Streptomyces parvus 33菌株發(fā)酵液干燥物與殺菌劑復(fù)配對草莓白粉病的防控效果

張文娟

（渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 渭南 714026）

草莓白粉病屬于一種真菌病害，是草莓生長過程中的一種常見病害，在低溫高濕條件下易發(fā)生，對草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)造成惡劣的影響，同時對草莓產(chǎn)業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。目前，生產(chǎn)上主要使用苯醚甲環(huán)唑、粉唑醇、三唑酮、唑醚·氟酰胺和腈菌唑等化學(xué)農(nóng)藥防治草莓白粉病[3-6]。但化學(xué)農(nóng)藥的長期過量使用易導(dǎo)致病菌產(chǎn)生耐藥性，使化學(xué)農(nóng)藥的防治效果下降，而且化學(xué)農(nóng)藥的高殘留，對環(huán)境具有巨大破壞作用，危害人類健康[7-8]。因此，迫切需要創(chuàng)制高效、安全、低殘留的新型農(nóng)藥，開發(fā)利用生物農(nóng)藥是控制草莓白粉病的有效手段之一[9-10]。

Streptomyces parvus33 是從污染環(huán)境土壤中篩選出的一種代謝抑菌活性物質(zhì)的放線菌菌株，對草莓白粉病有較強(qiáng)的抑制作用[11]，筆者為了推進(jìn)Streptomyces parvus33 相關(guān)研究成果在農(nóng)林業(yè)領(lǐng)域的推廣實(shí)施，結(jié)合前期的試驗驗證數(shù)據(jù)，將Streptomyces parvus33發(fā)酵液與現(xiàn)有殺菌成分（吡唑醚菌酯或吡唑萘菌胺）復(fù)配，旨在篩選出一種對于防治白粉病更加有效的組合物。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗整個操作過程在西安市灞橋區(qū)洪慶堡果天天草莓園草莓大棚內(nèi)進(jìn)行（經(jīng)度為109°06′，緯度為34°27′），試驗田土壤為褐土基礎(chǔ)上形成的農(nóng)業(yè)土壤。常規(guī)生產(chǎn)管理，草莓長勢基本一致。前茬作物也是草莓。試驗大棚歷年均有草莓白粉病發(fā)生。

1.2 供試材料

供試草莓品種為紅顏。

供試藥劑為97%吡唑醚菌酯（原藥）購自巴斯夫歐洲公司、99%吡唑萘菌胺（原藥）購自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司、92%苯醚甲環(huán)唑原藥購自瑞士先正達(dá)中國有限公司（用于室內(nèi)毒力測定），25%吡唑醚菌酯乳油購自廣西田園生化股份有限公司、30%吡唑萘菌胺乳油和10%苯醚甲環(huán)唑水分散顆粒劑購自瑞士先正達(dá)中國有限公司（用于大田試驗）。HPD系列大孔樹脂購自河北滄州寶恩吸附材料科技有限公司。分析純甲醇購自汕頭西隴化工廠。

小米發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，小米10.0 g，NaCl 2.5 g，蛋白胨3.0 g，CaCO31.0 g，（NH4）2SO41.0 g，H2O 1 000 mL，pH值7.2。

供試菌株Streptomyces parvus33 菌株分離自化學(xué)污染地區(qū)土壤[11]。

草莓白粉病菌孢子：采集發(fā)病均一的草莓果實(shí)，標(biāo)本袋分裝帶回實(shí)驗室，用無菌水沖洗，制成分生孢子懸浮液1.0×106個/mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株發(fā)酵液干燥物的制備Streptomyces parvus33菌株發(fā)酵：將50 mL小米培養(yǎng)基裝入250 mL三角瓶中，滅菌，冷卻；將菌株接種于培養(yǎng)瓶中，置入28 ℃搖床，以180 r/min 轉(zhuǎn)速培養(yǎng)5 d；過濾發(fā)酵液并收集濾液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

大孔吸附樹脂的選擇：取6份100 mL過濾好的菌株發(fā)酵液分別用預(yù)處理過的20 mL（濕體積）HPD100、HPD300、HPD400、HPD500、HPD600、HPD750 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附，重復(fù) 3 次；12 h 后裝入層析柱，先用少量蒸餾水洗去雜質(zhì)，然后分別用甲醇洗脫（解吸）；將甲醇洗脫液定容至一定體積，采用抑制孢子萌發(fā)法對殘留液、甲醇洗脫液進(jìn)行以草莓白粉病菌為指示菌的抑菌活性試驗。

樹脂的動態(tài)飽和吸附量考察：取已處理好的HPD100 樹脂20 mL（濕體積）裝柱，將準(zhǔn)備好的菌株發(fā)酵液緩慢加入層析柱中，通過液用三角瓶收集并編號，每份100 mL，流速約為2 mL/min，采用抑制孢子萌發(fā)法對收集的各餾分進(jìn)行以草莓白粉病菌為指示菌的抑菌活性試驗。

活性粗提物的制備：將90 L 發(fā)酵液經(jīng)HPD100樹脂富集，用40%、60%、100%甲醇水梯度洗脫，100%甲醇餾分濃縮至一定體積即為活性粗提物。

1.3.2 菌株發(fā)酵液干燥物對草莓白粉菌孢子的毒力測定 采用抑制孢子萌發(fā)法進(jìn)行測試[12-14]。將草莓白粉病菌孢子用無菌水配成濃度為1.0×106個/mL 的孢子懸浮液。取發(fā)酵液干燥物先用DMSO 進(jìn)行溶解以后，然后再通過使用無菌水配成濃度為400 μg/mL 的母液。根據(jù)藥劑自身的活性特點(diǎn)，設(shè)置5 個質(zhì)量濃度，分別為25、50、100、200、400μg/mL。用移液槍吸取25μL 各濃度的藥液和25μL制備好的孢子懸浮液滴加到干燥潔凈的凹玻片上，使藥液與孢子懸浮液等量混合均勻，然后置于帶有淺層水的培養(yǎng)皿中，加蓋保濕于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以蒸餾水為對照，每個處理3個重復(fù)。當(dāng)空白對照孢子萌發(fā)率達(dá)到85%以上時，利用光學(xué)顯微鏡檢查各種處理的孢子萌發(fā)情況（每處理各重復(fù)隨機(jī)觀察5 個視野，調(diào)查孢子總數(shù)不少于300個）。以苯醚甲環(huán)唑作為陽性對照，用無菌水稀釋，終質(zhì)量濃度為25、50、100、200、400 μg/mL。按公式（1）計算藥劑對病菌孢子萌發(fā)的抑制率。

1.3.3 菌株發(fā)酵液干燥物與殺菌劑復(fù)配防治保護(hù)地草莓白粉病的藥效試驗 2021 年3 月10 日至4 月20日是該大棚草莓白粉病發(fā)生的初級階段，同時伴隨有果實(shí)上也有白粉病的發(fā)生。按照GB/T 17980.119—2004 殺菌劑防治草莓白粉病方法進(jìn)行[15]，試驗共設(shè) 7 個處理，即Streptomyces parvus33發(fā)酵干燥物原始濃度；25%吡唑醚菌酯；30%吡唑萘菌胺；30%發(fā)酵液干燥物+吡唑醚菌酯混合物（20%+10%）；40%發(fā)酵液干燥物+吡唑醚菌酯混合物（20%+20%）；20%發(fā)酵液干燥物+吡唑萘菌胺混合物（10%+10%）；15%發(fā)酵液干燥物+吡唑萘菌胺混合物（5%+10%），同時以清水為對照。每個處理4 個重復(fù)，共分為20 個小區(qū)，每個小區(qū)的面積為20 m2，20 株草莓植株，并且進(jìn)行隨機(jī)分組排列。采用常規(guī)的噴霧措施，均勻噴灑在草莓的整個植株全株。第1 次施藥選擇在草莓白粉病發(fā)病初級階段，14 d 后進(jìn)行第2 次用藥，試驗過程中共施藥2次。

1.3.4 調(diào)查與統(tǒng)計方法 在第1次施藥之后的14 d和第2 次施藥之后的14 d 對草莓白粉病進(jìn)行病情指數(shù)調(diào)查，每個小區(qū)安排隨機(jī)調(diào)查5 個點(diǎn)，每一個調(diào)查點(diǎn)內(nèi)容是3株草莓的全部葉片，在進(jìn)行調(diào)查的過程當(dāng)中，每片葉按照病斑面積占整個葉面積的百分率分級進(jìn)行記錄，同時還需要調(diào)查總的葉片數(shù)量、各種級別的病葉數(shù)量以及草莓白粉病的病害指數(shù)。

分級標(biāo)準(zhǔn)為：0級.無??；1級.葉片病斑百分率5%以下；3 級.葉片病斑百分率5%～10%；5 級.葉片病斑百分率11%～25%；7 級.葉片病斑百分率26%～50%；9級.葉片病斑百分率50%以上。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0軟件通過Duncan′s 法進(jìn)行差異顯著性（P＜0.05）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Streptomyces parvus 33 菌株發(fā)酵液干燥物對草莓白粉病孢子毒力的測定

從表 1 可以看出，Streptomyces parvus33 菌株發(fā)酵液干燥物對草莓白粉病菌孢子的萌發(fā)具有明顯的抑制作用，且隨著藥劑濃度的增大抑制作用顯著加強(qiáng)，結(jié)果表明，在同樣濃度下Streptomyces parvus33 菌株發(fā)酵液抑菌活性顯著低于苯醚甲環(huán)唑（P＜0.05）。

表1 Streptomyces parvus 33菌株發(fā)酵液干燥物對草莓白粉菌孢子萌發(fā)的抑制作用Tab.1 Inhibition of dry substance of fermentation broth of Streptomyces parvus 33 against the spore germination of Sphaerotheca macularis

2.2 菌株發(fā)酵液干燥物與殺菌劑復(fù)配防治保護(hù)地草莓白粉病的藥效試驗結(jié)果

各種處理方法對保護(hù)地草莓白粉病的防治試驗結(jié)果如表2 所示，結(jié)果顯示，與清水對照、Streptomyces parvus33 發(fā)酵液干燥物和吡唑醚菌酯單劑相比，Streptomyces parvus33發(fā)酵液干燥物的組合制劑顯著提高了對草莓白粉病的防效（P＜0.05）；與清水對照、Streptomyces parvus33 發(fā)酵液干燥物和吡唑萘菌胺單劑相比，20%發(fā)酵液干燥物+吡唑萘菌胺混合物（10%+10%）組合制劑對草莓白粉病的田間藥效明顯提升，與清水對照和Streptomyces parvus33發(fā)酵液干燥物相比，15%發(fā)酵液干燥物+吡唑萘菌胺混合物（5%+10%）組合制劑田間施用也可以提高田間藥效，但是與吡唑萘菌胺相比防效無顯著差異。所有藥劑對草莓植株安全，未見藥害發(fā)生。

表2 菌株發(fā)酵液干燥物與殺菌劑復(fù)配防治保護(hù)地草莓白粉病的藥效試驗結(jié)果Tab.2 Control efficiency of compound of dry substance of fermentation broth of Streptomyces parvus 33 and fungicides against strawberry powdery mildew in reserve

3 結(jié)論與討論

本試驗通過室內(nèi)生物測定和田間藥效研究了Streptomyces parvus33 菌株發(fā)酵液干燥物防治草莓白粉病的效果，結(jié)果表明，Streptomyces parvus33 菌株發(fā)酵液干燥物對草莓白粉病菌分生孢子萌發(fā)具有明顯的抑制作用。通過進(jìn)行大棚藥劑防效試驗，其結(jié)果說明針對栽培期間的草莓白粉病使用試驗藥劑進(jìn)行2 次噴施進(jìn)行草莓白粉病的防治可以起到很好的效果，防治效果可高達(dá)65%以上。

Streptomyces parvus33 發(fā)酵液干燥物與吡唑醚菌酯、吡唑萘菌胺的組合制劑對草莓白粉病的田間藥效治理與單純使用一種藥劑相比，藥效有一定提升。農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不可缺少的生產(chǎn)資料，但大量化學(xué)農(nóng)藥的使用會造成環(huán)境污染，同時給農(nóng)產(chǎn)品安全帶來嚴(yán)重影響?；诖?，農(nóng)業(yè)部于2015 年明確提出，至2020 年底我國農(nóng)藥使用量實(shí)現(xiàn)零增長的目標(biāo)。如何在保證農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的同時，又能減少農(nóng)藥施用量就成為當(dāng)前面臨的緊迫問題。而生物農(nóng)藥與化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配，篩選增效藥劑，減少化學(xué)藥劑的使用量，實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥減量控害，實(shí)施綠色防控，是解決該問題的有效途徑。本研究表明，Streptomyces parvus33 菌株發(fā)酵液干燥物對白粉病有較好的防治效果，并且與吡唑醚菌酯、吡唑萘菌胺混合后藥效提升明顯，可以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中示范推廣和應(yīng)用。

吡唑醚菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，通過阻止細(xì)胞色素合成中的電子傳遞而抑制病原菌線粒體的呼吸作用[16-18]；吡唑萘菌胺屬于琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑，吡唑萘菌胺含有吡唑和酰胺兩種高活性結(jié)構(gòu)基團(tuán)，而且“苯并降冰片烯環(huán)”結(jié)構(gòu)為其提供了獨(dú)特的“雙捆綁”特性，使得吡唑萘菌胺對病原菌線粒體上的琥珀酸脫氫酶有較強(qiáng)親和力，從而使其有較高的抑菌活性及較長的持效期[19]。吡唑醚菌酯和吡唑萘菌胺均具有保護(hù)和治療作用，對草莓白粉病有良好的防治效果。

采用2種活性成分復(fù)配，其活性和殺菌效果不是各組分活性的簡單疊加，與現(xiàn)有的單一制劑相比，除具有顯著的殺菌效果外，而且有比較顯著的增效作用，對作物安全性也具有很好的效果。

Streptomyces parvus33 菌株發(fā)酵液對蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、獼猴桃潰瘍病菌、青枯病菌抑菌圈直徑均超過15 mm，對番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌的菌絲生長抑制率均超過50%[16]。本研究測定了Streptomyces parvus33 菌株發(fā)酵液及其殺菌劑復(fù)配物對草莓白粉病的抑制作用，下一步將拓寬復(fù)配物的抑菌譜研究，并且將對Streptomyces parvus33 菌株發(fā)酵液中的具體抑菌成分及作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。