腫瘤細(xì)胞內(nèi)源U6 snRNP 復(fù)合體的高效捕獲

CHIRP?MS 技術(shù)是近年來逐漸發(fā)展起來的用于系統(tǒng)檢測(cè)內(nèi)源RNA 互作蛋白組的技術(shù)。首先，它利用3%甲醛室溫對(duì)活的Hela 細(xì)胞進(jìn)行交聯(lián)，使原本有互作的蛋白和RNA 緊密結(jié)合在一起，然后再利用CHIRP?designer 這個(gè)網(wǎng)站設(shè)計(jì)U6 探針和NC 空白對(duì)照探針，探針序列見表1。利用ChIRP?designer 找到了兩條U6 的探針（表1），將這兩條探針都進(jìn)行了合成。利用所合成的帶生物素修飾的U6 特異的探針與U6 snRNP 復(fù)合體進(jìn)行雜交，再利用鏈霉親和素磁珠將蛋白和RNA 復(fù)合體進(jìn)行捕獲。為了確認(rèn)兩條U6 特異探針的捕獲效果，首先取了部分蛋白和RNA復(fù)合體，使用蛋白酶K對(duì)其進(jìn)行消化。然后去除其中的蛋白并提取RNA。通過逆轉(zhuǎn)錄結(jié)合qPCR 檢測(cè)兩條U6 snRNA 探針?biāo)东@到的U6 的量，發(fā)現(xiàn)U6?1 探針具有很好的富集效果，其能夠富集到65.4%的內(nèi)源U6 snRNA（圖2A），而U6?2 探針只富集到了9.3%的內(nèi)源U6，而NC 探針只富集到了0.09%的內(nèi)源U6，這說明U6?1 探針擁有極高的特異性和效率。因此后續(xù)研究使用U6?1 探針?biāo)东@的U6 snRNP 復(fù)合體進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。

表1 本研究中的序列

2.2 U6 snRNA 腫瘤細(xì)胞互作蛋白組圖譜建立

通過高效液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC?MS）定性識(shí)別所富集到的U6 snRNP（圖1A），獲得了超過300 個(gè)U6 結(jié)合蛋白。進(jìn)一步剔除了角蛋白、低豐度蛋白以及NC 空白對(duì)照組富集到的蛋白，最后獲得了135 個(gè)高可靠的U6 結(jié)合蛋白（圖1B）。表2 顯示了豐度排名最高的前20 的U6 結(jié)合蛋白。

圖1 （A）ChIRP?MS 技術(shù)流程（B）生信分析手段

表2 U6腫瘤細(xì)胞互作蛋白組中質(zhì)譜信號(hào)排名前20的蛋白

為了進(jìn)一步說明使用CHIRP?MS 實(shí)驗(yàn)技術(shù)獲得的U6 互作蛋白組的可信度，選擇其中1 個(gè)蛋白核磷素NCL 進(jìn)行反向驗(yàn)證，采用RIP?qPCR 實(shí)驗(yàn)技術(shù)驗(yàn)證NCL 是否內(nèi)源結(jié)合U6。首先采用紫外交聯(lián)的方式使目的蛋白和互作RNA 緊密結(jié)合在一起，然后使用蛋白對(duì)應(yīng)的抗體NCL（abcam，ab136649）進(jìn)行免疫共沉淀，獲得RNA 和蛋白復(fù)合物。通過western blot 發(fā)現(xiàn)NCL 抗體能夠有效富集NCL 蛋白，而IgG 陰性對(duì)照則不能富集NCL 蛋白（圖2B），提示抗體能高效結(jié)合NCL 蛋白。然后使用蛋白酶K 消化掉其中的蛋白質(zhì)并提取RNA，對(duì)RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qPCR，提示核磷蛋白NCL 在體內(nèi)能結(jié)合U6（圖2B）。該結(jié)果說明了使用CHIRP?MS 技術(shù)富集到的U6 互作蛋白組是可靠的。

圖2 U6 互作蛋白組圖譜建立（A）U6 探針富集效率檢測(cè)；（B）RIP?qPCR 驗(yàn)證NCL 蛋白結(jié)合U6

2.3 GO 和KEGG 分析顯示U6 多維度參與腫瘤細(xì)胞的mRNA 加工成熟調(diào)控

傳統(tǒng)上認(rèn)為U6 主要參與mRNA 內(nèi)含子剪接。為了研究U6 所參與的生物學(xué)過程，我們將獲得的U6 互作蛋白組利用ConsensusPathDB 進(jìn)行GO分析（圖3A）。GO 細(xì)胞組分（CC）分析顯示U6 富集到的蛋白主要參與組成剪接體復(fù)合物，核小核糖核蛋白復(fù)合物，核糖核蛋白體以及Lsm2?8 復(fù)合物，該復(fù)合物是由7 個(gè)Lsm 蛋白（Lsm2?8）組成的雜七聚體影響核內(nèi)小而穩(wěn)定的RNA（包括tRNAs、RNAs）和 pre?mRNA 的加工，是 U6 的一部分。這些復(fù)合物主要參與mRNA 前體剪接和加工成熟的生物學(xué)過程，這與我們已有的對(duì)U6 的功能認(rèn)識(shí)一致，進(jìn)一步證明了我們所獲得的U6 互作蛋白組是可靠的。此外CC 結(jié)果還顯示U6 snRNP 中有大量蛋白屬于細(xì)胞核蛋白（nuclear part），猜測(cè)U6 可能在細(xì)胞核內(nèi)參與基因表達(dá)或加工成熟的調(diào)控過程。CC 分析結(jié)果還顯示U6 snRNP 參與細(xì)胞器內(nèi)腔與細(xì)胞內(nèi)外囊泡組成，提示U6 可能參與囊泡運(yùn)輸這一生物學(xué)過程。GO 的生物過程（BP）分析結(jié)果除了提示U6 參與mRNA 前體剪接之外，還顯示可能參與有機(jī)化合物代謝過程，以及參與了RNA定位過程，這一過程與CC 分析中可能參與細(xì)胞內(nèi)外囊泡運(yùn)輸過程聯(lián)系起來，可以推測(cè)U6 可能以囊泡的形式參與RNA的運(yùn)輸，從而參與RNA定位過程。再看 GO 分子功能（MF）分析則顯示 U6 snRNP 不僅和核酸結(jié)合，也和ATP，蛋白，酶等結(jié)合，提示U6 功能的多樣性。利用 ConsensusPathDB 對(duì) U6 互作蛋白組進(jìn)行KEGG 分析顯示，除了顯著富集到mRNA 前體剪接和加工通路外，還富集到RNA 聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄終止、來自內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄本的成熟mRNA 的運(yùn)輸和成熟轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)的過程。綜合 GO 和 KEGG 分析的結(jié)果，U6 參與了 mRNA 轉(zhuǎn)錄、加工、運(yùn)輸和mRNA 原料的生物合成等多個(gè)過程的調(diào)控，這大大拓寬了我們對(duì)U6 只參與mRNA前體剪接調(diào)控這單一功能的認(rèn)識(shí)，提示U6 異常相關(guān)疾病細(xì)胞中mRNA 加工成熟過程可能受到了比原先預(yù)想的更為深遠(yuǎn)的影響。

圖3 腫瘤細(xì)胞U6 snRNA 互作蛋白組的GO 分析

2.4 復(fù)合體富集分析和PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建揭示U6 snRNA 功能的多樣性

對(duì)U6 互作蛋白組進(jìn)行蛋白復(fù)合體富集分析（圖4A）分析顯示U6 互作蛋白組主要富集了與mRNA 剪接相關(guān)的復(fù)合體，如Spliceosome、C com?plex spliceosome、hnRNP complex、U4：U5：U6 tri?snRNP complex、CDC5L complex、CBC complex、SNW1 complex、ATAC A/B complex、Large Dorsha complex、PGC?1?SRp40?SRp75 complex、post exon ligation complex 等。此外，同時(shí)也富集了一些剪接功能外的復(fù)合物，如 TLE1 corepressor complex（MASH1 promoter?corepressor complex）、Lsm1 ?7 complex、DGCR8 multiprotein complex 等，這些與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、序列特異性 DNA 結(jié)合、mRNA 降解和 microRNA 加工成熟等生物學(xué)功能相關(guān)，這些結(jié)果表明U6 sn?RNA 可能不僅僅參與mRNA 前體的剪接，還可能參與mRNA 轉(zhuǎn)錄調(diào)控、降解、運(yùn)輸和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等一些生物學(xué)過程。這些過程在病理狀態(tài)下受到異常調(diào)控可能與U6 snRNA 功能紊亂相關(guān)。

進(jìn)一步利用STRING 數(shù)據(jù)庫對(duì)U6 互作蛋白組進(jìn)行PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析顯示U6 互作蛋白之間存在復(fù)雜的相互聯(lián)系（圖4B）。其構(gòu)成的PPI 網(wǎng)絡(luò)主體主要有SRSF 蛋白家族、PRPF 蛋白家族、HNRNP 家族、ATP 家族和 DDX5 蛋白等。這些蛋白在細(xì)胞中都發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，這些功能主要包括mRNA 前體剪接和加工、成熟mRNA的出核運(yùn)輸、mRNA 降解、核糖體構(gòu)成、RNA 定位以及化合物代謝和嘌呤代謝等。這些功能揭示了U6 腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的多樣性。為進(jìn)一步展開對(duì)U6 snRNA 的生物學(xué)功能和分子機(jī)制探索以及U6 在腫瘤中扮演什么樣的角色提供了方向。

3 討 論

RNA 與蛋白之間的互作模式解析是它們功能的關(guān)鍵。RNA 蛋白互作模式的改變也是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)推動(dòng)因素。研究RNA 與蛋白互作的方法很多，確定與某個(gè)蛋白互作的RNA，常采用高通量測(cè)序的方法，比如 eCLIP?seq［22］，RIP?seq［23］，ChIP?seq［24］等。而確定與某個(gè) RNA 互作的蛋白組，相對(duì)來說有效的研究方法較為缺乏，前期主要是外源 RNA pull?down［25］，但 RNA pull?down 存在穩(wěn)定性和特異性較差、通量低等缺點(diǎn)，很難用來確定某個(gè)RNA 的相互作用蛋白組圖譜。相比之下，近年來出現(xiàn)的 ChIRP?MS［21］是一種較為有效的 RNA 相互作用蛋白圖譜解析方法，該方法是聯(lián)合了基于探針的高效獲取RNA 與蛋白復(fù)合體捕獲方法和LC?MS，能高效識(shí)別RNA 的互作蛋白組圖譜，幫助我們對(duì)RNA 的功能和機(jī)制有了更加全面和深入的認(rèn)識(shí)。在 2015 年，Chu 等［21］利用 ChIRP?MS這個(gè)策略系統(tǒng)獲得調(diào)控X 染色體失活的長(zhǎng)鏈非編碼RNA Xist 的RNA 結(jié)合蛋白，使得其互作蛋白從以往的不到十種一下子增加到了八十一種，使得大家重新認(rèn)識(shí)了經(jīng)典lncRNA Xist 的細(xì)胞功能。在 2020 年，Lan 等［26］利用 ChIRP?MS 技術(shù)分離了長(zhǎng)鏈非編碼RNA SNHG6 的互作蛋白，結(jié)合LC?MS對(duì)蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定，獲得了高達(dá)467 個(gè)互作蛋白。對(duì)其進(jìn)行功能注釋，從而發(fā)現(xiàn)了SNHG6 參與可變剪接等功能，極大地豐富了我們對(duì)目標(biāo)RNA的生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí)。再比如2020 年，Sun 等［27］通過ChIRP?MS 技術(shù)發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA PFI互作蛋白SRSF1，并發(fā)現(xiàn)其通過與剪接調(diào)節(jié)因子SRSF1 相互作用保護(hù)肺纖維化的分子機(jī)制，表明ChIRP?MS 技術(shù)的可行性，并對(duì)RNA 的功能和機(jī)制研究提供了很大的便利，方便解析RNA 互作圖譜改變對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響。

本研究采用了ChIRP?MS 技術(shù)系統(tǒng)高效地建立起了國(guó)際上首個(gè)腫瘤細(xì)胞U6 互作蛋白組圖譜，為研究U6 的腫瘤生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。我們所建立的U6 腫瘤細(xì)胞互作蛋白組圖譜。

一共包括135 個(gè)蛋白，其中包括了大量已知U6 的互作蛋白（表2，圖3，4），這證明了我們方法能有效地鑒定到U6 的互作蛋白。此外我們還鑒定出一些新的U6 互作蛋白，包括ACTB、NCL、MYH7 等等，這些新的互作蛋白是發(fā)掘新的U6 功能的基礎(chǔ)。進(jìn)一步采用GO 和KEGG 分析，發(fā)現(xiàn)除了顯著富集到與mRNA 前體剪接和加工功能相關(guān)蛋白外，我們還發(fā)現(xiàn)了一些U6 所參與的其它生物學(xué)功能，包括囊泡運(yùn)輸、成熟mRNA 的轉(zhuǎn)運(yùn)出核、成熟mRNA 的降解、調(diào)控RNA 定位等（表3，圖3），同時(shí)注釋結(jié)果顯示U6 互作蛋白組可能也參與了體內(nèi)一些有機(jī)環(huán)狀物化合物的代謝和一些病理生理學(xué)過程的調(diào)控，比如嘌呤代謝、乳糖不耐癥等，說明U6 在腫瘤細(xì)胞中扮演著復(fù)雜多樣的功能。同時(shí)我們又對(duì)U6 snRNA 互作蛋白組進(jìn)行了蛋白復(fù)合物富集分析以及PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)他們來自一些功能蛋白復(fù)合體，這些復(fù)合物除了參與mRNA 的剪接和加工外，還參與了成熟mRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)出核、mRNA 降解、microRNA 加工成熟，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，序列特異性DNA 結(jié)合等生物學(xué)功能（圖4A，B）?？傊?，以上結(jié)果均提示U6 在腫瘤細(xì)胞中除了參與mRNA 前體剪接和加工外，還參與了mRNA 從產(chǎn)生到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等一系列生物學(xué)過程，提示U6 多維度地參與了腫瘤細(xì)胞mRNA 生物學(xué)發(fā)生的全過程調(diào)控。這些發(fā)現(xiàn)極大地?cái)U(kuò)展了U6 可能的腫瘤生物學(xué)功能范圍，為展開U6 sn?RNA 如何參與腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程提供了一些思路，為腫瘤的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)。

表3 U6 snRNA 互作蛋白組KEGG 通路富集分析

圖4 A：U6 互作蛋白組復(fù)合體富集分析；B：U6 互作蛋白組PPI 網(wǎng)絡(luò)