牛肉紅朱橘抗氧化生物合成關(guān)鍵基因的表達(dá)特征

李文云， 羅 懌， 王小柯， 柏自琴， 林 乾，李金強(qiáng)

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹科學(xué)研究所， 貴州 貴陽 550006)

0 引言

【研究意義】牛肉紅朱橘(CitrusreticulataBlanco.‘Niurouhong’)(簡寫為NRH)屬于蕓香科柑橘屬，來自于朱紅橘(C.reticulataBlanco.‘Zhuhongju’)(簡寫為ZHJ)的實(shí)生變異，果皮和果肉均為橘紅色，由于其艷麗的果色、濃郁的風(fēng)味和香味等品質(zhì)特征在當(dāng)?shù)毓肥袌鼍哂休^強(qiáng)的競爭力[1-2]，探索其抗氧化生物活性物質(zhì)成分形成機(jī)理對地方柑橘資源開發(fā)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】由于長期的自然選擇和人工馴化，柑橘種質(zhì)資源豐富且遺傳背景復(fù)雜，均存在一系列復(fù)雜的生物學(xué)調(diào)控，而這些調(diào)控往往由多基因控制，對控制果實(shí)品質(zhì)形成的單個(gè)基因或單條代謝路徑的表達(dá)分析已經(jīng)難以解釋其整體品質(zhì)變化機(jī)理，無法滿足對柑橘綜合品質(zhì)改良的要求，對整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)基因表達(dá)進(jìn)行綜合分析逐漸成為柑橘分子生物學(xué)研究的趨勢和熱點(diǎn)[3]。隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的高速發(fā)展及其特有的優(yōu)勢，轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)為研究復(fù)雜生物學(xué)通路和性狀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制提供了有力工具[4-5]。隨著測序技術(shù)以及生物信息學(xué)手段的進(jìn)一步發(fā)展和RNA-Seq測序及信息分析成本的降低，RNA-Seq已成為果樹學(xué)研究領(lǐng)域較成熟也較常規(guī)的分子手段之一，結(jié)合傳統(tǒng)的研究手段，將全面帶動(dòng)品種改良、栽培技術(shù)革新等，促進(jìn)果樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展[7]。前期從檢測的86種代謝組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，NRH富含類黃酮、類胡蘿卜素、揮發(fā)性香氣成分、檸檬苦素類似物等抗氧化生物活性物質(zhì)，且在代謝途徑間存在協(xié)同變化現(xiàn)象[6]。推測可能有共同的結(jié)構(gòu)基因或調(diào)控基因直接或間接參與這些產(chǎn)物的代謝過程，從而提升多項(xiàng)品質(zhì)性狀?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】然而，結(jié)構(gòu)基因或調(diào)控基因參與果實(shí)綜合品質(zhì)形成過程并不清晰，引起果實(shí)綜合品質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)協(xié)同變化的分子機(jī)理尚不清楚。因此，從整體轉(zhuǎn)錄水平上對品質(zhì)形成相關(guān)基因表達(dá)特征進(jìn)行進(jìn)一步探索，以全面篩選和鑒定果實(shí)綜合品質(zhì)形成相關(guān)基因?！緮M解決的關(guān)鍵問題】應(yīng)用RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息分析技術(shù)對NRH和ZHJ成熟果實(shí)進(jìn)行綜合評價(jià)，利用生物信息學(xué)方法，根據(jù)末端重復(fù)序列進(jìn)行組裝和拼接廣泛通用的基因庫，將獲得的unigene(非重復(fù)序列基因)與已知的注釋數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，按分子功能、細(xì)胞組分、參與的生物過程對這些基因進(jìn)行分類注釋，篩選差異基因抗氧化生物活性品質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)模式，探討NRH果色、濃郁風(fēng)味、香氣等品質(zhì)形成機(jī)理，揭示NRH品質(zhì)形成機(jī)理，為地方柑橘資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為牛肉紅朱橘(NRH)和朱紅橘(ZHJ)成熟果實(shí)，砧木均為枳，均采自貴州省惠水縣爛壩林場。肥料種類及施肥方式：采果后萌芽前每株10 kg有機(jī)肥和1 kg高氮復(fù)合肥混勻溝施；花期葉面噴0.3%的磷酸二氫鉀；果實(shí)膨大期每株有機(jī)肥10 kg和高鉀復(fù)合肥1kg混合溝施。

1.2 樣品采集

采樣時(shí)選擇健康無病蟲的3株樹，于樹冠外圍隨機(jī)采摘外觀、色澤、大小均勻的30個(gè)果實(shí)，帶回實(shí)驗(yàn)室用蒸餾水清洗果面。隨后將果實(shí)隨機(jī)分成3組，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每組10個(gè)果實(shí)，去皮后將果肉迅速用液氮速凍，置于-80℃超低溫冰箱保存待測。

1.3 總RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序

將2個(gè)樣品進(jìn)行RNA提取(RNAprep Pure Plant Plus Kit (Polysaccharides & Polyphenolics-rich)，利用分光光度計(jì)(NanoDrop ND-1000)檢測RNA濃度，利用Agilent 2100和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。利用Illumina的NEBNext?UltraTM RNA Library Prep Kit試劑盒進(jìn)行建庫。庫檢合格后利用Illumina NovaSeq 6000測序儀進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，每個(gè)品種進(jìn)行3次轉(zhuǎn)錄組重復(fù)測序，共獲得6個(gè)轉(zhuǎn)錄組測序樣本。

1.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)控

原始數(shù)據(jù)下機(jī)后需進(jìn)行過濾，去除帶接頭、低質(zhì)量和含N(無法確定堿基信息)的reads(序列數(shù)據(jù))后得到clean data(凈數(shù)據(jù))，后續(xù)的所有分析均是基于clean data進(jìn)行的高質(zhì)量分析。利用Trinity軟件對clean data進(jìn)行組裝得到Unigenes。

1.5 差異表達(dá)基因篩選及功能注釋

HISAT2 v2.0.5將配對末端clean reads與參照基因組比對，采用StringTie(1.3.3b)進(jìn)行新基因預(yù)測，featureCounts(1.5.0-p3)用于計(jì)算映射每個(gè)基因的讀數(shù)，基因表達(dá)量用FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)值衡量Unigenes的表達(dá)豐度。采用DESeq2進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，滿足|log2(FoldChange)|>0和padj<0.05表示差異顯著。

利用Cluster Profiler對差異基因集進(jìn)行GO(Gene Ontolog)功能富集分析，KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析等。

2 結(jié)果與分析

2.12種柑橘的RNA質(zhì)量

從表1可知，RNA完整性值為8.80～9.20，RNA質(zhì)量評價(jià)均為A，滿足建庫測序要求。

表1 2種柑橘RNA樣品的質(zhì)量和濃度

2.22種柑橘的測序數(shù)據(jù)

由表2可見，對NRH和ZHJ成熟果實(shí)測序后共產(chǎn)生(4.02～4.64)×107個(gè)原始數(shù)據(jù)片段，原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)后凈讀長數(shù)為(3.93～4.49)×107個(gè)，總凈核苷酸數(shù)為(5.89～6.73)×109個(gè)，Q20占比為97.88%～98.31%，Q30占比為93.72%～94.33%，GC占比為43.74%～44.29%。

表2 2種柑橘的測序數(shù)據(jù)

2.32種柑橘的差異表達(dá)基因

由圖1可見，NRH和ZHJ比較組在閾值為|log2(FoldChange)|>0和padj<0.05時(shí)，2個(gè)種質(zhì)共篩選1 282個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)833個(gè)，下調(diào)449個(gè)。

2.4 差異表達(dá)基因的GO聚類

GO聚類分析將padj<0.05作為顯著性閾值，根據(jù)生物過程(BP, Biological Process)細(xì)胞組成(CC, Cellular Component)和分子功能(MF, Molecular Function)進(jìn)行差異富集，由表3可見，僅在CC部分和MF部分富集到9個(gè)差異類別，共富集到差異基因279個(gè)，其中上調(diào)60個(gè)，下調(diào)219個(gè)。

注：數(shù)字表示差異基因數(shù)目。

表3 2種柑橘差異基因顯著富集的GO類別

在CC部分顯著富集4個(gè)類別，分別為核糖體(GO:0005840，上調(diào)差異基因2個(gè)，下調(diào)差異基因26個(gè))、核糖核蛋白復(fù)合體(GO:1990904，上調(diào)差異基因3個(gè)，下調(diào)差異基因26個(gè))、非膜細(xì)胞器(GO:0043228，上調(diào)差異基因6個(gè)，下調(diào)差異基因31個(gè))、細(xì)胞內(nèi)非膜細(xì)胞器(GO:0043232，上調(diào)差異基因6個(gè)，下調(diào)差異基因31個(gè))。

在MF部分顯著富集5個(gè)類別，分別為核糖體結(jié)構(gòu)(GO:0003735，上調(diào)差異基因2個(gè)，下調(diào)差異基因25個(gè))、結(jié)構(gòu)分子活性(GO:0005198，上調(diào)差異基因2個(gè)，下調(diào)差異基因25個(gè))、血紅素結(jié)合(GO:0020037，上調(diào)差異基因14個(gè)，下調(diào)差異基因19個(gè))、四吡咯結(jié)合(GO:0046906，上調(diào)差異基因14個(gè)，下調(diào)差異基因19個(gè))、鐵離子結(jié)合(GO:0005506，上調(diào)差異基因11個(gè)，下調(diào)差異基因17個(gè))。

2.5 KEGG顯著富集

由表4可見，KEGG顯著富集的前10個(gè)通路(富集基因數(shù)156個(gè)，其中54個(gè)上調(diào)，102個(gè)下調(diào))依次為核糖體(1個(gè)上調(diào)，39個(gè)下調(diào))、淀粉和蔗糖代謝(13個(gè)上調(diào)，9個(gè)下調(diào))、類胡蘿卜素生物合成(4個(gè)上調(diào)，3個(gè)下調(diào))、MAPK信號(hào)通路(1個(gè)上調(diào)，14個(gè)下調(diào))、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解(4個(gè)上調(diào)，5個(gè)下調(diào))、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(7個(gè)上調(diào)，16個(gè)下調(diào))、油菜素類固醇生物合成(2個(gè)上調(diào)，1個(gè)下調(diào))、抗壞血酸和醛酸代謝(1個(gè)上調(diào)，5個(gè)下調(diào))、氨基糖和核苷酸糖代謝(6個(gè)上調(diào)，7個(gè)下調(diào))、苯丙烷生物合成(13個(gè)上調(diào)，3個(gè)下調(diào))。

表4 KEGG顯著富集的前10個(gè)代謝通路

2.6 差異表達(dá)基因鑒定

通過進(jìn)一步KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，NRH抗氧化相關(guān)品質(zhì)形成主要涉及2個(gè)相關(guān)通路，即類胡蘿卜素生物合成和苯丙烷生物合成。2個(gè)通路共富集23個(gè)基因，相對親本ZHJ，17個(gè)基因(占73.91%)在NRH中表達(dá)量上調(diào)，6個(gè)基因(占26.09%)表達(dá)量下調(diào)。

2.6.1 類胡蘿卜素 KEGG富集分析表明(表5)，類胡蘿卜素生物合成通路有7個(gè)基因被富集，其中有4個(gè)基因相對親本ZHJ，在

表5 類胡蘿卜素生物合成通路富集到的差異基因

NRH成熟果實(shí)中表達(dá)量增加，有3個(gè)基因在NRH中表達(dá)量下降。

2.6.2 苯丙烷 KEGG富集分析表明(表6)，苯丙烷生物合成通路有16個(gè)基因被富集，其中有13個(gè)基因相對親本ZHJ，在NRH成熟果實(shí)中表達(dá)量增加，有3個(gè)基因在NRH中表達(dá)量下降。

表6 苯丙烷生物合成通路富集到的差異基因

3 討論

果實(shí)不僅是高等植物種子傳播和繁殖的重要器官，還是人類膳食結(jié)構(gòu)的重要組成部分。果實(shí)成熟是復(fù)雜并精密的協(xié)同調(diào)控過程，涉及物質(zhì)代謝、能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列生理生化過程的相互作用，由此共同促進(jìn)果形、色澤、大小、風(fēng)味和質(zhì)地等感官品質(zhì)和生化品質(zhì)的形成[8]。且相關(guān)的發(fā)育過程依賴于糖基轉(zhuǎn)移酶、氧化酶、水解酶、甲基轉(zhuǎn)移酶、羥化酶的作用[9]。該研究中，對紅肉突變體牛肉紅朱橘(NRH)和其親本朱紅橘(ZHJ)成熟果實(shí)差異基因富集分析與上述觀點(diǎn)相符。KEGG富集結(jié)果表明，差異表達(dá)基因主要富集類胡蘿卜素生物合成、苯丙烷生物合成、MAPK信號(hào)通路、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑，在琯溪蜜柚(Citrusmaxima)紅肉芽變株系果實(shí)的富集分析中也得到類似的結(jié)果[10]。

柑橘果實(shí)成熟后果色由肉眼可見的綠色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色、橙黃色、橙紅色或紅色，果實(shí)內(nèi)部發(fā)生類胡蘿卜素、花青苷和類黃酮等復(fù)雜代謝過程，這些果色主要與類胡蘿卜素和類黃酮兩大類色素積累密切相關(guān)[11]。柑橘果實(shí)類胡蘿卜素和類黃酮除賦予果實(shí)顏色外，還具有重要的抗氧化生物活性，其主要通過有淬滅單線態(tài)氧、消除自由基等方式作為抗氧化劑被廣泛應(yīng)用于食品和藥品行業(yè)[12-13]。柑橘果實(shí)顏色形成是復(fù)雜的過程，前期研究結(jié)果表明NRH橘紅色主要來源于類胡蘿卜素積累[3]。該研究鑒定出7個(gè)與類胡蘿卜素代謝相關(guān)的基因，其中類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(CCD，Carotenoid Cleavage Dioxygenase)、脫落酸8′-羥化酶(ABAH，Abscisic Acid 8′-Hydroxylase)和番茄紅素ε環(huán)化酶(LCYE，Lycopene Epsilon Cyclase)等在突變體NRH中表達(dá)量增加，9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素加氧酶(NCED,9-Cis-Epoxycarotenoid Dioxygenase)、β-胡蘿卜素羥化酶(CHYB，β-carotene hydroxylase)和脫落酸8′-羥化酶(ABAH，Abscisic Acid 8′-Hydroxylase)在NRH中表達(dá)量下降。這些差異基因大部分與類胡蘿卜素的降解存在密切聯(lián)系，如CCD是類胡蘿卜素裂解的關(guān)鍵酶，能夠降解玉米黃質(zhì)或β-隱黃質(zhì)，產(chǎn)生橙紅色色素[14-15]；NCED同屬于CCD基因家族，能夠降解ABA的前體物質(zhì)9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素，是ABA合成的關(guān)鍵酶[16-17]；ABAH屬于細(xì)胞色素氧化酶P450家族成員，是ABA氧化分解的關(guān)鍵酶，能夠負(fù)調(diào)控ABA的積累[18]。

苯丙烷生物合成途徑是柑橘次生代謝重要途徑，相關(guān)化合物除參與植物生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答外，還具有重要的生物活性，對人體健康發(fā)揮著重要作用。其始于苯丙氨酸，在苯丙氨酸脫氨酶PAL(Phenylalanin Ammonia-Lyase)、肉桂酸-4-羥基化酶(C4H，Cinnamate-4-hydroxylase)、4-香豆酰-Co A連接酶(4CL，4-coumarate CoA ligase)等作用下形成4-香豆酸輔酶A，隨后進(jìn)入類黃酮、花青素、木質(zhì)素等合成支路，并經(jīng)過糖基化、?；?、甲基化等修飾形成穩(wěn)態(tài)的形式存貯[19]。該研究中，苯丙烷生物合成途徑富集16個(gè)差異基因，其中高于80%基因上調(diào)表達(dá)，僅20%差異基因下調(diào)表達(dá)，且大部分差異基因?yàn)樘腔Ⅴ；?、甲基化修飾相關(guān)基因。如咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT，Caffeic Acid 3-O-Methyltransferase)是木質(zhì)素生物合成途徑重要的甲基轉(zhuǎn)移酶，能夠催化咖啡酸、5-羥基阿魏酸、5-羥基松柏醇分別形成阿魏酸、芥子酸和芥子醇[20]。在糖代謝過程中發(fā)揮重要作用的β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)，能夠水解β-D葡萄糖苷鍵并釋放相應(yīng)的配基[21]。

4 結(jié)論

利用RNA-Seq技術(shù)時(shí)牛肉紅朱橘其親本朱紅橘進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，鑒定出2條與抗氧化密切相關(guān)的代謝通路，即類胡蘿卜素(7個(gè)差異基因)和苯丙烷生物合成途徑(16個(gè)差異基因)，類胡蘿卜素和苯丙烷代謝均是復(fù)雜的生物過程，涉及結(jié)構(gòu)基因種類和數(shù)量繁多，同時(shí)還可能受到調(diào)控基因的作用，在兩者的互相協(xié)作下，形成協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同促進(jìn)NRH橘紅色色素形成。