載肝素鈉ACA微膠囊載藥量

龍瑞敏，王曦，藍(lán)琪，王士斌，2

（1.華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門 361021；2.華僑大學(xué) 生物材料與組織工程研究所，福建 廈門 361021）

載肝素鈉ACA微膠囊載藥量

龍瑞敏1，王曦1，藍(lán)琪1，王士斌1，2

（1.華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門 361021；2.華僑大學(xué) 生物材料與組織工程研究所，福建 廈門 361021）

采用乳化固化法制備粒徑為820nm的海藻酸鈣微球，同時(shí)采用兩步成囊的方法在微球表面包覆幾丁聚糖半透膜并制備海藻酸鈣／幾丁聚糖微膠囊.以肝素為模型藥物，考察微球溶脹與非溶脹、加藥濃度、載藥方式、幾丁聚糖相對(duì)分子質(zhì)量、成膜時(shí)間、成膜液濃度、幾丁聚糖改性物等因素對(duì)載藥的影響.研究結(jié)果表明：所制備的微膠囊載藥量最高可達(dá)77.4%.

海藻酸鈉；幾丁聚糖；微膠囊；肝素；載藥量

海藻酸鈉－殼聚糖－海藻酸鈉（ACA）微膠囊是目前研究較為廣泛的藥物緩、控釋制劑之一［1－2］，主要是因?yàn)槠洳捎昧颂烊坏脑逅猁}和幾丁聚糖材料.海藻酸鈉是從褐藻中提取的一類天然多糖，在生理?xiàng)l件下可與聚陽離子或兩性大分子電解質(zhì)交聯(lián)而形成聚電解質(zhì)復(fù)合囊材；幾丁聚糖是天然多糖中唯一的堿性多糖，來源豐富，無毒，易化學(xué)修飾，具有良好的生物相容性和可生物降解性.低分子肝素（LMWH）是一類抗血栓活性藥物，由肝素分解或降解得到的陰離子低聚物，臨床上主要用于血液透析的抗凝治療及防治各種血栓、栓塞等［3－4］.肝素作為抗凝血藥物的使用受到諸多限制，主要是其在體內(nèi)不穩(wěn)定及用藥時(shí)的副作用.將LMWH制成適用于靜脈注射或栓塞的緩釋型制劑，可保持肝素的活性，提高LMWH的療效，降低其毒副作用［5－6］.然而近年來，隨著人們對(duì)蛋白／多肽類藥物的緩、控釋制劑的研究表明，制備過程中存在穩(wěn)定性差、載藥量低，以及體內(nèi)外突釋效應(yīng)明顯等問題［7－8］，其中載藥量是涉及到實(shí)際應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo).為了制備載藥量理想的微膠囊，本課題組在前期研究中制備了載藥量高達(dá)64.8%的海藻酸鈣／聚組氨酸微膠囊［9］，以及載藥量為44.29%的海藻酸鈣／幾丁聚糖微膠囊［10］.影響載藥量的因素除了上述文獻(xiàn)報(bào)道的藥物的初始濃度、成膜材料的濃度與相對(duì)分子質(zhì)量之外，在其過程當(dāng)中的諸多因素也可能影響到載藥量的大小，如微球是否溶脹、載藥方式（靜／動(dòng)態(tài)）、成膜時(shí)間、膜材的選擇（幾丁聚糖改性物）等 .本文在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討各種因素對(duì)微膠囊載藥性能的影響，制備出粒徑較小、分布均勻、球形度好的高載藥海藻酸鈣／幾丁聚糖微膠囊.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1）試劑.幾丁聚糖（平均相對(duì)分子質(zhì)量為50 000，100 000，150 000，浙江金殼生物化學(xué)有限公司）；海藻酸鈉（化學(xué)純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；肝素鈉（≥150IU·mg－1，上?？笊锛夹g(shù)有限公司）；Span 80和Tween 80為化學(xué)純，其他試劑均為分析純（廣東汕頭市西隴化工廠）.

2）儀器.BS210S型電子分析天平（德國Sartorius公司）；SP－2102U型紫外可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；FDU－2100型冷凍干燥儀（日本東京理化器械株式會(huì)社）；Winner 2000型激光粒度分析儀（濟(jì)南微納儀器有限公司）；RW20DZM.n型數(shù)顯電動(dòng)攪拌機(jī)（德國IKA公司）；S－3500N型掃描電子顯微鏡（日本HITACHI公司）；LD4－2型低速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）.

1.2 海藻酸鈣微球的制備

分別取質(zhì)量濃度為10g·L－1的海藻酸鈉溶液和40g·L－1Span 80異辛烷溶液，混合后，于高速電動(dòng)攪拌機(jī)上以1 500r·min－1攪拌10min，形成油包水（W／O）型體系；然后加入一定量的Tween 80溶液，繼續(xù)攪拌乳化5min，于500r·min－1下緩慢滴加一定量的8.0%的氯化鈣溶液，再攪拌固化10 min，加入10mL無水乙醇靜置分層.以3 000r·min－1離心分離出海藻酸鈣微球，依次用體積分?jǐn)?shù)為40%，60%，80%，100%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，最后將所得微球置于37℃，－0.1MPa真空干燥箱中干燥過夜.

1.3 海藻酸鈣／幾丁聚糖載藥納米微膠囊的制備

取30mg干燥的空白海藻酸鈣微球，用蒸餾水溶脹30min后，分散懸浮于肝素鈉溶液中，載藥24 h；離心去上清液，加入10mL一定濃度的幾丁聚糖溶液，用漩渦振蕩儀振蕩成膜10min，接著離心去除上清液，再用pH值為7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌一次，于－20℃預(yù)凍；放入冷凍干燥機(jī)中凍干，24h后取出，即制得載藥納米微膠囊.

1.4 微球的性能

1.4.1 形態(tài)特征與粒徑分布 通過掃描電鏡觀察微球形貌，并以蒸餾水為流動(dòng)相，用激光粒度分析儀來測(cè)定微球的粒徑分布.

1.4.2 載藥量［11］稱取適量的載藥微膠囊，分散于20mL破囊液［12］中，待破囊后，用分光光度法在258.0nm檢測(cè)肝素鈉含量，每組數(shù)據(jù)取3個(gè)平行樣的平均值，計(jì)算微囊的載藥量.載藥量（Q）是指微球中所含藥物的量.

2 結(jié)果與討論

2.1 微球的形態(tài)與粒徑分布

采用優(yōu)化后的制備條件：海藻酸鈉質(zhì)量濃度為10g·L－1，氯化鈣質(zhì)量濃度為80g·L－1，親水親油平衡值（HLB）為6.0，乳化攪拌速度1 500r·min－1，乳化時(shí)間為15min，油水相比例為1∶1，固化攪拌速度為500r·min－1，固化時(shí)間為10min.所得到的微球的形態(tài)與粒徑分布，分別如圖1，2所示 .圖2中：φ為粒徑；F為分布比例 .由圖1，2可知：微球表面光滑、球形度好，微球分散性好，粒徑較小，粒徑集中分布在0.47～1.02μm，平均粒徑為0.82μm.

圖1 微球的SEM圖Fig.1 SEM picture of microspheres

圖2 微球的粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution of microspheres

2.2 微球溶脹與非溶脹對(duì)載藥量的影響

微球溶脹與非溶脹對(duì)載藥量（Q）的影響，如圖3所示.由圖3可以知道：溶脹微球的平均載藥量為50.8%，非溶脹的微球平均載藥量為27.5%，說明微球經(jīng)過溶脹后，載藥量明顯變大，載藥效果好.究其原因是由于微球溶脹后，海藻酸鈣凝膠珠網(wǎng)孔孔徑會(huì)變大，從而導(dǎo)致吸附載藥時(shí)，藥物容易擴(kuò)散進(jìn)去海藻酸鈣凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部，載入的絕對(duì)藥量增大，微囊載藥量相應(yīng)就變大；而未經(jīng)溶脹的微球，網(wǎng)孔的孔徑較小，吸附進(jìn)入海藻酸鈣微膠囊內(nèi)部的藥物相對(duì)較少，所以載藥量相對(duì)低.

2.3 初始載藥濃度對(duì)載藥量的影響

破囊法和上清液法在不同初始藥物濃度（c0）時(shí)對(duì)載藥量（Q）的影響，如圖4所示.由圖4可知：破囊法的結(jié)果要明顯高于上清液法.當(dāng)載藥液濃度分別為0.5，1.0，2.0mol·L－1時(shí)，破囊法的平均載藥量分別為40.1%，46.9%，47.6%.隨著肝素鈉濃度增大，載藥量增加.分析認(rèn)為，隨著投藥濃度的增大，單位體積內(nèi)含有的肝素鈉更多，同等情況下，擴(kuò)散進(jìn)入海藻酸鈣凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部載入的絕對(duì)藥量也會(huì)相應(yīng)增大.孫學(xué)戰(zhàn)等［10］研究了BSA載藥時(shí)的情況，取得了一致的結(jié)果，也進(jìn)一步證明了載藥時(shí)藥物主要依靠空白微球內(nèi)部與藥液之間存在的濃度梯度完成向微球內(nèi)部的擴(kuò)散，載藥濃度越大，這種濃度梯度就越大，越有利于藥物向微球內(nèi)部擴(kuò)散.

對(duì)比上清液法和破囊法兩種測(cè)微囊載藥量的方法，由于上清液法在載入肝素鈉的微球成膜前測(cè)吸光度值，同時(shí)由于上清液中可能摻雜部分微球成分造成干擾，使測(cè)定數(shù)值嚴(yán)重失真，因此破囊法更接近實(shí)際情況，也是各項(xiàng)測(cè)定中實(shí)際采用的方法.

圖3 微球溶脹與非溶脹對(duì)微囊載藥量的影響Fig.3 Influence of swelling／non－swelling on microcapsule drug－loading

圖4 載藥濃度對(duì)微囊載藥量的影響Fig.4 Influence of initial drug concentration on microcapsule drug－loading

2.4 載藥方式對(duì)載藥量的影響

載藥方式對(duì)載藥量（Q）的影響，如圖5所示.由圖5可知：在4℃冰箱、37℃水浴槽、37℃搖床載藥條件下，平均載藥量分別為35.1%，39.8%，47.2%.通過比較可以看出：在37℃搖床條件下，載藥量是最大的.這主要由于搖床狀態(tài)下的對(duì)流擴(kuò)散的物質(zhì)傳遞速率要大于靜止?fàn)顟B(tài)下的只有分子擴(kuò)散時(shí)的速率，而且隨溫度的升高，肝素鈉分子運(yùn)動(dòng)越激烈，所以37℃比4℃條件下的載藥量也要高些.

在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)：37℃水浴槽和37℃搖床條件下的微囊產(chǎn)量相對(duì)較少，這可能是由于在37℃時(shí)，溫度相對(duì)較高，微囊溶脹程度更大，海藻酸鈣與幾丁聚糖的交聯(lián)相對(duì)不穩(wěn)定，成膜后用PBS洗滌時(shí)，容易破碎，導(dǎo)致產(chǎn)量降低.穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)也表明：4℃時(shí)肝素鈉具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，利于后續(xù)的載藥及釋放.

圖5 載藥方式對(duì)微囊載藥量的影響Fig.5 Influence of drug－loading condition on microcapsule drug－loading

2.5 幾丁聚糖相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)載藥量的影響

幾丁聚糖相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）對(duì)載藥量（Q）的影響，如圖6所示.由圖6可以知道：當(dāng)幾丁聚糖相對(duì)分子質(zhì)量為50 000，100 000，150 000時(shí)，平均載藥量分別為52.4%，39.3%，20.8%.隨著幾丁聚糖相對(duì)分子質(zhì)量的增加，微囊的載藥量有所下降，顯示出低相對(duì)分子質(zhì)量的幾丁聚糖有相對(duì)較高的載藥量.可能的原因是，相對(duì)分子質(zhì)量較大的幾丁聚糖具有更多的結(jié)合位點(diǎn)，與海藻酸鈣結(jié)合而成的膜更致密，幾丁聚糖占據(jù)了海藻酸鈣膠珠較大的空間，而將藥物分子擠出；同時(shí)，幾丁聚糖相對(duì)分子質(zhì)量越大，微囊就越重，從而減少了藥物在微囊中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，導(dǎo)致載藥量的下降.Wang等［13］對(duì)聚精氨酸微膠囊的研究也表明：高分子膜材相對(duì)分子質(zhì)量越低，形成的微膠囊膜越厚，膨脹率也越大.這樣就擴(kuò)大了微膠囊的內(nèi)部空間，且載入的藥物也不易漏出，從而增大了藥物的載入量.

2.6 成膜時(shí)間對(duì)載藥量的影響

成膜時(shí)間（t）對(duì)載藥量（Q）的影響，如圖7所示.由圖7可知：成膜時(shí)間為5，10，15min時(shí)，平均載藥量分別為31.7%，48.2%，39.3%；隨成膜時(shí)間延長，平均載藥量有一個(gè)先增后減的趨勢(shì).由于載藥過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)成膜時(shí)間逐步增大到10min時(shí)，隨著成膜時(shí)間增加，幾丁聚糖與海藻酸鈣分子結(jié)合的膜更充分更緊密，使藥物肝素鈉不易擴(kuò)散出幾丁聚糖－海藻酸鈣膜，導(dǎo)致載藥量增大.當(dāng)成膜時(shí)間增大到15min時(shí)，由于幾丁聚糖與海藻酸鈣反應(yīng)已達(dá)平衡，藥物會(huì)因?yàn)閿U(kuò)散作用向外泄漏導(dǎo)致載藥量降低.劉源崗等［14］考察了成膜反應(yīng)時(shí)間與膜強(qiáng)度的關(guān)系，表明隨著成膜反應(yīng)時(shí)間的延長，膨脹率降低，膜強(qiáng)度提高，其中膨脹率的變化初期（≤10min）下降快，并隨著時(shí)間增長下降減慢.這一變化規(guī)律與文中結(jié)果也是基本一致的.

圖6 幾丁聚糖相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)微囊載藥量的影響Fig.6 Influence of chitosan molecular weight on microcapsule drug－loading

圖7 成膜時(shí)間對(duì)載藥量的影響Fig.7 Influence of membrane forming time on microcapsule drug－loading

2.7 幾丁聚糖濃度對(duì)載藥量的影響

幾丁聚糖濃度（c（幾丁聚糖））對(duì)載藥量（Q）的影響，如圖8所示.通過圖8可以看出：在幾丁聚糖濃度為0.1，0.2，0.5mol·L－1下，微囊的平均載藥量分別為43.6%，56.9%，77.4%；隨著幾丁聚糖濃度的增大，微膠囊的載藥量也隨之增大.究其原因可能是鈣離子與海藻酸鈉中的古羅糖醛酸殘基結(jié)合形成一種多孔性的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通常稱為“egg－box”結(jié)構(gòu)；而幾丁聚糖通過靜電作用可以在其表面復(fù)合形成聚電解質(zhì)半透膜，一方面增加了微球?qū)λ幬锏奈桨芰?，另一方面也限制了藥物向外擴(kuò)散，減少了藥物的損失從而提高了載藥量.此外，文獻(xiàn)［15］的研究也表明，微囊的載藥量隨著幾丁聚糖濃度增加而增加是有一定范圍的，超過這個(gè)濃度范圍，載藥量不僅不會(huì)增加，反而會(huì)有所下降.

2.8 改性幾丁聚糖對(duì)載藥量的影響

羧化幾丁聚糖、幾丁聚糖鹽酸鹽、固體類透明質(zhì)酸幾丁聚糖等3種改性幾丁聚糖對(duì)微膠囊載藥性能的影響，如圖9所示.由圖9可以看出：羧化幾丁聚糖、幾丁聚糖鹽酸鹽、固體類透明質(zhì)酸幾丁聚糖的平均載藥量分別為74.4%，17.9%，19.4%，表明羧化幾丁聚糖做為膜材時(shí)，載藥效果最好.

圖8 幾丁聚糖濃度對(duì)載藥量的影響Fig.8 Influence of chitosan concentration on microcapsule drug－loading

圖9 改性幾丁聚糖對(duì)載藥量的影響Fig.9 Influence of modified chitosan on microcapsule drug－loading

3 結(jié)束語

采用乳化固化法制備的海藻酸鈣微球，具有粒徑較小、分布均勻、球形度好的特點(diǎn) .采用兩步成囊的方法在微球表面包覆幾丁聚糖半透膜制備了海藻酸鈣／幾丁聚糖微膠囊，考察了不同因素對(duì)微膠囊載藥性能的影響，制備的微膠囊載藥量最高可達(dá)77.4%，為該型載體應(yīng)用于蛋白、多肽類藥物的緩／控釋的實(shí)際應(yīng)用提供了可參考的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

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Study of the Drug－Loading Property of Heparin－Loading ACA Microcapsules

LONG Rui－min1，WANG Xi1，LAN Qi1，WANG Shi－bin1，2

（1.College of Chemical Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，China；2.Institute of Biomaterials and Tissue Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，China）

Calcium alginate microspheres with mean diameter 820nm and calcium alginate／chitosan microcapsules were prepared by emulsion－curing.Using heparin as a model drug，the effects of the swelling condition，the different concentrations of heparin，the drug－loading condition，chitosan molecular weight，the membrane forming time，the different concentrations of chitosan and different modified chitosans on drug－loading were investigated.Results indicated that the maximum drug－loading was 77.4%.

alginate；chitosan；microcapsule；heparin；drug－loading

R 318

A

1000－5013（2012）03－0285－05

2011－09－29

龍瑞敏（1979－），女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事材料的開發(fā)與應(yīng)用的研究.E－mail：simplever＠126.com.

國家863計(jì)劃基金資助項(xiàng)目（2006AA02A118）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31000441）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目（JB－SJ1009；JB－JC1009）；華僑大學(xué)科研基金資助項(xiàng)目（10HZR10）

（責(zé)任編輯：錢筠 英文審校：劉源崗）