阿維巴坦聯(lián)合頭孢他啶、氨曲南或美羅培南對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的體外抗菌活性

于 夢，王玉潔，于清華，胡付品

(1. 青島市市立醫(yī)院檢驗科，山東 青島 266000；2. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所，上海 200040)

碳青霉烯類抗生素能夠有效抵抗革蘭陰性菌感染，并廣泛應(yīng)用于臨床，導(dǎo)致耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌(carbapenem-resistant Enterobacterales，CRE)，尤其是肺炎克雷伯菌的分離率呈快速上升趨勢。同時研究[1-2]顯示，CRE感染患者面臨臨床治療失敗率高、病死率高的困境，給臨床有效抗感染治療帶來巨大挑戰(zhàn)。美國疾病控制與預(yù)防中心(CDC)在2019年《抗生素耐藥性威脅報告》中指出，CRE是“最緊迫的威脅”之一。以上情況凸顯了新型抗生素在抗病原體感染方面的重要性。產(chǎn)碳青霉烯酶是包括肺炎克雷伯菌在內(nèi)的腸桿菌目細(xì)菌耐碳青霉烯類抗生素的最主要機(jī)制，而酶抑制劑在對抗產(chǎn)酶菌株中發(fā)揮著重要作用。阿維巴坦作為一種已投入臨床使用的新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，其自身雖無抗菌活性[3]，但能長效、可逆的結(jié)合A類[包括超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)和KPC酶(Klebsiellapneumoniaecarbapenemase)]、C類 (AmpC酶)和部分D類β-內(nèi)酰胺酶(如OXA-48)[4-6]，以此恢復(fù)與之聯(lián)合使用的β-內(nèi)酰胺類抗生素的抗菌活性。本研究探討頭孢他啶/阿維巴坦，氨曲南/阿維巴坦，美羅培南/阿維巴坦對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)的抗菌活性，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集青島市市立醫(yī)院2018—2020年臨床分離的CRKP菌株，剔除同一患者重復(fù)分離的菌株。

1.2 主要試劑及儀器 包括梅里埃VITEK MS全自動快速微生物質(zhì)譜檢測儀，梅里埃VITEK 2 Compact全自動藥敏分析儀，TAKARA普通PCR儀[TaKaRa(大連)生物工程有限公司]，美國伯樂Bio-rad PowerPac基礎(chǔ)電泳儀，美國伯樂Bio-Rad GelDoc XR 凝膠成像系統(tǒng)，Premix Tag[翌圣生物科技(上海)有限公司]。頭孢他啶(130484-201806)、氨曲南(130507-201303)、美羅培南(130506-201403)均購于自中國食品藥品檢定研究院，阿維巴坦(20160831-2)由正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供。

1.3 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗 采用梅里埃VITEK MS質(zhì)譜儀及梅里埃VITEK 2 Compact全自動藥敏分析儀分別進(jìn)行菌株鑒定及常規(guī)藥敏測定，依照2020年美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)M100對藥敏結(jié)果進(jìn)行判定，替加環(huán)素敏感性判定參考美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)推薦的標(biāo)準(zhǔn),最低抑菌濃度(MIC)≤2 μg/mL為敏感，MIC≥8 μg/mL為耐藥；氨曲南/阿維巴坦、美羅培南/阿維巴坦藥敏結(jié)果判斷分別參照氨曲南及美羅培南折點判定標(biāo)準(zhǔn)。銅綠假單胞菌ATCC 27853、大腸埃希菌ATCC 25922質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株均購自國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心。采用微量肉湯稀釋法測定頭孢他啶、頭孢他啶/阿維巴坦、氨曲南、氨曲南/阿維巴坦、美羅培南、美羅培南/阿維巴坦的MIC，阿維巴坦固定濃度為4 μg/mL。

1.4 耐藥基因檢測 采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法檢測所有受試菌5種常見碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaNDM、blaOXA、blaVIM、blaIMP)攜帶情況，陰性菌株首先按照2020年CLSI M100 ESBLs初篩實驗進(jìn)行表型篩查，若陽性則進(jìn)行ESBLs耐藥基因檢測，陰性者則進(jìn)行AmpC酶耐藥基因(blaMOX、blaCIT、blaDHA、blaACC、blaEBC、blaFOX)篩查，PCR引物及產(chǎn)物大小見表1。

表1 碳青霉烯類耐藥基因PCR引物及產(chǎn)物大小

1.5 MIC及最低殺菌濃度(MBC)測定 在96孔板上采用微量肉湯稀釋法對受試菌進(jìn)行相關(guān)抗菌藥物MIC檢測，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)的操作步驟及試驗方法制備受試菌菌懸液、抗菌藥物等。將保存菌株接種于MH營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)16～18 h，取適量單菌落配制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，采用雙倍CAMHB肉湯按照1∶100比例進(jìn)行稀釋。向96孔藥敏板中加入制備好的抗菌藥物，再將50 μL稀釋后菌懸液依次加入每孔，使頭孢他啶、氨曲南、美羅培南最終濃度范圍為0.06～128 μg/mL，頭孢他啶/阿維巴坦、氨曲南/阿維巴坦、美羅培南/阿維巴坦最終濃度范圍為0.03/4～64/4 μg/mL，同時每孔菌懸液的最終濃度為105CFU/mL。在頭孢他啶/阿維巴坦、氨曲南/阿維巴坦、美羅培南/阿維巴坦受試菌株的MIC基礎(chǔ)上，取100 μL肉眼未見細(xì)菌生長孔中的受試菌液均勻涂布于普通營養(yǎng)瓊脂平板，經(jīng)過夜孵育后計算相應(yīng)平板菌落數(shù)，若該平板上生長的菌落數(shù)<0.1%的初始接種菌量，則相應(yīng)肉湯孔中的藥物濃度為該抗菌藥物對受試菌的MBC。

1.6 統(tǒng)計分析 應(yīng)用WHONET 5.6分析細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥率。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 63株CRKP菌株標(biāo)本來源于痰28株(44.4%)，血18株(28.6%)，尿11株(17.5%)及其他類型標(biāo)本6株(9.5%，包括腹腔積液2株，支氣管肺泡灌洗液、膽汁、分泌物、穿刺液各1株)，從男性患者分離株多于女性患者(73.0% VS 27.0%)，老年人分離菌株占69.8%，重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)分離菌株占47.6%。見表2。

表2 63株CRKP菌株來源分布情況

2.2 藥敏結(jié)果 CRKP菌株對β-內(nèi)酰胺類抗生素(頭孢他啶、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南)，以及β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)合制劑(阿莫西林/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦)耐藥率均>95%，對喹諾酮類(環(huán)丙沙星、左氧氟沙星)以及單環(huán)β-內(nèi)酰胺類藥物氨曲南的耐藥率也>95%，對氨基糖苷類亦呈現(xiàn)出較高的耐藥率(61.9% ～74.6%)，對替加環(huán)素耐藥率較低(1.6%)，對頭孢他啶/阿維巴坦、美羅培南/阿維巴坦的耐藥率為3.2%～7.9%，未檢出對氨曲南/阿維巴坦耐藥的菌株。見表3。

表3 CRKP對抗菌藥物的藥敏結(jié)果

2.3 耐藥基因檢測結(jié)果 63株CRKP菌株中，57株(90.5%)檢出blaKPC-2基因 ，2株(3.2%)檢出blaNDM-1基因，各有1株(1.6%)檢出blaNDM-5、blaIMP-4、blaIMP-69基因，1株CRKP 5種常見碳青霉烯酶基因菌均未檢出，但檢出AmpC酶基因blaDHA。見圖1。

M：DNA Marker；陰：陰性對照；陽：KPC-2基因陽性對照；泳道1、3、5～8：臨床KPC-2基因陽性菌株；泳道4：臨床KPC-2基因陰性菌株。

2.4 MIC和MBC檢測結(jié)果 頭孢他啶/阿維巴坦對 57株攜帶blaKPC-2基因的CRKP株菌的 MIC50、MIC90分別為2/4、8/4 μg/mL，阿維巴坦可將頭孢他啶MIC50及MIC90均下降96.9%；氨曲南/阿維巴坦對其MIC50、MIC90分別為0.5/4、2/4 μg/mL，阿維巴坦可將氨曲南MIC50及MIC90分別下降99.8%、99.2%；美羅培南/阿維巴坦對其MIC50、MIC90分別為0.125/4、0.5/4 μg/mL，阿維巴坦可將美羅培南MIC50、MIC90分別下降99.8%、99.6%。5株表達(dá)金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBLs)基因的CRKP菌株，阿維巴坦未使頭孢他啶、美羅培南MIC90值有所下降，但阿維巴坦可使氨曲南MIC90下降達(dá)99.8%。頭孢他啶/阿維巴坦、氨曲南/阿維巴坦、美羅培南/阿維巴坦對63株CRKP株菌的MBC50、MBC90值與其相應(yīng)的MIC50、MIC90值相同。見表4。

表4 抗生素及其阿維巴坦復(fù)合制劑對攜帶不同基因CRKP菌株的MIC和MBC檢測結(jié)果(μg/mL)

3 討論

本組研究發(fā)現(xiàn)，57株攜帶blaKPC-2基因的CRKP株菌，阿維巴坦可將頭孢他啶、氨曲南和美羅培南對其MIC50及MIC90下降96.9%～99.8%；5株表達(dá)金屬酶的CRKP菌株，阿維巴坦未使頭孢他啶、美羅培南對其MIC90值有所下降，但阿維巴坦可使氨曲南對其MIC90值下降99.8%。

綜上所述，阿維巴坦聯(lián)合常見β-內(nèi)酰胺類抗生素(頭孢他啶、氨曲南或美羅培南)可有效抑制攜帶blaKPC-2基因的CRKP菌株，卻不能有效抑制MBLs基因陽性的CRKP菌株；與氨曲南聯(lián)合可有效抑制blaKPC基因陽性及MBLs基因陽性的CRKP菌株。本研究受試菌株數(shù)特別是表達(dá)金屬酶的菌株有限，可以擴(kuò)大受試菌株數(shù)及增加其他耐藥機(jī)制的菌株以獲取更多數(shù)據(jù)，為臨床抗CRKP感染治療提供更好的選擇。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。