草莓雜交品種及其親本遺傳背景的ISSR分析

張運(yùn)峰，武秋穎，張淑紅，高鳳菊，范永山，韓靖玲，劉海英

(1.唐山師范學(xué)院生命科學(xué)系，河北 唐山 063000；2.唐山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，河北 唐山 063000；3.唐山市植物病原真菌與毒素重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063000)

【研究意義】草莓(Fragaria×ananassaDuch.)果實(shí)味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，為世界七大水果之一[1]。20世紀(jì)初傳入中國(guó)后，草莓產(chǎn)量和種植面積均為世界第一，有“水果皇后”的美譽(yù)[2]。栽培草莓為異源八倍體多年生草本植物，遺傳背景非常復(fù)雜，遺傳育種工作相比于二倍體植物更加困難?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自20世紀(jì)80年代草莓育種方式由實(shí)生選種改為雜交育種以來[3]，草莓的遺傳背景研究越來越重要，因?yàn)檫z傳背景差異越大的親本，其雜種優(yōu)勢(shì)越強(qiáng)。但是，關(guān)于草莓遺傳背景的研究報(bào)道很少。常琳琳等[4]利用系譜法分析了1953—2016年我國(guó)培育的108個(gè)草莓品種的親本類型和來源，總結(jié)了草莓育種親本的選配規(guī)律。但是，由于草莓品種交叉引種、自育自繁等活動(dòng)頻繁，缺乏系譜資料或系譜資料不全、不準(zhǔn)確等現(xiàn)象非常普遍。分子標(biāo)記技術(shù)以基因組DNA序列的多態(tài)性為基礎(chǔ)，不受取材部位、發(fā)育時(shí)期和外界環(huán)境的干擾，對(duì)于遺傳背景復(fù)雜、倍性高的草莓研究中具有顯著優(yōu)勢(shì)。Sargentd等[5-7]研究表明，栽培草莓基因組的很多分子標(biāo)記都呈現(xiàn)二倍化分離，因此，分子標(biāo)記技術(shù)是解析栽培草莓復(fù)雜遺傳背景的有效途徑。ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)是一種在微衛(wèi)星基礎(chǔ)上發(fā)展的分子標(biāo)記，不具有較強(qiáng)的種特異性，揭示的多態(tài)性高，檢測(cè)非常方便[8]，已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性的研究中[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以12種具有不同遺傳背景的栽培草莓品種為研究對(duì)象，利用ISSR技術(shù)和多維尺度分析技術(shù)解析它們之間的親緣關(guān)系，為草莓品種鑒定、雜交種質(zhì)篩選提供技術(shù)基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】建立草莓ISSR擴(kuò)增的最適引物，探索基于ISSR試驗(yàn)數(shù)據(jù)的系統(tǒng)聚類分析與多維尺度分析技術(shù)相結(jié)合的綜合技術(shù)體系來準(zhǔn)確評(píng)估草莓的遺傳背景和親緣關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

草莓試驗(yàn)材料均采自唐山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院草莓種植基地。12份草莓材料中1份來自美國(guó)，1份來自西班牙，4份來自日本，6份來自中國(guó)。除了章姬脫毒苗的變異株唐研香以外，其它均為省級(jí)或國(guó)家級(jí)審定品種。12份試驗(yàn)材料中有9份遺傳背景清楚，其中5份材料(京桃香、粉紅公主、妙香一號(hào)、唐研香、紅顏)的親本來源于章姬，2份材料(佐賀清香、幸香)源于豐香，1份材料(紅袖添香)源于章姬和幸香雜交的F1代紅顏；其余3份材料的遺傳背景未知(表1)。

1.2 草莓試驗(yàn)材料的ISSR擴(kuò)增

采取草莓植株幼嫩的葉片，利用磁珠基因組DNA微量提取試劑盒(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)提取基因組DNA，利用Takara rTaqDNA聚合酶進(jìn)行ISSR擴(kuò)增：基因組DNA 50 ng，10×PCR buffer 2.0 μL，2.5 nmol/L dNTPs 1.5 μL，10 μmol/L引物2.0 μL，5 U/mL rTaqTM0.2 μL，ddH2O補(bǔ)充到20 μL；經(jīng)95 ℃預(yù)變性后進(jìn)行35個(gè)熱循環(huán)(94 ℃ 40 s，45～55 ℃ 70 s，72 ℃ 1 min)，最后72 ℃再延伸8 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠、3 V/cm電壓進(jìn)行電泳分離，利用Bio-Red凝膠成像系統(tǒng)采集電泳圖像。利用章姬、京桃香、粉紅公主、妙香一號(hào)、紅顏和唐研香等6個(gè)品種從100條ISSR引物中篩選出條帶清晰、多態(tài)性位點(diǎn)多、擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定的ISSR引物，摸索不同ISSR引物的最適退火溫度(Tm)，對(duì)全部試驗(yàn)材料進(jìn)行ISSR擴(kuò)增。

1.3 草莓試驗(yàn)材料的遺傳背景分析

ISSR-PCR產(chǎn)物在0.5倍TBE電泳緩沖液中以3 V/cm電壓、1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，Bio-Red凝膠成像系統(tǒng)采集電泳圖像。根據(jù)電泳圖譜記錄清晰可重復(fù)的電泳條帶，清晰且可重復(fù)的條帶記為“1”，無法辨認(rèn)且難以重復(fù)的條帶記為“0”，獲得“0-1”數(shù)據(jù)矩陣。利用NTSYS-pc version 2.02(Rohlf，1998)計(jì)算遺傳距離和Nei& Li 遺傳相似性系數(shù)，利用UPGMA(Unweighted Pair Group Method Using Arithmatic Average)方法進(jìn)行聚類分析；用IBM SPSS Statistics version 19.0.0軟件進(jìn)行多維尺度分析(Multidimensional scaling，MDS)。

表1 草莓種質(zhì)信息

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR引物篩選及最適Tm值摸索

利用章姬、京桃香、粉紅公主、妙香一號(hào)、紅顏和唐研香6個(gè)品種進(jìn)行最適ISSR引物篩選。結(jié)果表明，在100條ISSR引物中篩選出10條引物可獲得反應(yīng)穩(wěn)定、條帶清晰、多態(tài)性強(qiáng)的擴(kuò)增條帶(表1)。對(duì)這些引物進(jìn)行最適Tm值摸索，結(jié)果表明10條ISSR引物的最適Tm值差異較大，在47～54 ℃之間(表1)。隨著Tm值的增加，不同引物的擴(kuò)增條帶數(shù)量變化不同。例如，在45～55 ℃范圍內(nèi)，引物892在Tm值低于50 ℃時(shí)擴(kuò)增條帶數(shù)量隨著溫度的增加而增加，高于50 ℃時(shí)擴(kuò)增條帶數(shù)量逐漸減少，而引物811在Tm值為52.3 ℃時(shí)條帶數(shù)量達(dá)到最多后，再增加溫度，擴(kuò)增條帶數(shù)量無顯著改變(圖1)。

2.2 草莓試驗(yàn)材料的ISSR-PCR擴(kuò)增

利用篩選的ISSR引物和摸索的最適Tm值對(duì)12份草莓試驗(yàn)材料進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，10條引物均能在12個(gè)草莓品種中擴(kuò)增出清晰明亮的條帶，且條帶數(shù)目均在8條以上(表2，圖2)。試驗(yàn)共獲得標(biāo)記條帶116條，其中引物859和引物892的條帶數(shù)目超過了15條。試驗(yàn)共獲得多態(tài)性條帶80條，多態(tài)性比率為68.97%。除了引物857的條帶多態(tài)性比率(37.5%)較低以外，其它9個(gè)引物的多態(tài)性條帶比率均超過了50%，其中引物812和引物892超過了85%(表2)。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，10個(gè)引物形成的標(biāo)記可以很好的區(qū)分草莓品種。

2.3 草莓試驗(yàn)材料間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離

12份材料間的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.5690～0.8448，遺傳距離變化范圍為0.1456～0.4722。紅顏和白雪公主間的遺傳相似系數(shù)最高(0.8448)，甜查理和圣誕紅間的最低(0.5690)。章姬與其5份子代材料(京桃香、粉紅公主、妙香一號(hào)、唐研香、紅顏)的遺傳相似系數(shù)為0.6983～0.7951，變化范圍較小，說明遺傳背景比較相近。均來自于豐香親本的子代佐賀清香和幸香間的遺傳相似系數(shù)為0.7414；紅顏與其親本章姬和幸香，以及子代材料紅袖添香的遺傳相似系數(shù)分別為0.7931、0.7759和0.7241，遺傳背景非常相似(表3)。3個(gè)遺傳背景未知的試驗(yàn)材料中，甜查理和粉紅公主的遺傳相似系數(shù)最高(0.7500)，這與粉紅公主有美國(guó)遺傳背景非常一致(表1～3)；圣誕紅除了與唐研香的遺傳相似系數(shù)較高(0.7155)外，與其它所有試驗(yàn)材料的遺傳相似系數(shù)均較低，這與圣誕紅來自于西班牙，而其它試驗(yàn)材料中均沒有西班牙遺傳背景相一致；白雪公主與紅顏的遺傳相似系數(shù)最高，推測(cè)它可能是紅顏的子代或組培變異株。

1～5分別為44.2、47.5、50、52.3和54.4 ℃；M：DNA Marker-D1 to 5 are 44.2, 47.5, 50, 52.3 and 54.4 ℃；M is DNA Marker-D圖1 不同Tm值條件下ISSR引物892(A)和811(B)的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification results of ISSR primers 892 (A) and 811 (B) under different Tm values

表2 ISSR引物信息及擴(kuò)增結(jié)果

1.章姬；2.京桃香；3.粉紅公主；4.妙香一號(hào)；5.唐研香；6.紅顏；7.紅袖添香；8.佐賀清香；9.幸香；10.甜查理；11.圣誕紅；12.白雪公主；M.DNA marker D1.Akihime;2.Jingtaoxiang;3.Fenhonggongzhu;4.Miaoxiangyihao;5.Tangyanxiang;6.Benihoppe;7.Hongxiutianxiang;8.Sagahonoka;9.Sachinoka;10.Sweet Charli;11.Ssanta;12.Snow White;M.DNA marker D圖2 引物895(A)和851(B)的ISSR-PCR結(jié)果Fig.2 The ISSR-PCR results of primers 895(A) and 851(B)

計(jì)算遺傳背景明確的各試驗(yàn)材料之間的平均遺傳距離和平均遺傳相似系數(shù)，分析各雜交品種及其親本的遺傳傾向性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：親本之間平均遺傳距離0.3258，平均遺傳相似系數(shù)0.6551；親本與子代之間遺傳距離0.1950～0.3628(平均0.2607)，遺傳相似系數(shù)0.7241～0.7845(平均0.7478)；親本與

表3 12份草莓材料的遺傳相似系數(shù)(右上)和遺傳距離(左下)

表4 12份草莓材料的遺傳傾向性分析

組培變異株之間遺傳距離0.1981，遺傳相似系數(shù)0.7672。可見，親本之間、親本與子代之間和親本與組培變異株之間的遺傳距離遞減，而遺傳相似系數(shù)遞增，符合遺傳規(guī)律。以上研究結(jié)果表明，本試驗(yàn)篩選出的ISSR引物能夠較好地用于草莓種質(zhì)材料的遺傳背景分析。

2.4 草莓試驗(yàn)材料間的聚類分析

根據(jù)遺傳相似系數(shù)建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，利用NTSYS-pc軟件對(duì)聚類樹進(jìn)行Cophenetic相關(guān)性檢驗(yàn)，相關(guān)性系數(shù)為r=0.78174，說明聚類結(jié)果較好。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.70時(shí)，12份試驗(yàn)材料可分為美國(guó)材料甜查理(群I)、日本和中國(guó)材料(群II)和西班牙材料圣誕紅(群III)，說明中國(guó)的草莓品種的遺傳背景主要來自日本品種。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.75時(shí)，群II還可分為京桃香和佐賀清香(群II-1)，章姬、紅顏、白雪公主和唐研香(群II-2)，幸香(群II-3)，及粉紅公主、紅袖添香和妙香一號(hào)(群II-4)等4個(gè)亞群。在群II內(nèi)，群II-1和群II-4都是雜交子代，群II-2(除紅顏外)和群II-3都是親本或親本的組培變異株。紅顏與父本幸香沒有歸到同一亞群，而與母本章姬歸到同一亞群，說明紅顏在遺傳背景上更接近其母本章姬，并且也具有作為其它品種雜交親本的品質(zhì)。以上研究結(jié)果說明，利用本試驗(yàn)篩選的ISSR引物可應(yīng)用于雜交親本的篩選。

圖3 草莓試驗(yàn)材料的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of strawberry trial materials

2.5 多維尺度分析

基于Nei& Li 遺傳距離利用SPSS軟件進(jìn)行多維尺度分析(圖4)，stress = 0.09139，RSQ(stress and squared correlation)= 0.98504，說明多維尺度分析效果較好。從圖4可以看出，12個(gè)試驗(yàn)材料分布于I、II和III區(qū)。I區(qū)僅有紅袖添香，其雜交親本是美國(guó)品種卡姆羅莎(Camarosa)與日本品種豐香。II區(qū)可分為兩類，II-1為西班牙品種圣誕紅，II-2包括章姬、唐研香、京桃香、佐賀清香、紅顏和幸香共6個(gè)品種，其中中國(guó)品種唐研香、紅顏和京桃香的親本均為日本品種章姬，佐賀清香和幸香的親本都是日本品種豐香，并且紅顏是章姬和幸香的雜交F1代。III區(qū)也可分為兩類，III-1為美國(guó)品種甜查理，III-2包括中國(guó)品種粉紅公主、白雪公主和妙香一號(hào)，其中粉紅公主和妙香一號(hào)的親本均為日本品種章姬。還可以發(fā)現(xiàn)，II-2和III-2距離非常近，它們均為中國(guó)和日本的品種。以上研究結(jié)果與圖3相似，從另一角度表明本試驗(yàn)篩選的ISSR引物對(duì)于草莓品種的遺傳背景分析非常有效。

3 討 論

在植物遺傳多樣性分析過程中RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)的結(jié)果精度和穩(wěn)定性較差，AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)設(shè)計(jì)步驟復(fù)雜，SSR (simple sequence repeats，簡(jiǎn)單重復(fù)序列)種特異性較強(qiáng)，SNP(single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性)則依賴高通量測(cè)序和大數(shù)據(jù)庫(kù)。草莓遺傳背景分析主要用于篩選具有雜種優(yōu)勢(shì)的親本材料以及探索親本與雜交后代之間的親緣關(guān)系，檢測(cè)樣本多，檢測(cè)工作量大。因此，穩(wěn)定性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、多態(tài)性高、技術(shù)易掌握的分子標(biāo)記技術(shù)更適合草莓的遺傳背景分析。ISSR標(biāo)記結(jié)合了RAPD和SSR的優(yōu)點(diǎn)，具有DNA模板用量小、實(shí)驗(yàn)成本低、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)[14]，同時(shí)還兼具多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性高的優(yōu)良特性[15]，因此，本研究采用ISSR技術(shù)開展草莓的遺傳背景分析。

圖4 草莓試驗(yàn)材料的多維尺度分析Fig.4 Multidimensional scaling analysis of strawberry trial materials

利用ISSR標(biāo)記分析草莓種質(zhì)材料的遺傳背景，關(guān)鍵是找到適合的ISSR引物。本試驗(yàn)篩選出的10條ISSR引物，并獲得了擴(kuò)增條帶的多態(tài)性“0-1”數(shù)據(jù)，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)草莓各品種的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離的分析結(jié)果一致，系統(tǒng)聚類分析和多維尺度分析結(jié)果一致，親本之間、親本與雜交后代之間、親本與其組培變異株之間的遺傳距離、遺傳相似系數(shù)、聚類結(jié)果和多維尺度分析結(jié)果均較好地反映出了試驗(yàn)材料間的親緣關(guān)系。因此，遺傳距離、遺傳相似系數(shù)、系統(tǒng)聚類和多維尺度分析相結(jié)合，可以全面地分析草莓雜交品種及其親本的遺傳背景。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)未知遺傳背景的草莓品種白雪公主與紅顏和章姬親緣關(guān)系最近，推測(cè)白雪公主的親本材料里有紅顏和(或)章姬。ISSR分析結(jié)果顯示各草莓品種間平均相似系數(shù)較高，表明采集草莓品種間遺傳背景單一，且多數(shù)有日本草莓品種的遺傳背景，但是日本草莓品種的品質(zhì)較好，但一般抗病性較差[16]，這種現(xiàn)象如果不改變，不僅育成草莓新品種難有較大的突破，也增加了草莓抗病育種的難度。

4 結(jié) 論

草莓ISSR遺傳背景分析表明我國(guó)的草莓品種與美國(guó)、西班牙的品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與日本品種的親緣關(guān)系很近，且遺傳背景比較狹窄，品種之間的遺傳差異也較小。因此，拓寬草莓遺傳背景、增加草莓品種遺傳多樣性，將成為我國(guó)草莓生產(chǎn)、種質(zhì)資源創(chuàng)新和育種工作的重要任務(wù)。